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一種高靈敏度測試游離生物素的方法
【專利摘要】一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：利用植物乳桿菌對游離生物素的特異性和靈敏性，通過游離生物素的濃度與菌體的生長量和生長速度成正比的關(guān)系，根據(jù)吸光值與工作曲線進(jìn)行比較，即可算出試樣中待測物的濃度；其中，所述吸光值為采用酶標(biāo)儀測量培養(yǎng)后的液體獲得的吸光度。本發(fā)明提供了一種簡便、高效的游離生物素的檢測方法。
【專利說明】一種高靈敏度測試游離生物素的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物食品檢測領(lǐng)域，具體地，涉及一種高靈敏度測試游離生物素的 方法，特別是針對嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的檢測。 技術(shù)背景
[0002] 生物素又稱為維生素H，是水溶性維生素，屬于B族維生素，是含硫的一種維生素， 也是生物體內(nèi)羧基轉(zhuǎn)化酶作用的一種輔酶，故又稱為輔酶R。
[0003] 生物素是生物題生長發(fā)育必需的一種營養(yǎng)素，它參與有機體多種主要的新陳代謝 活動。特別是對嬰幼兒及孕產(chǎn)婦有著特殊的重要性，因此在嬰幼兒乳制品、孕產(chǎn)婦乳制品 及食品營養(yǎng)強化劑中添加生物素是十分必要的。其主要的性能與用途有：構(gòu)成視沉細(xì)胞內(nèi) 感光物質(zhì)；維持上皮組織結(jié)構(gòu)的完整和健全；增強機體免疫反應(yīng)和抵抗力和維持正常生長 發(fā)育。
[0004] 生物素主要來源于牛奶、牛肝、蛋黃、動物腎臟、草莓、柚子、葡萄等水果中，此外， 瘦肉、糙米、啤酒、小麥中也含有生物素。
[0005] 近些年生物素的發(fā)展越來越受到關(guān)注，檢測的方法也比較多，但每種檢測方法的 原理，時效，以及針對的產(chǎn)品都各不相同，故在實際應(yīng)用上，能針對樣品的不同而選擇合適 的生物素檢測方法也是至關(guān)重要的。
[0006] 常用的生物素檢測方法有很多，主要包括微生物法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫 法、突光法等。
[0007] 其中微生物的方法是目前應(yīng)用比較廣泛的方法，也是嬰幼兒食品和乳品中游離生 物素國標(biāo)檢測方法中唯一的檢測方法，這個方法主要用于檢測樣品中生物素含量較少的情 況，原理是利用生物素營養(yǎng)缺陷型菌株對生物素的特異性和靈敏性，定量測定出試驗中待 測物質(zhì)的含量。在含有除待測物質(zhì)以外的所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，微生物的生長與待測 物質(zhì)含量呈線性關(guān)系，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，即可計算出試樣中待測物質(zhì) 的含量。
[0008] 選用上述傳統(tǒng)的檢測方式，此方法雖然靈敏度高，但該方法工作量大，在用分光光 度計讀數(shù)時要求漩渦混合后立即移入比色皿內(nèi)進(jìn)行讀數(shù)，并且要求每支試管的穩(wěn)定時間相 同，對操作者的熟練程度有較高的要求，一次最多能檢測1到3個培養(yǎng)管，檢測效率低，也會 增加誤差，費時費力，因此需要開發(fā)一種更簡便和實用的檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種簡便、高效的游離生物素的檢 測方法。
[0010] 本發(fā)明提供的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：利用植物乳桿 菌對游離生物素的特異性和靈敏性，通過游離生物素的濃度與菌體的生長量和生長速度成 正比的關(guān)系，根據(jù)吸光值與工作曲線進(jìn)行比較，即可算出試樣中待測物的濃度；其中，吸光 值為采用酶標(biāo)儀測量培養(yǎng)后的液體獲得的吸光度。
[0011] 其中，本發(fā)明提供的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其植物乳桿菌為 ATCC8014。
[0012] 另外，本發(fā)明提供的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，還具備這樣的特點， 艮P、具體分析步驟如下所示：步驟一、接種菌懸液的制備；步驟二、樣品的處理；步驟三、標(biāo) 準(zhǔn)曲線的制作；步驟四、待測液的制作；步驟五、滅菌；步驟六、接種；步驟七、培養(yǎng)；步驟八、 分析測試；其中，在步驟七中將試管放入培養(yǎng)箱內(nèi)，36°c±1°C培養(yǎng)19h?20h。
[0013] 此外，在上述步驟八中具體地，包括如下測試程序：
[0014] (1)、對每支試管進(jìn)行視覺檢查，接種空白試管S1內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，若出現(xiàn)渾 濁，則結(jié)果無效；
[0015] (2)、以接種空白孔S1做對照，測定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的吸光度，兩小時后重 新測定，兩次結(jié)果透光率差值若小于2%，則取出全部檢驗管測其吸光度A;
[0016] (3)、以接種空白試管S2為空白，調(diào)節(jié)吸光度為0, 一次讀出其他每支試管的吸光 度A，樣品空白的吸光度A-并讀出；
[0017] (4)、充分混合每一支試管后，立即將培養(yǎng)液移入96孔板中，每孔200uL，每個試管 讀數(shù)前搖勻樣液，于660nm波長下讀吸光值；
[0018] 上述混合過程，優(yōu)選用漩渦混合器充分混合每一支試管，之后還可根據(jù)需要加入 一滴消泡劑。
[0019] (5)、對每個編號的待測液孔，用每個孔的吸光度值計算每毫升該編號待測液生物 素的含量，并計算該編號待測液的生物素含量平均值。每支試管測得的該濃度不得超過該 平均值的±15%，超過者要舍去，如果符合該要求的孔少于所有四個編號待測液總孔數(shù)的 2/3,需要重新檢驗；如果符合該要求的孔數(shù)大于等于原來孔數(shù)的2/3,重新計算每一編號 的有效試樣孔中每毫升測定液生物素含量的平均值，以此平均值計算全部編號試樣孔的總 平均值，用于計算試樣中的生物素含量。
[0020] 上述方法主要應(yīng)用于測定嬰幼兒食品和乳品中的游離生物素。
[0021]本發(fā)明的作用和效果
[0022] 本發(fā)明提供了一種檢測生物素含量的方法。主要是對"GB5413. 19-2010嬰幼兒食 品和乳品中游離生物素的測定"方法進(jìn)行了改進(jìn)發(fā)明，用96孔板代替?zhèn)鹘y(tǒng)的比色皿進(jìn)行讀 數(shù)，在讀數(shù)時可以省去單支試管逐一讀數(shù)所用的時間，減少誤差，使該方法操作更簡便和準(zhǔn) 確，節(jié)省人力和物力。
[0023]另外，本發(fā)明無須特別的培養(yǎng)方式即可施行，操作簡單，限定條件少。
[0024] 此外，還限定了具體的分析條件等參數(shù)，能夠更為準(zhǔn)確、快捷的測定嬰幼兒食品中 的游離生物素。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 附圖1為分光光度計法測定讀數(shù)曲線；
[0026] 附圖2為酶標(biāo)儀測定讀數(shù)。

【具體實施方式】
[0027] 1、范圍
[0028] 本方法適用于嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定。
[0029] 2、原理
[0030] 利用植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum)對游離生物素的特異性和靈敏性， 定量測定出試樣中待測物質(zhì)的含量。在含有除待測物質(zhì)以外所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中，微 生物的生長與待測物質(zhì)含量呈線性關(guān)系，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，即可計算 出試樣中待測物質(zhì)的含量。
[0031] 3試劑和材料
[0032] 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的二級水。
[0033]3. 1 菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum)，ATCC8014。
[0034] 3. 2 生物素（d-Biotin或VitaminH)標(biāo)準(zhǔn)品（C1QH16N203S):純度彡 99%。
[0035] 3. 3培養(yǎng)基
[0036] 3. 3. 1乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基。
[0037] 3. 3. 2乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基。
[0038] 3.3.3生物素測定用培養(yǎng)基。
[0039] 注：一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。
[0040] 3. 4 乙醇溶液（50% )。
[0041] 3. 5硫酸溶液（3% ):量取3mL硫酸加入到水中，定容至100mL。
[0042] 3. 6氫氧化鈉溶液（2. 0mol/L):稱取80g氫氧化鈉溶于1000mL水中。
[0043] 3. 7氯化鈉溶液（9g/L):稱取9. 0g氯化鈉溶解于1000mL水中，分裝試管，每管 lOmLo121。。滅菌 15min。
[0044] 3.8標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
[0045] 3. 8. 1生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（100yg/mL):稱取生物素標(biāo)準(zhǔn)品（3. 2)用乙醇溶液 (3.4)定容至生物素濃度為100iig/mL，貯于冰箱中。
[0046] 3. 8. 2生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（1yg/mL):吸取lmL生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（3. 8. 1)，用乙 醇溶液（3. 4)定容至100mL。
[0047] 3. 8. 3生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液（10ng/mL):吸取lmL生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（3. 8. 2)，用乙 醇溶液（3. 4)定容至100mL。
[0048] 3. 8. 4標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液分兩個濃度，高濃度溶液的濃度為0. 2ng/mL;低濃度溶液 的濃度為〇.Ing/mL。從工作液中（3. 8. 3)吸取兩次各5mL，用水分別定容到250mL和500mL。
[0049] 注：所有標(biāo)準(zhǔn)溶液要儲存于冰箱內(nèi)。3. 8. 1、3. 8. 2、和3. 8. 3保存期三個月，3. 8. 4 臨用前配制。
[0050] 4、儀器和設(shè)備
[0051] 除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：
[0052] 4. 1 天平：感量為0?lmg。
[0053] 4. 2pH計：精度彡 0? 02。
[0054] 4.3分光光度計。
[0055] 4.4渦旋混合器。
[0056] 4. 5離心機：轉(zhuǎn)速彡2000轉(zhuǎn)/分鐘。
[0057] 4. 6 恒溫培養(yǎng)箱：36°C± 1 °C。
[0058] 4. 7 冰箱：2°C?5°C。
[0059] 4. 8無菌吸管：10mL(具0?lmL刻度）或微量移液器或吸頭。
[0060] 4. 9 瓶口分液器：0mL?10mL。
[0061] 4. 10 錐形瓶：200mL。
[0062] 4. 11 容量瓶（A類）：100mL，250mL，500mL。
[0063] 4. 12單刻度移液管（A類）：容量5mL。
[0064] 4. 13 漏斗：直徑 90mm。
[0065] 4. 14定量濾紙：直徑90_。
[0066] 4. 15 試管：18mmX180mm。
[0067] 4. 16 96 孔板。
[0068] 4. 17 酶標(biāo)儀。
[0069]注：玻璃儀器使用前，用活性劑（月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即 可）對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗，清洗之后在200°C干熱2h。
[0070] 5、分析步驟
[0071] 5. 1接種菌懸液的制備
[0072] 5. 1. 1將凍干菌株（3. 1)活化后，轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（3.3. 1)中， 36°C±1°C培養(yǎng)過夜。再轉(zhuǎn)接2?3代來增強活力。然后再將其從固體培養(yǎng)上轉(zhuǎn)接到乳酸 桿菌肉湯培養(yǎng)基（3. 3. 2)中培養(yǎng)。
[0073] 5. 1. 2將乳酸桿菌肉湯中的培養(yǎng)液以2000轉(zhuǎn)/分鐘離心2min?3min，傾出上清 液，加入10mL氯化鈉溶液（3. 7)，混勻，再離心2min?3min，如此清洗3次?4次，吸適量 該菌懸液于10mL鹽水（4. 7)中，待測。
[0074] 5. 1.3用分光光度計以氯化鈉溶液（3.7)做空白，于550nm波長下測菌懸液 (5. 1. 2)的透光率，使其透光率在60%?80%之間。
[0075] 5.2樣品的處理
[0076] 5. 2. 1干粉樣品
[0077] 稱取一定量樣品（精確至O.OOOlg)于250mL三角瓶中，該樣品應(yīng)含0.2iig? 0. 5iig生物素。繼續(xù)5. 2. 3步驟。
[0078] 5.2.2液體樣品
[0079] 吸一定量的液體樣品于250mL三角瓶中，該樣品應(yīng)含0.g?0.g生物素。繼 續(xù)6. 2. 3步驟。
[0080] 5.2.3樣品的提取
[0081] 加入硫酸溶液（3. 5) 100mL，121°C水解30min，冷卻后用氫氧化鈉溶液（3. 6)調(diào)節(jié) pH至4. 5 ±0. 2，定量轉(zhuǎn)到250mL容量瓶中，用水定容，充分混合。用濾紙過濾，棄去最初的 幾毫升。吸取濾液5mL，加入約20mL水，用氫氧化鈉溶液（3. 6)調(diào)pH為6. 8 ±0. 2,定量轉(zhuǎn) 至lj100mL容量瓶中，用水定容。
[0082] 5.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
[0083] 按表1順序加入已滅菌的水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（3. 8. 4)和生物素測定用培養(yǎng)基 (3.3.3)于培養(yǎng)管中，一式三份。
[0084]表1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

【權(quán)利要求】
1. 一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：利用植物乳桿菌對游離生物素 的特異性和靈敏性，通過游離生物素的濃度與菌體的生長量和生長速度成正比的關(guān)系，根 據(jù)吸光值與工作曲線進(jìn)行比較，即可算出試樣中待測物的濃度； 其中，所述吸光值為采用酶標(biāo)儀測量培養(yǎng)后的液體獲得的吸光度。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：所述植物 乳桿菌為ATCC8014。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于，具體分析 步驟如下所示： 步驟一、接種菌懸液的制備； 步驟二、樣品的處理； 步驟三、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作； 步驟四、待測液的制作； 步驟五、滅菌； 步驟六、接種； 步驟七、培養(yǎng)； 步驟八、分析測試。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：所述步驟 八中包括如下測試程序：步驟七中所述的培養(yǎng)步驟為將試管放入培養(yǎng)箱內(nèi)，36°C ±1°C培 養(yǎng) 19h ?20h。
5. 如權(quán)利要求3所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：所述步驟 八中包括如下測試程序： (1) 、對每支試管進(jìn)行視覺檢查，接種空白試管S1內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，若出現(xiàn)渾濁， 則結(jié)果無效； (2) 、以接種空白孔S1做對照，測定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的吸光度，兩小時后重新測 定，兩次結(jié)果透光率差值若小于2%，則取出全部檢驗管測其吸光度A ; (3) 、以接種空白試管S2為空白，調(diào)節(jié)吸光度為0, 一次讀出其他每支試管的吸光度A， 樣品空白的吸光度A-并讀出； (4) 、充分混合每一支試管后，立即將培養(yǎng)液移入96孔板中，每孔200uL，每個試管讀數(shù) 前搖勻樣液，于660nm波長下讀吸光值； (5) 、對每個編號的待測液孔，用每個孔的吸光度值計算每毫升該編號待測液生物素的 含量，并計算該編號待測液的生物素含量平均值。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：每支試 管測得的該濃度不得超過該平均值的± 15 %，超過者要舍去，如果符合該要求的孔少于所 有編號待測液總孔數(shù)的2/3,需要重新檢驗；如果符合該要求的孔數(shù)大于等于原來孔數(shù)的 2/3,重新計算每一編號的有效試樣孔中每毫升測定液生物素含量的平均值，以此平均值計 算全部編號試樣孔的總平均值，用于計算試樣中的生物素含量。
7. 如權(quán)利要求5所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：用漩渦混 合器充分混合每一支試管。
8. 如權(quán)利要求7所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：充分混合 后還可加入一滴消泡劑。
9.如權(quán)利要求1-8任一所述的一種高靈敏度測試游離生物素的方法，其特征在于：用 于測定嬰幼兒食品和乳品中的游離生物素。
【文檔編號】G01N21/31GK104330288SQ201410331877
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】胡國華, 嚴(yán)婷 申請人:普研（上海）標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司