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一種檢測人血清中總睪酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測人血清中總睪酮的方法，該方法包括如下步驟：向含有人血清樣品的試管中加入含睪酮內(nèi)標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)液，混勻后加入甲基叔丁基醚進(jìn)行蛋白沉淀并萃取待測物；離心后置于-65?-80°C條件下放置l-2h，接著轉(zhuǎn)移上清液至另一試管中進(jìn)行干燥，然后加入復(fù)溶劑，得到待測樣品；對待測樣品用高通量的液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；以睪酮的相對保留時間和檢測的定量離子對的豐度比為定性依據(jù)，采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量。本發(fā)明采用高通量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀對人血清中的睪酮進(jìn)行檢測，檢測時間短，通量高，靈敏度好，精密度高。
【專利說明】一種檢測人血清中總睪酮的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分析檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種高通量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測 人血清中總睪酮的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 睪酮是一種類固醇荷爾蒙，由男性的睪丸或女性的卵巢分泌，腎上腺亦分泌少量； 但絕經(jīng)后婦女，卵巢分泌睪酮顯著減少。在男性中，它對外生殖器和第二性征的發(fā)育起著重 要作用，其生物化學(xué)過程尚未完全闡明。女性中，其主要作用是作為一種雌激素的前體。同 時，睪酮可能影響許多身體系統(tǒng)和功能，包括：血生成，體內(nèi)鈣平衡，骨礦化作用，脂代謝，糖 代謝和前列腺增長。
[0003] 大多數(shù)睪酮與性激素結(jié)合球蛋白（SHBG)結(jié)合，在男性中也被稱為睪丸激素結(jié)合 球蛋白；少數(shù)與白蛋白結(jié)合，一小部分以游離形式存在。游離睪酮被認(rèn)為是生物活性成分。 然而，睪酮與白蛋白結(jié)合較弱，所以所有非SHBG結(jié)合的睪酮被認(rèn)為是生物可利用的。
[0004] 在兒童期，過多睪酮會誘發(fā)男孩性早熟和女孩的男性化。在成年女性中，過量的睪 酮會造成不同程度的男性化，包括多毛，痤瘡，月經(jīng)稀發(fā)，或不育。睪酮輕度至中度升高對男 性通常無明顯癥狀，但對女性造成嚴(yán)重的影響。對于睪酮輕度至中度升高的確切原因往往 不清楚。明顯升高的常見原因包括遺傳疾?。ㄈ缦忍煨阅I上腺皮質(zhì)增生癥），腎上腺，睪丸 和卵巢的腫瘤和運動員濫用睪丸激素或促性腺激素通。女性的睪酮降低會引起微妙的癥 狀，這主要包括性欲下降和非特異性的情緒變化。在男性，它會導(dǎo)致性腺功能減退，這個特 點將改變男性的第二性征和生育功能。
[0005] 傳統(tǒng)的睪酮檢測方法有酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、放射性免疫分析法（RIA)、化學(xué) 發(fā)光免疫檢測（CLISA)、自動化免疫分析系統(tǒng)、高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法等，現(xiàn) 有的睪酮檢測方法，主要存在如下問題：第一、由于睪酮在人體內(nèi)主要與性激素結(jié)合球蛋白 (SHBG)結(jié)合，且人體內(nèi)存在大量的高親和力結(jié)合蛋白，因此檢測存在嚴(yán)重的基質(zhì)干擾。而傳 統(tǒng)的免疫法，不能有效祛除基質(zhì)干擾；第二，免疫學(xué)檢測方法是建立在抗體對抗原分子識別 的基礎(chǔ)上，由于人體內(nèi)存在大量的與睪酮結(jié)構(gòu)相似的化合物，所以該檢測技術(shù)的特異性差， 易導(dǎo)致假陽性的出現(xiàn)，尤其是在睪酮濃度水平較低的情況下，傳統(tǒng)的免疫方法無法準(zhǔn)確測 定；第三，高效液相色譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法，前處理復(fù)雜，分析時間長，靈敏度低；第四， 現(xiàn)有的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法整個檢測過程時間長、檢測通量低。
[0006] 因此，需要本領(lǐng)域技術(shù)人員迫切解決的一個技術(shù)問題就是：如何能夠提供一種適 用于人血清中總睪酮的檢測方法，前處理簡單，能有效祛除基質(zhì)干擾，可以準(zhǔn)確定量極低濃 度（〈100ng/dL)的睪酮，并且整個檢測過程時間短、通量高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明實施例所要解決的技術(shù)問題是提供一種適用于人血清總睪酮的高通量的 檢測方法，該方法靈敏度低，能夠準(zhǔn)確定量極低濃度（〈l〇〇ng/dL)的睪酮，能夠有效去除基 質(zhì)干擾，快速檢測，通量高。
[0008] 為了解決上述問題，本發(fā)明公開了一種高通量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人血清中 總睪酮的方法，具體的技術(shù)方案如下：
[0009] -種高通量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測人血清中總睪酮的方法，包括如下步驟： [0010] ⑴前處理
[0011] 向人血清樣品的試管中加入含睪酮內(nèi)標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)液，混勻后加入甲基叔丁基醚進(jìn) 行蛋白沉淀并萃取睪酮，然后離心后置于-65?-75°c條件下放置l-2h，接著轉(zhuǎn)移上清液并 進(jìn)行干燥，然后加入復(fù)溶劑，得到待測樣品；
[0012] 其中，所述睪酮內(nèi)標(biāo)物為睪酮的碳代標(biāo)記物或氘代標(biāo)記物；所述內(nèi)標(biāo)液與人血 清樣品的體積比為1:10?1:4;所述人血清樣品、甲基叔丁基醚及復(fù)溶劑的體積比為 2:8:1 ?2:15:1 ;
[0013] ⑵檢測
[0014] 對所述待測樣品采用高通量液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；
[0015] 其中色譜條件為：色譜柱為C18色譜柱；柱溫為48-52°C;流動相為甲醇和水，流速 為0. 5-lml/min，采用梯度洗脫：起始流動相甲醇：水的體積比為35:65,待測物出峰時流動 相甲醇：水的體積比為60:40,而后再回到起始流動相甲醇：水的體積比為35:65,并保持 1?2min，整個梯度的時間為3?8min ;
[0016] 質(zhì)譜條件為：采用正離子模式，掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描MRM;
[0017]目標(biāo)定量離子的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描MRM的條件為：睪酮母離子的質(zhì)/荷比為 289. 2?290. 2,對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為97. 1?98. 1。
[0018] 在其中一個實施例中，內(nèi)標(biāo)的定量離子對的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描MRM的條件為： 內(nèi)標(biāo)母離子的質(zhì)/荷比為290. 2?296. 2,對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為110. 1?116. 1。
[0019] 在其中一個實施例中，所述質(zhì)譜條件還包括：睪酮定量離子對的去簇電壓為 110v，入口電壓為10v，碰撞電壓為32v，出口電壓為20v ;睪酮內(nèi)標(biāo)的定量離子對的去簇電 壓為100v，入口電壓為10v，碰撞電壓為34v，出口電壓為12v。
[0020] 在其中一個實施例中，所述質(zhì)譜條件的離子源參數(shù)包括：電離源為電噴霧電離 ESI源；氣簾氣壓力為15psi ;加熱氣壓力為50psi ;輔助加熱氣壓力為50psi ;加熱氣溫度 為400°C ;碰撞氣為高純氮氣，壓力為8psi ;電噴霧針電壓為4000V。
[0021] 在其中一個實施例中，所述高通量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀包括兩套高通量液相 色譜系統(tǒng)，所述兩套高通量液相色譜系統(tǒng)的液相色譜條件一樣；第一套液相采集窗口為 2. Omin-3. Omin ;第二套液相采集窗口為2. Omin-3. Omin。較佳地在此系統(tǒng)上，5min可以檢 測兩個樣品。
[0022] 在其中一個實施例中，步驟（1)中所述離心的條件包括：以8000-10000r/min的速 度離心 4. 5-5. 5min。
[0023] 在其中一個實施例中，步驟（1)中所述干燥的條件為通50°C的氮氣直至干燥。
[0024] 在其中一個實施例中，步驟（1)中所述復(fù)溶劑為體積比為50:50-10:90的甲醇和 水的混合物。
[0025] 在其中一個實施例中，步驟（1)中所述內(nèi)標(biāo)液為含睪酮內(nèi)標(biāo)物的乙腈-水溶液，其 中乙腈與水的體積比為50:50-10:90。
[0026] 在其中一個實施例中，該檢測方法還包括如下步驟：定性判斷和定量計算，
[0027] 依據(jù)睪酮、睪酮內(nèi)標(biāo)物的相對保留時間和檢測的定量離子對的豐度比判斷睪酮的 存在；
[0028] 依據(jù)睪酮與對應(yīng)睪酮內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的峰面積比值，計算人血清樣品中 的睪酮的含量。
[0029] 與【背景技術(shù)】相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：
[0030] 本發(fā)明采用高通量液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā) 明實施例可以實現(xiàn)5min檢測2個樣品，單個樣品的檢測時間平均為2. 5min，與現(xiàn)有的液相 色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、氣相色譜質(zhì)譜法等相比，檢測時間短、檢測通量高；
[0031] 本發(fā)明檢測方法的定量限為0. 94ng/dL，精密度RSD小于10%，可以準(zhǔn)確的定性或 定量檢測出人血清中極低濃度（〈lOOng/dL)的睪酮含量，與傳統(tǒng)的免疫法檢測相比，檢測 靈敏度高、精密度高。
[0032] 本發(fā)明通過液液萃取，吹干、復(fù)溶后便可以用高通量液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀 進(jìn)行檢測，與其他方法相比，前處理簡單，檢測通量高，并且可以有效去除基質(zhì)干擾，方法特 異性、抗干擾能力強(qiáng)。
[0033] 由以上可知采用本發(fā)明的檢測方法進(jìn)行檢測，檢測時間短，通量高，靈敏度高，精 密度高。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 圖1為本發(fā)明檢測流程圖；
[0035] 圖2為實際樣本中睪酮及其內(nèi)標(biāo)物的TIC圖；
[0036] 圖3為內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實施方式】
[0037] 為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合【具體實施方式】 對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0038] 參見圖1，示出了本發(fā)明實施例的一種睪酮的高通量檢測方法實施例的步驟流程 圖，具體可以包括如下步驟：
[0039] 步驟101，前處理；
[0040] 向人血清樣品加入含有睪酮內(nèi)標(biāo)物的乙腈-水溶液，混勻后加入甲基叔丁基醚進(jìn) 行蛋白沉淀并萃取待測物；離心后置于-70°C條件下放置lh，接著轉(zhuǎn)移上清液并進(jìn)行干燥， 然后加入復(fù)溶劑，得到待測樣品；
[0041] 其中，所述人血清樣品、甲基叔丁基醚及復(fù)溶劑的體積比為2:8:1?2:15:1 (優(yōu)選 為2 :10 :1);所述乙腈-水溶液與人血清樣品的體積比為1:10?1:4(優(yōu)選為1:4);所述 睪酮內(nèi)標(biāo)物為13C3_睪酮。
[0042] 可以理解，步驟101是對人血清樣品的前處理，以富集人血清樣品中的睪酮。血清中 的睪酮存在形式有：游離的，與性激素結(jié)合球蛋白（SHBG)結(jié)合，少數(shù)與白蛋白結(jié)合。本發(fā)明實 施例的前處理步驟中，樣品經(jīng)過蛋白質(zhì)沉淀釋放出睪酮同時萃取睪酮，通過加入甲基叔丁基 醚可以從人血清樣品中去除蛋白質(zhì)，并萃取出睪酮，留在上清液中為睪酮和其它可溶物。
[0043] 乙腈-水溶液中乙腈和水的體積比可為50:50-10:90,優(yōu)選為30:70。
[0044] 對加入甲基叔丁基醚后的溶液的離心的條件可以包括：在室溫下，以10000r/min 的速度離心4. 5-5. 5min。
[0045] 上清液的干燥條件可以包括：通50°C的氮氣直至干燥。
[0046] 復(fù)溶劑可以為甲醇和水的混合物，其中，所述甲醇和水的體積比可以為 50:50-10:90,優(yōu)選為 35:65。
[0047] 步驟102,檢測；
[0048] 對所述待測樣品用高通量液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測；
[0049] 所述檢測采用正離子模式，掃描方式采用多反應(yīng)檢測離子掃描MRM ;
[0050] MRM :Multi Reaction Monitor，指多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描。
[0051] 其中，目標(biāo)定量離子對包括睪酮定量離子對，目標(biāo)定量離子的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃 描MRM的條件可以包括：睪酮母離子的質(zhì)/荷比為289. 2?290. 2,對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷 比為97. 1?98. 1。
[0052] 內(nèi)標(biāo)定量離子對包括13C3_睪酮定量離子對，內(nèi)標(biāo)定量離子對的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃 描MRM的條件為： 13C3_睪酮母離子的質(zhì)/荷比為292. 2?293. 2,對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比 為 112. 1 ?113. 1 ;
[0053] 其中，所述液相色譜采用梯度模式洗脫，液相色譜條件包括：
[0054] 色譜柱：3. 5um2. lmmX50C18
[0055] 色譜柱柱溫：50°C ;
[0056] 進(jìn)樣量：50ul ;
[0057] 流速：0· 5ml/min ;
[0058] 流動相：甲醇以及水；
[0059] 梯度洗脫的條件如下：
[0060]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，包括如下步驟： (1) 前處理 向人血清樣品的試管中加入含辜麗內(nèi)標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)液，混勻后加入甲基叔丁基釀進(jìn)行蛋 白沉淀并萃取睪酮，然后離心后置于-65?-75°c條件下放置l-2h，接著轉(zhuǎn)移上清液并進(jìn)行 干燥，然后加入復(fù)溶劑，得到待測樣品； 其中，所述睪酮內(nèi)標(biāo)物為睪酮的碳代標(biāo)記物或氘代標(biāo)記物；所述內(nèi)標(biāo)液與人血清樣品 的體積比為1:10?1:4 ;所述人血清樣品、甲基叔丁基醚及復(fù)溶劑的體積比為2:8:1? 2:15:1 ； (2) 檢測 對所述待測樣品采用高通量液相色譜串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測； 其中色譜條件為：色譜柱為C18色譜柱；柱溫為48-52°C ;流動相為甲醇和水,流速為 0. 5-lml/min，采用梯度洗脫：起始流動相甲醇：水的體積比為35:65,待測物出峰時流動相 甲醇：水的體積比為60:40,而后再回到起始流動相甲醇：水的體積比為35:65,并保持1? 2min，整個梯度的時間為3?8min ; 質(zhì)譜條件為：采用正離子模式，掃描方式采用多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描MRM ; 目標(biāo)定量離子的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描MRM的條件為：睪酮母離子的質(zhì)/荷比為 289. 2?290. 2,對應(yīng)的子離子的質(zhì)/荷比為97. 1?98. 1。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，內(nèi)標(biāo)的定量離子 對的多反應(yīng)監(jiān)測離子掃描MRM的條件為：內(nèi)標(biāo)母離子的質(zhì)/荷比為290. 2?296. 2,對應(yīng)的 子離子的質(zhì)/荷比為110. 1?116. 1。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，所述質(zhì)譜條件還 包括：睪酮定量離子對的去簇電壓為ll〇v，入口電壓為l〇v，碰撞電壓為32v，出口電壓為 20v ;睪酮內(nèi)標(biāo)的定量離子對的去簇電壓為100v，入口電壓為10v，碰撞電壓為34v，出口電 壓為12v。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，所述質(zhì)譜條件的 離子源參數(shù)包括：電離源為電噴霧電離ESI源；氣簾氣壓力為15psi ;加熱氣壓力為50psi ; 輔助加熱氣壓力為50psi ;加熱氣溫度為400°C;碰撞氣為高純氮氣，壓力為8psi ;電噴霧針 電壓為4000V。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，所述高通量 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀包括兩套高通量液相色譜系統(tǒng)，所述兩套高通量液相色譜系統(tǒng)的 液相色譜條件一樣；第一套液相采集窗口為2.0min-3.0min ;第二套液相采集窗口為 2. Omin-3· 0min〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，步驟（1)中所述離 心的條件包括：以8000-10000r/min的速度離心4. 5-5. 5min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，步驟⑴中所述干 燥的條件為通50°C的氮氣直至干燥。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，步驟（1)中所述復(fù) 溶劑為體積比為50:50-10:90的甲醇和水的混合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，步驟（1)中所述內(nèi) 標(biāo)液為含睪酮內(nèi)標(biāo)物的乙腈-水溶液，其中乙腈與水的體積比為50:50-10:90。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的檢測人血清中總睪酮的方法，其特征在于，該檢測 方法還包括如下步驟：定性判斷和定量計算， 依據(jù)睪酮、睪酮內(nèi)標(biāo)物的相對保留時間和檢測的定量離子對的豐度比判斷睪酮的存 在； 依據(jù)睪酮與對應(yīng)睪酮內(nèi)標(biāo)物在內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的峰面積比值，計算人血清樣品中的睪 酮的含量。
【文檔編號】G01N30/02GK104215716SQ201410484568
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】何翠紅, 趙蓓蓓, 程雅婷, 李卓陽, 佘旭輝, 董衡, 李維, 劉偉霞, 梁曉翠 申請人:沈陽金域醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司