鑒定anammox反應器污泥中的anammox菌是否利用有機物的方法
【專利摘要】鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，它涉及一種鑒定ANAMMOX反應器污泥中微生物是否利用有機物的方法。本發明提供一種不用富集高純度ANAMMOX菌，無需分離、鑒定、純化，不必純培養，便可以鑒定ANAMMOX反應器中污泥內的ANAMMOX菌是否可以利用有機物的方法。鑒定方法：一、用15N標記ANAMMOX反應器內的氨氮，用13C標記ANAMMOX反應器內的有機物，然后厭氧氨氧化反應；二、TEM觀察；三、制備導電樣品；四、根據NanoSIMS圖片進行得出結果。本發明應用于水處理及微生物領域。
【專利說明】鑒定ANA圖OX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種鑒定ANAMMOX反應器污泥中微生物是否利用有機物的方法。
【背景技術】
[0002]隨著全球工業化、城市化的發展，人口的快速增長，用水量大大增加，水資源的日益緊缺正威脅著人類的生存與發展。我國是嚴重缺水國家之一，淡水量僅占世界平均的1/4，并且已進入水資源危機初期，同時水源地域分布的不平衡，使淡水短缺矛盾更加突出。更為嚴峻的問題是我國水資源污染較嚴重，從一般污染物擴展到有毒有害污染物，已經形成了點源與面源共存，生活污染和工業排放疊加，各種新舊污染和二次污染相互復合的態勢。同時，城市人口的膨脹給有限的給水系統和排水設施造成巨大的壓力，污水處理設施總量不足，也導致一部分污水未經處理直接排放到自然水體中。因此，控制和治理我國水環境污染成為迫切需要解決的問題，除了需要控制污染，減少污染源外，更重要的是加快提高污水處理效率極其資源化程度。
[0003]根據《中國環境狀況公報》，2001年到2012年我國廢水排放總量逐年提高，從2001年的432.9億噸增加到684.6億噸(其中氨氮總排放量為253.6萬噸，工業排放量為26.4萬噸，生活排放量為144.7萬噸)，其中生活污水所占比例逐年提高。生活污水是城市污水的主要組成部分，而且是氨氮污染物的主要來源。含氮污染物會造成水體富營養化；影響給水源水水質，增加給水處理成本，而且化合態氮對人體和生物具有毒害作用。早在2003年，我國正式實施了《城鎮污水處理廠污染物排放標準》根據二級強化處理的技術水平，增加對總氮控制。2008年，國家環保部、國家質監總局先后出臺了 7個行業共計12個污染物排放標準。新標準新增了控制項目，分年限對各行業不同工藝制定了污染物控制項目和標準限值。水污染物也增加了總磷、總氮等基本項目。
[0004]隨著公眾環境意識的提高和國家對氮、磷排放限制標準的日趨嚴格，傳統污水生物處理工藝日益顯示出一些自身無法克服的缺點，例如流程長，基建費用高，操作麻煩；需要曝氣，能源消耗大；需要控制碳氮比，或投加額外碳源；釋放二氧化碳等等。因此，如何經濟并有效地去除污水中的含N、P的化合物，有效地保護受納水體，進而防治水體的富營養化，成為迫切需要解決的問題。
[0005]ANAMMOX (厭氧氨氧化)工藝是目前已知的最經濟的生物脫氮技術，與傳統的硝化反硝化技術相比，ANAMMOX工藝具有能耗低、不消耗有機碳、剩余污泥量小、不釋放CO2等優點，在生物脫氮領域具有廣泛的應用前景。
[0006]ANAMMOX菌是一種化能自養型細菌，以無機碳為碳源，之前認為不能利用有機碳。由于受無機物氧化產生能量不足的制約，ANAMMOX微生物存在生長緩慢、世代時間長、細胞得率低等諸多缺陷，導致細菌培養周期長，導致其實際應用效率被限制。
[0007]如能證明ANAMMOX菌可利用有機物，則可以通過人為調節水體中有機物的方式大大縮短ANAMMOX微生物的生長周期和世代，提高細胞得率和脫氮效果。但是研究ANAMMOX菌20余年，至今ANAMMOX污泥中的ANAMMOX微生物仍未獲得純培養，為生理生化研究造成了巨大的困難。雖經研究人員的不懈努力、采用多種方法截至2011年一共從厭氧氨氧化反應器污泥中分離、鑒定出了 8株ANAMMOX菌，但鑒定結果顯示這些ANAMMOX菌分屬于不同的種屬，而且分別出現在不同的ANAMMOX污泥中。由于ANAMMOX污泥的來源不同，組成ANAMMOX污泥的微生物也不同，所以不同ANAMMOX污泥的生理生化特點也不相同。盡管利用同位素示蹤技術已經證明已知的ANAMMOX菌中某些特定菌株可以利用有機物，但是依靠分離、鑒定的方式無法滿足對不同ANAMMOX污泥中ANAMMOX菌研究的需要。
[0008]另有研究人員通過富集的手段對ANAMMOX污泥中ANAMMOX菌的生理生化進行研究，但富集的微生物中還包含有非ANAMMOX菌，因此其實驗結果會受到非ANAMMOX菌的干擾，而且富集過程中也可能導致微生物種群發生變化，影響結果的準確性。
[0009]由于ANAMMOX菌沒有獲得純培養，所以ANAMMOX菌利用有機物的研究都是建立在反應器水平上的，作為一個混合培養體系，僅能證明有機物對ANAMMOX過程無影響，其結果均通過水體中物質的濃度變化分析間接得出的，不能為ANAMMOX菌利用有機物提供直接證據；而且無法獲知利用有機物的是富集物中的哪種或哪些微生物。即使對污泥中的ANAMMOX菌富集培養并采用現有的同位素示蹤技術，由于未能實現純培養，微生物中的干擾因素未能排除，其實驗結果仍然缺乏可信度和說服力。
【發明內容】
[0010]本發明要提供一種不用富集高純度ANAMMOX菌，無需分離、鑒定、純化，不必純培養，便可以鑒定ANAMMOX反應器中污泥內的ANAMMOX菌是否可以利用有機物的方法。
[0011]本發明鑒定方法按以下步驟進行:
[0012]一、用15N標記ANAMMOX反應器內的游離態氨，用13C標記ANAMMOX反應器內的有機物，然后厭氧氨氧化反應10~100小時，之后終止反應，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定`；
[0013]二、用步驟一微生物樣品制備透射電子顯微鏡樣品，然后進行TEM觀察；
[0014]三、根據步驟二 TEM觀察結果選擇目標微生物分布均勻的位置，利用切片機切片成半薄切片，放置于導電硅片上，經固定、烘干后再次噴金覆蓋，得到導電樣品；
[0015]四、利用納米二次離子質譜技術掃描步驟三制備的導電樣品中的標記元素，獲得NanoSIMS圖片；若15N標記富集的區域中有13C明顯富集，則該反應器內的ANAMMOX菌可以利用有機物；若15N標記富集的區域中沒有13C富集，則該反應器內的ANAMMOX菌不能利用有機物。
[0016]本發明方法為反應器內污泥中的ANAMMOX菌是否可以利用有機物提供了直接證據。本發明方法不改變微生物的生存環境，保證了 ANAMMOX微生物的原有種群和豐度，不受反應器的影響，并排除了非ANAMMOX菌的干擾，具有準確、可靠的特點；而且為ANAMMOX菌的后期研究和發展奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1是【具體實施方式】十一中利用納米二次離子質譜技術掃描15N的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區域為15N標記富集區域。[0018]圖2是【具體實施方式】十一中利用納米二次離子質譜技術掃描13C的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區域為13C標記富集區域。
[0019]圖3是【具體實施方式】十二中利用納米二次離子質譜技術掃描15N的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區域為15N標記富集區域。
[0020]圖4是【具體實施方式】十二中利用納米二次離子質譜技術掃描13C的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區域為13C標記富集區域。
[0021]圖5是【具體實施方式】十二中利用納米二次離子質譜技術掃描15N的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色區域為15N標記富集區域。
[0022]圖6是【具體實施方式】十二中利用納米二次離子質譜技術掃描13C的NanoSIMS圖片，圖片中淺亮色位點為13C標記物。
[0023]本發明技術方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0024]【具體實施方式】一:本實施方式鑒定方法按以下步驟進行:
[0025]一、用15N標記ANAMMOX反應器內的游離態氨(15NH4+_N)，用13C標記ANAMMOX反應器內的有機物，然后厭氧氨氧化反應10?100小時，之后終止反應，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定；
[0026]二、用步驟一微生物樣品制備透射電子顯微鏡樣品(TEM樣品)，然后進行TEM觀察；
[0027]三、根據步驟二 TEM觀察結果選擇目標微生物分布均勻的位置，利用切片機切片成半薄切片，放置于導電硅片上，經固定、烘干后再次噴金覆蓋，得到導電樣品；
[0028]四、利用納米二次離子質譜技術掃描步驟三制備的導電樣品中的標記元素，獲得NanoSIMS圖片；若15N標記富集的區域中有13C明顯富集，則該反應器內的ANAMMOX菌可以利用有機物；若15N標記富集的區域中沒有13C富集，則該反應器內的ANAMMOX菌不能利用有機物。
[0029]本實施方式方法同時利用兩種穩定性同位素進行示蹤和鑒定。ANAMMOX反應器污泥中能吸收利用游離態氨的無一例外均為ANAMMOX菌，因此NanoSIMS (納米二次離子質譜技術)圖片中15N標記富集的區域顯示為ANAMMOX菌；而ANAMMOX反應器內只有有機物含有13C,所以15N標記富集的區域中有13C明顯富集則直接證明ANAMMOX菌利用有機物。
[0030]本實施方式方法對任何來源的ANAMMOX反應器污泥都適用，不受其他因素的干擾，具有準確度高、結果直觀等優點。
[0031]用13C標記不同的有機物然后分組進行試驗，可以快速得出上述有機物是否被此ANAMMOX反應器內ANAMMOX菌利用的直接證據，大大縮短了試驗周期；而且相對于代謝產物的濃度分析，本實施方式方法的鑒定結果更準確和可信。
[0032]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一的不同點是:步驟二透射電子顯微鏡樣品按以下步驟制備:
[0033]A、從2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中取出樣品，然后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%鋨酸固定液固定2?3小時,而后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次,每次15分鐘；再在4°C條件下用梯度濃度為50%、70%、90%、95%的乙醇溶液對樣品依次進行脫水處理，每種濃度處理15分鐘；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分別脫水三次，每次15?20min，然后在室溫下放入濃度為100%的丙酮中脫水三次，每次15?20min ；
[0034]B、用純丙酮與包埋液的混合液對步驟A處理后的樣品室溫處理3?4小時，然后37°C下純包埋液包埋2?3小時、60°C固化5小時、再80°C固化24小時；
[0035]C、切片；
[0036]D、用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色切片，即完成透射電子顯微鏡樣品；
[0037]步驟A中乙醇丙酮混合液由濃度為90%的乙醇和濃度為90%的丙酮按1:1的體積比混合而成；
[0038]步驟B純丙酮與包埋液的混合液中純丙酮與包埋液的體積比為2:1。其它步驟及參數與實施方式一相同。
[0039]鋨酸固定液又稱為四氧化鋨固定液。
[0040]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】二的不同點是:步驟C中切片厚度為50?60nm。其它步驟及參數與實施方式二相同。
[0041]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】二或三的不同點是:步驟三中半薄切片的厚度為500?lOOOnm。其它步驟及參數與實施方式二或三相同。
[0042]【具體實施方式】五:本實施方式與【具體實施方式】二至四之一的不同點是:步驟三中導電硅片為噴金的玻璃片。其它步驟及參數與實施方式二至四之一相同。
[0043]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】二至五之一的不同點是:步驟三中噴金覆蓋厚度為8?12nm。其它步驟及參數與實施方式二至五之一相同。
[0044]【具體實施方式】七:本實施方式與【具體實施方式】一至六之一的不同點是:步驟一中厭氧氨氧化反應時間為10?50小時。其它步驟及參數與實施方式一至六之一相同。
[0045]【具體實施方式】八:本實施方式與【具體實施方式】一至七之一的不同點是:步驟一中厭氧氨氧化反應時間為15?30小時。其它步驟及參數與實施方式一至七之一相同。
[0046]【具體實施方式】九:本實施方式與【具體實施方式】一至八之一的不同點是:步驟一中厭氧氨氧化反應時間為20小時。其它步驟及參數與實施方式一至八之一相同。
[0047]【具體實施方式】十:本實施方式與【具體實施方式】一至九之一的不同點是其特征在于步驟一中用13C標記的有機物為甲酸、乙酸、丙酸、丙酮、苯或其衍生物。其它步驟及參數與實施方式一至九之一相同。
[0048]【具體實施方式】十一:哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室運行的ANAMMOX反應器內的ANAMMOX菌是否可利用有機物按以下步驟進行鑒定:
[0049]一、用15N標記ANAMMOX反應器內的氨氮(15NH4+-N，購自美國劍橋同位素實驗室CIL)，用13C標記ANAMMOX反應器內的醋酸根(CH313C00_)，然后厭氧氨氧化反應20小時，之后終止反應，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定；
[0050]二、用步驟一微生物樣品制備透射電子顯微鏡樣品(TEM樣品)，然后進行TEM觀察；
[0051]三、根據步驟二 TEM觀察結果選擇目標微生物分布均勻的位置，利用切片機切片成半薄切片，放置于導電硅片上，經固定、烘干后再次噴金覆蓋，得到導電樣品；
[0052]四、利用納米二次離子質譜技術掃描步驟三制備的導電樣品中的標記元素，獲得NanoSIMS圖片；若15N標記富集的區域中有13C明顯富集，則該反應器內的ANAMMOX菌可以利用有機物；若15N標記富集的區域中沒有13C富集，則該反應器內的ANAMMOX菌不能利用有機物；
[0053]其中，步驟三中半薄切片的厚度為800nm;
[0054]步驟三中導電硅片為噴金的玻璃片；
[0055]步驟三中噴金覆蓋厚度為IOnm ；
[0056]步驟二透射電子顯微鏡樣品按以下步驟制備:
[0057]A、從2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中取出樣品，然后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%鋨酸固定液固定2.5小時，而后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，每次15分鐘；再在4°C條件下用梯度濃度為50%、70%、90%、95%的乙醇溶液對樣品依次進行脫水處理，每種濃度處理15分鐘；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分別脫水三次，每次15~20min，然后在室溫下放入濃度為100%的丙酮中脫水三次，每次15~20min ；
[0058]B、用純丙酮與包埋液的混合液對步驟A處理后的樣品室溫處理3.5小時，然后37°C下純包埋液包埋2.5小時、60°C固化5小時、再80°C固化24小時；
[0059]C、切片；
[0060]D、用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色切片，即完成透射電子顯微鏡樣品；
[0061 ] 步驟A中乙醇丙酮混合液由濃度為90%的乙醇和濃度為90%的丙酮按1:1的體積比混合而成；
[0062]步驟B純丙酮與包埋液 的混合液中純丙酮與包埋液的體積比為2:1;
[0063]其中步驟C中切片厚度為50nm。
[0064]本實施方式的NanoSMS圖片如圖1和圖2所示，根據圖1和圖2對比可以直觀清楚的看到在15N富集區域中有13C明顯富集，且富集量有所不同，說明13C被ANAMMOX菌細胞吸收,表明本實施方式反應器內的ANAMMOX菌可以利用有機物——醋酸。
[0065]【具體實施方式】十二:本實施方式與【具體實施方式】十一的不同點是:
[0066]一、用15N標記ANAMMOX反應器內的氨氮(15NH4+-N，購自美國劍橋同位素實驗室CIL)，用13C標記ANAMMOX反應器內的丙酸根(CH3CH213COO^購自美國劍橋同位素實驗室CIL)，然后厭氧氨氧化反應25小時，之后終止反應，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定；
[0067]其中步驟二 C中切片厚度為55nm。
[0068]本實施方式的NanoSMS圖片如圖3和圖4所示，根據圖3和圖4對比可以直觀清楚的看到在15N富集區域中有13C明顯富集，且富集量有所不同，說明13C被ANAMMOX菌細胞吸收,表明本實施方式反應器內的ANAMMOX菌可以利用有機物——丙酸。
[0069]【具體實施方式】十三:本實施方式與【具體實施方式】十一的不同點是:
[0070]一、用15N標記ANAMMOX反應器內的氨氮(15NH4+-N，購自美國劍橋同位素實驗室CIL)，用13C標記ANAMMOX反應器內的無機碳源(H13C03_，購自美國劍橋同位素實驗室CIL)，然后厭氧氨氧化反應20小時，之后終止反應，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定；
[0071]其中步驟二 C中切片厚度為60nm。
[0072]本實施方式的NanoSMS圖片如圖5和圖6所示，根據圖5和圖6對比可以直觀清楚的看到在15N富集區域中沒有形成比較明顯的13C富集，說明本實施方式反應器內的ANAMMOX菌通過厭氧乙酰輔酶A途徑固定二氧化碳，固碳速率較低。
[0073]通過具體實施十一至十三可以直接證明哈爾濱工業大學城市水資源與水環境國家重點實驗室運行的ANAMMOX反應器內的ANAMMOX菌具有異養特性，可以利用有機物CH313COCT 與 CH3CH213COO'
【權利要求】
1.鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ΑΝΑΜΜ0Χ菌是否利用有機物的方法，其特征在于鑒定方法按以下步驟進行: 一、用15N標記ANAMMOX反應器內的游離態氨，用13C標記ANAMMOX反應器內的有機物，然后厭氧氨氧化反應10~100小時，之后終止反應，離心分離獲得微生物樣品，將微生物樣品放置于2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中固定； 二、用步驟一微生物樣品制備透射電子顯微鏡樣品，然后進行TEM觀察； 三、根據步驟二TEM觀察結果選擇目標微生物分布均勻的位置，利用切片機切片成半薄切片，放置于導電硅片上，經固定、烘干后再次噴金覆蓋，得到導電樣品； 四、利用納米二次離子質譜技術掃描步驟三制備的導電樣品中的標記元素，獲得NanoSIMS圖片；若15N標記富集的區域中有13C明顯富集，則該反應器內的ANAMMOX菌可以利用有機物；若15N標記富集的區域中沒有13C富集，則該反應器內的ANAMMOX菌不能利用有機物。
2.根據權利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，其特征在于步驟二透射電子顯微鏡樣品按以下步驟制備: A、從2.5%戊二醛磷酸鹽緩沖液中取出樣品，然后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次，再用1%鋨酸固定液固定2~3小時,而后用0.lmol/L磷酸漂洗液漂洗三次,每次15分鐘；再在4°C條件下用梯度濃度為50%、70%、90%、95%的乙醇溶液對樣品依次進行脫水處理，每種濃度處理15分鐘；之后再用乙醇丙酮混合液和90%的丙酮溶液分別脫水三次，每次15~20min，然后在室溫下放入濃度為100%的丙酮中脫水三次，每次15~20min ； B、用純丙酮與包埋液的混`合液對步驟A處理后的樣品室溫處理3~4小時，然后37°C下純包埋液包埋2~3小時、60°C固化5小時、再80°C固化24小時； C、切片； D、用3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色切片，即完成透射電子顯微鏡樣品； 步驟A中乙醇丙酮混合液由濃度為90%的乙醇和濃度為90%的丙酮按1:1的體積比混合而成； 步驟B純丙酮與包埋液的混合液中純丙酮與包埋液的體積比為2:1。
3.根據權利要求2所述的鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，其特征在于步驟C中切片厚度為50~60nm。
4.根據權利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，其特征在于步驟三中半薄切片的厚度為500~lOOOnrn。
5.根據權利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，其特征在于步驟三中導電硅片為噴金的玻璃片。
6.根據權利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，其特征在于步驟三中噴金覆蓋厚度為8~12nm。
7.根據權利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，其特征在于步驟一中厭氧氨氧化反應時間為10~50小時。
8.根據權利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，其特征在于步驟一中厭氧氨氧化反應時間為15~30小時。
9.根據權利要求1所述的鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，其特征在于步驟一中厭氧氨氧化反應時間為20小時。
10.根據權利 要求1所述的鑒定ANAMMOX反應器污泥中的ANAMMOX菌是否利用有機物的方法，其特征在于步驟一中用13C標記的有機物為甲酸、乙酸、丙酸、丙酮、苯或其衍生物。
【文檔編號】G01N1/28GK103822963SQ201410101312
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年3月19日 優先權日:2014年3月19日
【發明者】高大文, 黃曉麗, 叢巖 申請人:哈爾濱工業大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
