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紙基微流控免疫傳感器芯片和現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種紙基微流控免疫傳感器芯片和現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺。所述紙基微流控免疫傳感器芯片，在紙基上構(gòu)建微流控通道，對通道內(nèi)反應(yīng)區(qū)進行表面改性處理，使之與抗體進行化學(xué)交聯(lián)，將抗體固定于紙基表面。芯片的洗滌需結(jié)合環(huán)爐進行，用環(huán)圈溫度來控制洗滌和流速，解決了國內(nèi)外現(xiàn)有的紙基微流控芯片在洗滌和流速控制上的問題。通過使用手機拍照、掃描采集圖像或激光誘導(dǎo)熒光的方式，檢測與抗原特異性結(jié)合的另一以介孔二氧化硅或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子為基質(zhì)的集群標記物標記的抗體，從而檢測出待測抗原的含量。本發(fā)明所述的紙基微流控免疫傳感器芯片顯著提高了檢測的靈敏度。
【專利說明】紙基微流控免疫傳感器芯片和現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測分析領(lǐng)域，具體地，涉及一種紙基微流控免疫傳感器芯片和現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)場及時檢測(Point-of-care-testing, P0CT)是近年來醫(yī)學(xué)檢驗的一個新概念。該檢測平臺可以減少病人進入醫(yī)院就診的次數(shù)，減小醫(yī)院的壓力，降低病人的就醫(yī)成本和減小醫(yī)療保險的成本，增加病人的滿意度。POCT的建立對于發(fā)展中國家尤其重要，生活在這些國家的人民或缺少醫(yī)療基礎(chǔ)資源，或者負擔(dān)不起昂貴的醫(yī)療測試費用。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的建議，對發(fā)展中國家，醫(yī)療診斷設(shè)備應(yīng)該具有ASSURED，即不貴的(Affordable)，靈敏的(Sensitive),特效的(Specific),使用者友好的(User-friendly),快速的(Rapid),耐用的(Robust)和可以免費供給用戶使用。為了構(gòu)建POCT系統(tǒng)，具有生物活性紙(Bioactive paper)所搭建起來的分析檢測平臺走進了人們的生活。
[0003]中國人口眾多、醫(yī)療資源差異較大，是POCT潛在的巨大市場。據(jù)估計中國POCT市場年增速35%以上。但目前中國POCT市場尚處于初始階段，國內(nèi)企業(yè)剛開始涉足這些【技術(shù)領(lǐng)域】，行業(yè)的自主創(chuàng)新能力仍然低下、擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品缺乏，多為仿制，整體市場相當(dāng)于歐美國家八九十年代水平，遠遠不能滿足潛在的市場需求。還需集國內(nèi)頂尖的學(xué)科技術(shù)優(yōu)勢共同協(xié)作攻關(guān)，科技跨界聯(lián)合創(chuàng)新，優(yōu)勢互補，形成合力研發(fā)新型產(chǎn)品。
[0004]2007年美國哈佛大學(xué)的George M.Whitesides小組提出了一種名為微流控紙基分析裝置(Microfluidic paper based analytical devoces, μ PADs)的診斷系統(tǒng)，代表紙條試驗裝置的新一代選擇，為ASSURED設(shè)計了一個新的診斷平臺，他們以同時測定體液中葡萄糖和蛋白質(zhì)的紙質(zhì)微流控免疫傳感器芯片為模型，對這一新的檢測系統(tǒng)進行了闡述。
[0005]中國專利申請CN201110270213.2中給出的微流控紙芯片僅能進行定性檢測。
[0006]中國專利申請CN201210472330.1中給出的高通量微流控紙芯片設(shè)置絲網(wǎng)印刷電極、采用電化學(xué)信號對抗原進行檢測。
[0007]中國專利申請CN201210577222.0中給出的多通道微流控化學(xué)發(fā)光紙芯片采用化學(xué)發(fā)光信號對抗原進行檢測，且對該芯片進行塑封處理。
[0008]中國專利申請CN201210577821.2中給出的微流控芯片設(shè)置絲網(wǎng)印刷電極、采用電化學(xué)信號進行檢測。
[0009]中國專利申請CN201310011320.2中給出的微流控芯片設(shè)置有雙極電極、通過電化學(xué)進行檢測。
[0010]中國專利申請CN201310398596.0中給出的微流控芯片設(shè)置有絲網(wǎng)印刷電極、通過電化學(xué)進行檢測。
[0011]中國專利申請CN201310349414.0中給出的微流控芯片由紙基芯片和紙基底片復(fù)合而成，且所述紙基芯片和紙基底片用液態(tài)膠處理。
[0012]中國專利申請CN201320069523.2中給出的三維微流控芯片通過多層紙片重疊制備。
[0013]目前商品生產(chǎn)的快速檢測手段主要是一些測試紙條，如血糖試紙、早孕試紙、乳酸試紙、尿酸試紙、濫用藥物試紙、病原體檢測試紙，農(nóng)藥檢測試紙，生物標志物試紙等。免疫分析試紙也有商品生產(chǎn)，最典型的是基于免疫色譜原理，使用HRP (辣根過氧化物酶)作為標記物和使用膠體金作為標記物的免疫分析試紙。而這些傳統(tǒng)的測試紙條，主要使用的檢測方法是目視比色，不需要任何檢測儀器，方便快捷，但是缺點是靈敏度比較低，僅僅適用于一般項目測試，很難滿足許多免疫分析的要求。
[0014]免疫分析是一種高特異性的生物分析技術(shù)，它在各種低含量病原體抗原和抗體、激素、蛋白質(zhì)，及各種半抗原，如藥物、農(nóng)藥等的分析方面發(fā)揮了重要作用，已經(jīng)成為臨床檢驗和食品安全檢測的重要手段。
[0015]以酶作為標記物并以酶催化顯色反應(yīng)為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫分析(ELISA)和以酶催化化學(xué)發(fā)光反應(yīng)為基礎(chǔ)的化學(xué)發(fā)光免疫分析(CLIA)以及用熒光物質(zhì)作為標記物的熒光免疫分析(FIA)，已經(jīng)成為當(dāng)前免疫分析的主流方法。酶聯(lián)免疫分析的靈敏度取決于酶催化顯色反應(yīng)的靈敏度，通常一個抗體只能結(jié)合一個辣根過氧化物酶(HRP)的分子，測定靈敏度較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測靈敏度高的紙基微流控免疫傳感器
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[0017]此外，本發(fā)明還提供一種包含上述紙基微流控免疫傳感器芯片的現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺。
[0018]本發(fā)明解決上述問題所采用的技術(shù)方案是:提供一種紙基微流控免疫傳感器芯片，包括紙基、在所述紙基上構(gòu)建的微流控通道，以及設(shè)在該微流控通道內(nèi)的集群標記物標記的抗體，所述集群標記物的標記載體為介孔二氧化硅納米粒子或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子，該紙基微流控免疫傳感器芯片主要由以下制備方法制得:
構(gòu)建微流控通道步驟:在紙基上構(gòu)建微流控通道，所述微流控通道由疏水屏障及親水通道構(gòu)成，所述親水通道包括用于發(fā)生免疫反應(yīng)的反應(yīng)區(qū)；
反應(yīng)區(qū)表面改性處理步驟:所述反應(yīng)區(qū)內(nèi)紙基經(jīng)過表面改性處理，使所述紙基表面帶有醒基；
添加包被抗體步驟:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入待檢測抗原對應(yīng)的包被抗體，包被抗體與表面帶有醛基的紙基交聯(lián)固定；
封閉步驟:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入封閉劑，用于封閉紙基上未結(jié)合抗體的活性部位；
添加抗原步驟:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入待檢測抗原；
集群標記物標記抗體制備步驟:對標記載體進行表面改性，使任一標記載體能夠結(jié)合若干的標記物，所述標記載體為介孔二氧化硅納米粒子或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子，添加與待檢測抗原一一對應(yīng)的抗體，使任一抗體與以介孔二氧化硅或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子為基質(zhì)的集群標記物結(jié)合；
添加標記抗體步驟:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入以介孔二氧化硅或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子為基質(zhì)的集群標記物標記的抗體；所述標記抗體與包被抗體分別與待檢測抗原上的抗原決定簇結(jié)合，形成包被抗體-抗原-標記抗體免疫復(fù)合物。
[0019]近年來，由于紙基芯片的提出，免疫分析得到廣泛地應(yīng)用，在免疫分析中，通常一個抗體結(jié)合一個標記物，其測定靈敏度較低；且在紙上構(gòu)建微流控通道，靠紙的毛細管作用進行液體的輸送，不需要其它的動力設(shè)備、高壓電源以及注射泵等，但是液體的輸送速率難于控制，不能將難于洗滌的物質(zhì)從反應(yīng)區(qū)洗去，進而影響檢測的靈敏度。
[0020]本發(fā)明對反應(yīng)區(qū)內(nèi)的紙基表面改性，使其帶有醛基，易與包被抗體進行良好的化學(xué)交聯(lián)，利于包被抗體的固定，并且采用以介孔二氧化硅或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子為基質(zhì)的集群標記物來標記抗體，能夠明顯提高所述芯片的檢測靈敏度，試劑及樣品的消耗少，能實現(xiàn)亞微升甚至納升的試劑及樣品的消耗。
[0021]環(huán)爐技術(shù)是一種微量分析技術(shù)。環(huán)爐的主體是放在架子上的一塊厚壁金屬圓筒，外側(cè)繞電熱絲加熱爐體。爐孔正上方是一支裝洗滌劑用的毛細移液管。
[0022]現(xiàn)有技術(shù)中通常使用環(huán)爐將濾紙上的待檢測組分沖洗至爐孔邊緣，主要用于金屬離子富集，具體為:先用一支毛細移液管在濾紙圓心加1-3微升試樣溶液，調(diào)節(jié)爐溫至稍高于洗滌劑的沸點，然后用濾紙上方的毛細移液管將洗滌劑加到濾紙中心，當(dāng)毛細移液管尖端接觸芯片時，試樣中的可溶性組分隨同洗滌劑向外擴散，當(dāng)擴散到爐孔邊緣時，洗滌劑蒸發(fā)，留下可溶性組分。這樣連續(xù)沖洗，直到可溶性組分全被濃集到爐孔邊緣，形成一個窄環(huán)，然后用試劑顯色檢測或者是發(fā)光檢測。
[0023]本發(fā)明中將所述環(huán)爐應(yīng)用于含有非封閉型反應(yīng)區(qū)的紙基微流控免疫傳感器芯片，且在所述反應(yīng)區(qū)表面改性處理步驟、添加包被抗體步驟、添加抗原步驟以及添加標記抗體步驟中將紙基微流控免疫傳感器芯片放置于所述環(huán)爐上，洗滌未反應(yīng)的試劑。
[0024]具體地，所述反應(yīng)區(qū)表面改性處理步驟可以為:所述反應(yīng)區(qū)內(nèi)紙基經(jīng)過表面改性處理，使所述紙基表面帶有醛基，反應(yīng)后將所述芯片放置于所述環(huán)爐上，洗滌所述反應(yīng)區(qū)內(nèi)未反應(yīng)的試劑。
[0025]所述添加包被抗體步驟具體地可以為:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入待檢測抗原對應(yīng)的包被抗體，包被抗體與表面帶有醛基的紙基交聯(lián)固定，反應(yīng)后將所述芯片放置于所述環(huán)爐上，洗滌所述反應(yīng)區(qū)內(nèi)未反應(yīng)的試劑。
[0026]所述添加抗原步驟具體地可以為:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入待檢測抗原，反應(yīng)后將所述芯片放置于所述環(huán)爐上，洗滌所述反應(yīng)區(qū)內(nèi)未與包被抗體結(jié)合的抗原。
[0027]所述添加標記抗體步驟具體地可以為:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入以介孔二氧化硅或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子為基質(zhì)的集群標記物標記的抗體；所述標記抗體與包被抗體分別與待檢測抗原上的抗原決定簇結(jié)合，形成包被抗體-抗原-標記抗體免疫復(fù)合物，反應(yīng)后將所述芯片放置于所述環(huán)爐上，洗滌所述反應(yīng)區(qū)內(nèi)未與抗原結(jié)合的標記抗體。
[0028]洗滌劑(如蒸餾水)加到所述芯片中心，通過微流控通道向芯片邊緣擴散，所述環(huán)爐對所述芯片邊緣加熱使得洗滌劑加速蒸發(fā)，通過控制所述環(huán)爐的環(huán)圈溫度來控制洗滌劑的流速。具體為:將一張紙基微流控免疫傳感器芯片放在環(huán)爐上，用金屬環(huán)壓住，先用一支毛細移液管在各通道的反應(yīng)區(qū)內(nèi)加1-3微升試樣溶液，調(diào)節(jié)爐溫至稍高于洗滌劑的沸點，然后用芯片上方的毛細移液管將洗滌劑加到芯片中心，當(dāng)毛細移液管尖端接觸芯片時，反應(yīng)區(qū)內(nèi)試樣中的殘余組分隨同洗滌劑向外擴散，擴散到爐孔邊緣。這樣連續(xù)沖洗，直到試樣中的殘余組分全被洗至邊緣，在反應(yīng)區(qū)內(nèi)只留下待測組分。通過調(diào)整環(huán)爐的加熱溫度，可以控制洗滌劑從芯片中央向外擴散的速率，從而可將反應(yīng)區(qū)內(nèi)難于洗滌的反應(yīng)物洗去。用環(huán)圈溫度來控制洗滌和流速，解決了國內(nèi)外現(xiàn)有的紙基微流控芯片在洗滌和流速控制上的問題。
[0029]其中，所述集群標記物包括以介孔二氧化硅或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子為基質(zhì)的辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酶(AP)、異硫氰酸熒光素(FITC)或聯(lián)吡啶釕。這種新標記物可以大大提高現(xiàn)有國內(nèi)外免疫分析產(chǎn)品的檢測靈敏度。根據(jù)選用的檢測方法不同，標記物的選用也不同，采用比色法時，采用辣根過氧化物酶(HRP)以及堿性磷酸酶(AP)作為標記物；采用激光誘導(dǎo)熒光法時，采用異硫氰酸熒光素(FITC)或聯(lián)吡啶釕作為標記物。
[0030]其中，所述待檢測抗原包括:葡萄糖、蛋白質(zhì)、血紅蛋白、亞硝酸鹽、尿膽素原、膽紅素、血液中白細胞和紅細胞、HIV、流感病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、手足口病毒EV71和CA16蛋白、AFP、CEA、CA50、CA125、CA153、CA199、PSA、FER、β -HCG、腫瘤壞死因子-a、C-P、INS、抗-GAD、抗-1NS、白細胞介素_6、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、卵粘蛋白、牛血清白蛋白、B型葡萄球菌腸毒素等。
[0031 ] 其中，所述反應(yīng)區(qū)表面改性處理步驟中，所述表面改性處理可以具體為:高碘酸鈉法、殼聚糖-戊二醛法、表面硅烷化法或微晶纖維素-戊二醛紙外交聯(lián)法。
[0032]更具體地，所述高碘酸鈉法包括以下步驟:取似104加在紙基微流控免疫傳感器芯片的反應(yīng)區(qū)內(nèi)，在37°C、恒溫的條件下避光反應(yīng)0.5小時。
[0033]所述殼聚糖-戊二醛法包括以下步驟:將殼聚糖的乙酸溶液用毛細管加到芯片反應(yīng)區(qū)上，用0.1M pH7.2的PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液)洗滌3次，再用毛細管點在芯片反應(yīng)區(qū)，加體積分數(shù)為2.5%的戊二醛水溶液，避光反應(yīng)0.5小時，干燥后用0.1M pH7.2的PBS緩沖液洗滌5次。
[0034]所述表面硅烷化法包括以下步驟:將3-氨丙基三乙氧基硅烷用毛細管加到芯片的反應(yīng)區(qū)，對芯片進行硅烷化處理。
[0035]所述微晶纖維素-戊二醛紙外交聯(lián)法包括以下步驟:將微晶纖維素溶解于體積分數(shù)為2.5%的戊二醒水溶液中，用毛細管將混合液點在芯片反應(yīng)區(qū),干燥后用0.1M pH7.2的PBS緩沖液洗滌3次。
[0036]其中，所述反應(yīng)區(qū)表面改性處理步驟中，優(yōu)選高碘酸鈉法，本發(fā)明人通過多次試驗發(fā)現(xiàn)在采用介孔二氧化硅或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子為基質(zhì)的集群標記物的條件下，采用高碘酸鈉法改性后的紙基芯片明顯較另三種表面改性法的紙基芯片的檢測靈敏度得到了大幅提高，提高約100倍，具有顯著性。
[0037]其中，所述NaIO4的濃度為0.5M。
[0038]其中，所述紙基為纖維素或者是主要含有纖維素的高分子物質(zhì)，具體如硝酸纖維素紙、紙上色譜用紙等。其具有良好的生物樣品相容性，可以在其表面固定酶、蛋白質(zhì)、DNA、細胞、抗原、抗體等生物大分子。本發(fā)明采用紙作為芯片的基質(zhì)，安全環(huán)保，紙是可燃的，通過燃燒可以安全棄擲己經(jīng)用過的芯片，不會造成化學(xué)和生物污染。
[0039]其中，所述紙基的厚度為0.07-lmm。
[0040]其中，所述構(gòu)建微流控通道步驟中，可以采用疏水性高分子材料在所述紙基上構(gòu)建微流控通道，或者是用自動雕刻法在所述紙基上構(gòu)建微流控通道。[0041]其中，所述疏水性高分子材料包括但不限于:石蠟、過氯乙烯樹脂。
[0042]具體地，所述構(gòu)建微流控通道可以采用以下方法:用噴蠟打印機在紙基上打印出通道圖案，將紙基放入90攝氏度恒溫箱中加熱5分鐘，使表面蠟線滲透到紙基中，形成疏水屏障，而相鄰兩條蠟線內(nèi)的無蠟區(qū)域為可以使液體流過的親水通道。
[0043]其中，所述反應(yīng)區(qū)包括封閉型反應(yīng)區(qū)和非封閉型反應(yīng)區(qū)，優(yōu)選封閉型反應(yīng)區(qū)。封閉型反應(yīng)區(qū)內(nèi)的顯色反應(yīng)能夠呈現(xiàn)出良好且穩(wěn)定的線性關(guān)系，檢測結(jié)果穩(wěn)定。
[0044]其中，所述介孔二氧化硅納米粒子的直徑為25_50nm。所述介孔二氧化硅納米粒子比表面積大，表面及內(nèi)部的孔道規(guī)則，易于固定大量的HRP分子。
[0045]其中，所述集群標記物標記抗體制備步驟中，所述標記載體可以經(jīng)過以下改性處理:對標記載體中加入十六烷基溴化銨、正硅酸乙酯后，染色，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷使所述標記載體表面帶有若干的氨基。
[0046]其中，所述紙基微流控免疫傳感器芯片還包括設(shè)置在紙基上的紙閥、過濾器、混合器以及傳感器等本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的功能組件。
[0047]本發(fā)明所述的紙基微流控免疫傳感器芯片將全分析的過程，包括取樣和樣品的處理、預(yù)濃集、稀釋和混合、分離、化學(xué)和生物反應(yīng)及信號的檢測全部集成化在一塊小的芯片上，它與傳統(tǒng)的分析裝置相比，能實現(xiàn)亞微升甚至納升的試劑和樣品消耗，分析時間短。
[0048]其中，本發(fā)明各步驟中添加試劑至反應(yīng)區(qū)均以使試劑不溢出反應(yīng)區(qū)為宜。
[0049]其中，所述包被抗體步驟中，所述的待檢測物質(zhì)的包被抗體可以為:甲胎蛋白單克隆抗體、癌胚抗原單克隆抗體等。本發(fā)明中，如無特別指出，所述包被抗體指的是待檢測抗原對應(yīng)的單克隆抗體。
[0050]其中，所述封閉步驟中，所述封閉劑為明膠、脫脂奶粉或質(zhì)量分數(shù)為1%的BSA (牛血清白蛋白)溶液，添加量為4uL。
[0051]本發(fā)明所述的紙基微流控免疫傳感器芯片可用于檢測以下物質(zhì):
葡萄糖、蛋白質(zhì)、血紅蛋白、亞硝酸鹽、尿膽素原、膽紅素、血液中白細胞和紅細胞、HIV、流感病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、手足口病毒EV71和CA16蛋白、AFP、CEA、CA50、CA125、CA153、CA199、PSA、FER、β -HCG、腫瘤壞死因子-a、C-P、INS、抗-GAD、抗-1NS、白細胞介素-6、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、卵粘蛋白、牛血清白蛋白、B型葡萄球菌腸毒素等。
[0052]本發(fā)明所述的紙基微流控免疫傳感器芯片根據(jù)對被分析物檢測靈敏度的需要，可選擇采用比色法、激光誘導(dǎo)熒光法或者是化學(xué)發(fā)光法對目標物進行定性及定量分析，具體地，采用比色法包括如下步驟:在芯片的反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入TMB (四甲基聯(lián)苯胺)顯色液，避光反應(yīng)后利用手機拍照或掃描儀采集所述芯片的圖像，根據(jù)光密度值進行比色分析。具體地，采用激光誘導(dǎo)熒光法包括如下步驟:用激光誘導(dǎo)熒光法采集所述芯片發(fā)出的信號，用光電倍增管檢測。
[0053]現(xiàn)有技術(shù)中的微流控芯片通常通過電化學(xué)信號、化學(xué)發(fā)光信號、電極等方法對待檢測抗原進行檢測，上述方法存在儀器設(shè)備復(fù)雜、檢測成本高等缺點，而本發(fā)明所述的紙基微流控免疫傳感器芯片根據(jù)集群標記物及對被分析物檢測靈敏度的需要，分別用比色法、激光誘導(dǎo)熒光法對目標物進行定性或定量分析，檢測靈敏度大幅提高，且操作簡單，降低成本。
[0054]一種現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺，包括上述的紙基微流控免疫傳感器芯片、數(shù)據(jù)處理終端、數(shù)據(jù)分析終端；
所述現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺能夠在所述的紙基微流控免疫傳感器芯片的基礎(chǔ)上，通過所述數(shù)據(jù)處理終端以及所述數(shù)據(jù)分析終端進行數(shù)據(jù)的傳輸、處理以及分析，能夠?qū)崟r遠程地獲取分析結(jié)果；
所述數(shù)據(jù)處理終端用于采集所述紙基微流控免疫傳感器芯片上的信息、對采集的信息進行處理、并將所述處理后的信息發(fā)送至所述數(shù)據(jù)分析終端；
所述數(shù)據(jù)分析終端用于接收所述數(shù)據(jù)處理終端發(fā)出的信息，進行分析并得出分析結(jié)
果O
[0055]其中，所述數(shù)據(jù)處理終端可以為智能手機、掃描儀、計算機等。通過照相或者是掃描等功能采集所述紙基微流控免疫傳感器芯片上的信息。
[0056]其中，所述數(shù)據(jù)分析終端得出的分析結(jié)果還能回傳至所述數(shù)據(jù)處理終端，使使用者能夠遠程獲知該檢測結(jié)果。
[0057]綜上所述，本發(fā)明所述的紙基微流控免疫傳感器芯片的反應(yīng)靈敏度高，能適用于多種蛋白質(zhì)及病毒的檢測，應(yīng)用范圍更廣。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0058]圖1為實施例1所示的紙基微流控免疫傳感器芯片的微流控通道結(jié)構(gòu)示意圖，其中，紙基微流控免疫傳感器芯片10、疏水屏障11、親水通道12、反應(yīng)區(qū)13、中心區(qū)14 ；
圖2為實施例2所示的紙基微流控免疫傳感器芯片的微流控通道結(jié)構(gòu)示意圖，其中，紙基微流控免疫傳感器芯片20、疏水屏障21、反應(yīng)區(qū)23 ；
圖3為實施例3所示的紙基微流控免疫傳感器芯片的微流控通道結(jié)構(gòu)示意圖，其中，紙基微流控免疫傳感器芯片30、中心區(qū)31、親水通道32、疏水屏障33、反應(yīng)區(qū)34 ；
圖4為介孔二氧化硅納米粒子的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖5為介孔二氧化硅納米粒子表面改性的流程圖；
圖6為雙抗體夾心法檢測待測抗原流程圖；
圖7為環(huán)爐的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，環(huán)爐40、爐體41、毛細移液管42、光源43 ；
圖8為反應(yīng)區(qū)未洗滌的微流控免疫傳感器芯片；
圖9為采用環(huán)爐洗滌后的微流控免疫傳感器芯片；
圖10為實施例4中的甲胎蛋白標準系列顯色情況；
圖11為實施例4中的甲胎蛋白標準系列光密度-濃度曲線；
圖12為實施例4中的2例血清樣品顯色情況，其中，A為I號血清樣品，B為2號血清樣品；
圖13為實施例4中的另2例血清樣品顯色情況，其中，C為3號血清樣品，D為4號血清樣品；
圖14為實施例5中的癌胚抗原標準系列顯色情況；
圖15為實施例5中的3例血清樣品顯色情況，其中，E為I號血清樣品，F(xiàn)為2號血清樣品，G為3號血清樣品；
圖16為實施例5中的癌胚抗原標準系列光密度-濃度曲線；
圖17為實施例6中非封閉型反應(yīng)區(qū)的紙基微流控免疫傳感器芯片測定甲胎蛋白標準品的顯色情況的掃描圖，其中灰色圓形區(qū)域為顯色區(qū)域；
圖18為實施例6中具有非封閉型反應(yīng)區(qū)的紙基微流控免疫傳感器芯片測定甲胎蛋白的光密度-濃度曲線，其中A為第一試驗點，B為第二試驗點；
圖19為實施例6中的采用封閉型反應(yīng)區(qū)的紙基微流控免疫傳感器芯片測定的第一試驗點的甲胎蛋白標準系列顯色情況；
圖20為實施例6中的采用封閉型反應(yīng)區(qū)的紙基微流控免疫傳感器芯片測定的第二試驗點的甲胎蛋白標準系列顯色情況；
圖21為實施例6中具有封閉型反應(yīng)區(qū)的紙基微流控免疫傳感器芯片測定甲胎蛋白光密度-濃度曲線，其中A為第一試驗點，B為第二試驗點；
圖22為光導(dǎo)纖維激光誘導(dǎo)熒光檢測流程，其中，半導(dǎo)體激光光源A、截止濾光片D、石英光纖E、玻璃光纖F、紙基微流控免疫傳感器芯片G、芯片的毫米陣列的任一斑點M ；
圖23為激光光源激發(fā)的Ru(bpy)32+摻雜的SiO2納米粒子熒光強度圖，A，B, C，D和E分別為不同量Ru(bpy)32+摻雜的SiO2納米粒子激光誘導(dǎo)產(chǎn)生的熒光信號，其中，A為Ing/mL，B 為 0.5ng/mL，C 為 0.3ng/mL, D 為 0.2ng/mL, E 為 0.1ng/mL ；
圖24為化學(xué)發(fā)光法對待測抗原定量檢測；
圖25為實施例7所示的現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺100、紙基微流控免疫傳感器芯片101、數(shù)據(jù)處理終端102、數(shù)據(jù)分析終端103。
【具體實施方式】
[0059]下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0060]實施例1
請參閱圖1，本發(fā)明所示的紙基微流控免疫傳感器芯片10，用噴蠟打印機在紙基上打印出通道圖案，將紙基放入90攝氏度恒溫箱中加熱5分鐘，使表面蠟線滲透到紙基中，形成疏水屏障11，相鄰兩條蠟線內(nèi)的無蠟區(qū)域則形成能夠供液體流過的親水通道12，所述紙基微流控免疫傳感器芯片10中心設(shè)有一中心區(qū)14，所述中心區(qū)14向四周輻射形成若干條親水通道12，本實施例中，設(shè)有8條所述親水通道12。該親水通道12包括一用于發(fā)生免疫反應(yīng)的非封閉型反應(yīng)區(qū)13。
[0061]實施例2
請參閱圖2，本發(fā)明所示的紙基微流控免疫傳感器芯片20，用噴蠟打印機在紙基上打印出通道圖案，將紙基放入90攝氏度恒溫箱中加熱5分鐘，使表面蠟線滲透到紙基中，形成若干疏水屏障21，所述若干疏水屏障21成矩形陣列排列，任一疏水屏障21成圓環(huán)形，任一疏水屏障21圍成的區(qū)域為用于發(fā)生免疫反應(yīng)的封閉的反應(yīng)區(qū)23，該反應(yīng)區(qū)23能夠供液體流動。
[0062]上述實施例1及實施例2中除了采用石蠟之外，還可以采用過氯乙烯樹脂等其他的疏水性高分子材料，也能達到相同的效果。
[0063]實施例3
請參閱圖3，本發(fā)明所示的紙基微流控免疫傳感器芯片30，用制圖軟件繪制出需要雕刻的圖形后，采用小型數(shù)控雕刻機制作而成，所述紙基微流控免疫傳感器芯片30中心設(shè)有一中心區(qū)31，所述中心區(qū)31向四周輻射形成若干條親水通道32，本實施例中，設(shè)有8條所述親水通道32。任意兩相鄰的親水通道32之間設(shè)有疏水屏障33，所述親水通道32鄰近所述中心區(qū)設(shè)置有一用于發(fā)生免疫反應(yīng)的非封閉型反應(yīng)區(qū)34。
[0064]以上實施例1-3主要是對所述紙基微流控免疫傳感器芯片構(gòu)建微流控通道的具體方式及結(jié)構(gòu)作出解釋說明，除以上方法之外，還可以通過其他方式，如噴墨打印、激光處理等，其他結(jié)構(gòu)構(gòu)建所述微流控孔道。以下通過三個具體實施例進一步解釋說明本發(fā)明。
[0065]實施例4測定人血清中的甲胎蛋白
甲胎蛋白(AFP)是由胎兒胃腸道上皮組織、胰和肝的細胞所合成。
[0066]紙基微流控免疫傳感器芯片是利用ELISA雙抗夾心法，利用連接于固相載體上的抗體和標記抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-標記抗體免疫復(fù)合物。采用如實施例2所示矩形陣列排列的紙基微流控免疫傳感器芯片，至少設(shè)有18個反應(yīng)區(qū)。
[0067]具體如下:
(I)芯片氧化
a、移取0.5M NaIO4加在紙基芯片的每個圓形反應(yīng)區(qū)，將芯片放入濕盒中，置于37°C恒溫箱內(nèi)避光反應(yīng)0.5小時；
b、芯片從濕盒中取出，將反應(yīng)區(qū)內(nèi)剩余液體用吸水紙從背面吸干，用蒸餾水洗滌紙上未反應(yīng)的聞鵬酸納。
[0068](2)包被抗體
a、在芯片的18個反應(yīng)區(qū)各加10ug/mL AFP (甲胎蛋白)單克隆抗體，放入濕盒中，置于37°C恒溫箱內(nèi)反應(yīng)0.5小時；
b、取出芯片，將反應(yīng)區(qū)內(nèi)剩余液體用吸水紙從背面吸干，用蒸餾水洗滌紙上未反應(yīng)的包被抗體。
[0069](3)封閉
在芯片的18個反應(yīng)區(qū)各加質(zhì)量分數(shù)為1%BSA溶液，放入濕盒中，置于37°C恒溫箱內(nèi)反應(yīng)0.5小時。
[0070](4)加抗原
a、在芯片第一排依次加入0/10/20/50/100/200ng/mlAFP標準品，在下面兩排中每三點加入同一血清樣品，放入濕盒中，置于37°C恒溫箱內(nèi)反應(yīng)0.5小時；
b、取出芯片，將反應(yīng)區(qū)內(nèi)剩余液體用吸水紙從背面吸干，用蒸餾水洗去多余的抗原。
[0071](5)制備標記抗體
如圖5所示，加入十六烷基溴化銨、正硅酸乙酯對介孔二氧化硅納米粒子進行處理后，染色，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷使所述介孔二氧化硅納米粒子表面帶有若干的氨基，最后使用蒸餾水將多余的組分洗滌；
將改性后的介孔二氧化硅納米粒子中添加辣根過氧化物酶、AFP抗體，形成集群辣根過氧化物酶-AFP抗體共軛物，從而得到標記抗體。
[0072](6)加標記抗體
a、在芯片的18個反應(yīng)區(qū)分別加入標記抗體，放入濕盒中，置于37°C恒溫箱內(nèi)反應(yīng)0.5小時；b、取出芯片，將反應(yīng)區(qū)內(nèi)剩余液體用吸水紙從背面吸干，用蒸餾水洗滌紙上未反應(yīng)的標記抗體。
[0073](7)顯色反應(yīng)
a、在芯片的18個反應(yīng)區(qū)分別加入TMB顯色液，避光反應(yīng)10分鐘；
b、反應(yīng)后取出芯片，將反應(yīng)區(qū)內(nèi)剩余液體用吸水紙從背面吸干，分析顯色結(jié)果。
[0074]測試結(jié)果如圖10-13及下表1-2。
[0075]表1甲胎蛋白標準系列光密度值
【權(quán)利要求】
1.一種紙基微流控免疫傳感器芯片，其特征在于，包括紙基、在所述紙基上構(gòu)建的微流控通道，以及設(shè)在該微流控通道內(nèi)的集群標記物標記的抗體，所述集群標記物的標記載體為介孔二氧化硅納米粒子或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子，該紙基微流控免疫傳感器芯片主要由以下制備方法制得: 構(gòu)建微流控通道步驟:在紙基上構(gòu)建微流控通道，所述微流控通道由疏水屏障及親水通道構(gòu)成，所述親水通道包括用于發(fā)生免疫反應(yīng)的反應(yīng)區(qū)； 反應(yīng)區(qū)表面改性處理步驟:所述反應(yīng)區(qū)內(nèi)紙基經(jīng)過表面改性處理，使所述紙基表面帶有醒基； 添加包被抗體步驟:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入待檢測抗原對應(yīng)的包被抗體，包被抗體與表面帶有醛基的紙基交聯(lián)固定； 封閉步驟:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入封閉劑，用于封閉紙基上未結(jié)合抗體的活性部位； 添加抗原步驟:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入待檢測抗原； 集群標記物標記抗體制備步驟:對標記載體進行表面改性，使任一標記載體能夠結(jié)合若干的標記物，所述標記載體為介孔二氧化硅納米粒子或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子，添加與待檢測抗原一一對應(yīng)的抗體，使任一抗體與以介孔二氧化硅或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子為基質(zhì)的集群標記物結(jié)合； 添加標記抗體步驟:在反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入以介孔二氧化硅或金屬氧化物-二氧化硅復(fù)合型納米粒子為基質(zhì)的集群標記物標記的抗體；所述標記抗體與包被抗體分別與待檢測抗原上的抗原決定簇結(jié)合，形成包被抗體-抗原-標記抗體免疫復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控免疫傳感器芯片，其特征在于，所述反應(yīng)區(qū)表面改性處理步驟中，所述表面改性處理為:高碘酸鈉法、殼聚糖-戊二醛法、表面硅烷化法或微晶纖維素-戊二醛紙外交聯(lián)法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的紙基微流控免疫傳感器芯片，其特征在于，所述表面改性處理為高碘酸鈉法，所述高碘酸鈉法包括以下步驟:取NaIO4加在紙基微流控免疫傳感器芯片的反應(yīng)區(qū)內(nèi)，在37°C、恒溫的條件下避光反應(yīng)0.5小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控免疫傳感器芯片，其特征在于，所述紙基微流控免疫傳感器芯片的反應(yīng)區(qū)為非封閉型反應(yīng)區(qū)，且在所述反應(yīng)區(qū)表面改性處理步驟、添加包被抗體步驟、添加抗原步驟以及添加標記抗體步驟中將該紙基微流控免疫傳感器芯片放置于所述環(huán)爐上進行洗滌，洗滌劑加到所述芯片中心，通過微流控通道向芯片邊緣擴散，所述環(huán)爐對所述芯片邊緣加熱使得洗滌劑加速蒸發(fā)，通過控制所述環(huán)爐的環(huán)圈溫度來控制洗滌劑的流速。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控免疫傳感器芯片，其特征在于，所述紙基微流控免疫傳感器芯片還包括以下檢測步驟:在芯片的反應(yīng)區(qū)內(nèi)加入TMB顯色液，避光反應(yīng)后利用手機拍照或掃描儀采集所述芯片的圖像，根據(jù)光密度值進行比色分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控免疫傳感器芯片，其特征在于，所述紙基微流控免疫傳感器芯片還包括以下檢測步驟:通過激光誘導(dǎo)熒光法對待測物進行定性及定量檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控免疫傳感器芯片，其特征在于，所述集群標記物標記抗體制備步驟中，所述標記載體經(jīng)過以下改性處理:對標記載體中加入十六烷基溴化銨、正硅酸乙酯后，染色，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷使所述標記載體表面帶有若干的氨基。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紙基微流控免疫傳感器芯片，其特征在于，所述反應(yīng)區(qū)為封閉型反應(yīng)區(qū)。
9.一種現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺，其特征在于:包括權(quán)利要求1至8中任一項所述的紙基微流控免疫傳感器芯片、數(shù)據(jù)處理終端、數(shù)據(jù)分析終端； 所述現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺能夠在所述的紙基微流控免疫傳感器芯片的基礎(chǔ)上，通過所述數(shù)據(jù)處理終端以及所述數(shù)據(jù)分析終端進行數(shù)據(jù)的傳輸、處理以及分析，能夠?qū)崟r遠程地獲取分析結(jié)果； 所述數(shù)據(jù)處理終端用于采集所述紙基微流控免疫傳感器芯片上的信息、對采集的信息進行處理、并將所述處理后的信息發(fā)送至所述數(shù)據(jù)分析終端；所述數(shù)據(jù)分析終端用于接收所述數(shù)據(jù)處理終端發(fā)出的信息，進行分析并得出分析結(jié)果.
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的現(xiàn)場及時檢測免疫分析平臺，其特征在于，所述數(shù)據(jù)處理終端為智能手機、掃描儀或計算機；所述數(shù)據(jù)分析終端得出的分析結(jié)果回傳至所述數(shù)據(jù)處理終端，使使用者能夠遠程獲知該檢測結(jié)果。
【文檔編號】G01N33/552GK103954751SQ201410177093
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】章竹君, 付愛華, 沈暉, 林湔, 章嫻君 申請人:成都君亞科技有限公司