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高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識別方法
【專利摘要】本發明涉及一種高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識別方法，屬于生物分子識別【技術領域】。本發明主要針對基于抗原－抗體、細胞因子－細胞因子受體、生物活性肽－受體、生物素－親和素、手性分子等系統構成的免疫標記生物分子檢測、監測和識別方法。以超順磁的磁性粒子和高性能磁傳感器構成生物分子探針和探測系統。其可以應用于生物、醫藥和食品安全等應用領域，可以進行生物分子識別、檢測和監測；臨床疾病診斷；食品安全檢測；病毒和細菌檢測。
【專利說明】高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識別方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及一種高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識別方法，屬于生物分子識別【技術領域】。其可以應用于生物、醫藥和食品安全等應用領域，可以進行生物分子識別、檢測和監測；臨床疾病診斷；食品安全檢測；病毒和細菌檢測。
[0003]
【背景技術】
[0004]生物分子識別在RNA鏈識別，基因檢測，細菌診斷，新的藥物發現，DNA缺陷及生物戰中致命毒劑，食品安全和以惡性腫瘤為代表的重大疾病的早期診斷檢測等方面有著廣泛的應用。隨著人類基因圖的完成，對過去大量未知基因鏈信息的了解已成為可能。生物分子識別和檢測已從科學研究的領域擴展至我們現代人類社會的每一個角落。
[0005]無標記和免疫標記是生物分子檢測的兩種主要的方法。無標記技術直接測量生物分子的質量和介電性能，從而避免了生物分子的修飾。電荷、折射率、電化學氧化和質譜是無標記生物分子檢測常用的測量手段，其中生物質譜技術是最具有廣泛應用前景的無標志物生物分子檢測技術。然而，生物質譜技術在多種生物標志物的分子量非常接近的情況，通過質譜儀直接測量全段標志物分子的質量并不能實現可靠的分子識別。根據需要，質譜還常將某個肽離子經過誘導碰撞碎裂成為更小的碎片離子，通過測量這些碎片離子的質荷比和強度，獲得二級或串聯質 譜。此外質譜檢測出來的蛋白質還需要傳統方法鑒定，小分子量標志物分子的檢測難度大，影響因素較多和敏感度相對較低。
[0006]標記免疫分析是另一種高靈敏度、高特異性生物分子檢測技術。因其具有許多獨特優點，已成為生物分子檢驗的重要技術手段。目前生物分子標記技術主要有抗原一抗體、細胞因子一細胞因子受體、生物活性肽一受體、生物素一親和素系統等靶向系統。通過不同的靶向途徑，可以將示蹤劑精確地導向生物分子，從而提高生物分子檢靈敏度。由于大多數生物分子的含量甚微，標記生物分子檢測的最大挑戰和關鍵在于能否擁有探測到極小濃度甚至單生物分子的超高靈敏度的診斷科學和技術。
[0007]常見的標記生物分子識別方法是光或電生物信號探測。電生物分子識別技術是轉換生物識別過程到一個電信號的探測，通常電流、電阻、電抗及電容的變化。大多數電生物敏感器利用電化學反應來實施信號傳遞。酶分子標識是最常見的用于電化學生物傳感器方法。當用酶標識的分子連接被探測生物分子時，由于氧化還原反應產生一個電流，借助于可探測的電流及電流的大小來識別生物分子與生物分子的量。電生物探測的一個巨大優勢是它能利用現有的集成電路，特別是場效應晶體管(FET)來測量電信號，然而至今的實驗表明，即使運用高靈敏納米FET或碳納米管，仍不能探測發自于10 pi以下生物分子的信號，所以生物分子探測需要更高靈敏度及準確的識別方法。
[0008]用熒光分子或熒光納米晶體標識生物分子和半導體量子點，其探測過程是可見的。直接、簡單和可見的探測過程是生物分子光標識及探測的最大優點。通過探測光的波長及強度來確定被探測的生物分子是否存在及量的大小。然而光標識方法探測生物分子有著固有的缺點，即光致脫色及串活干擾。若勵激激光太強，光對熒光分子的損傷引起熒光特性的丟失，從而檢測失效。同樣光對熒光分子的勵激，由于雜質及背景的存在，可能產生一個寬的光譜，引起串活干擾。最后，用于熒光探測的激光掃描系統通常體積大、速度慢而且價格昂貴，不能滿足針對社區醫療、農村基層醫療與家庭對重大疾病快速早期診斷和食品安全大規模篩查的需求。
[0009]

【發明內容】

[0010]本發明在思路、材料、器件、技術途徑等多個方面均具有明顯的獨創性。首先在思路上，充分發揮磁技術的優勢。磁分子探針、磁傳感探測器、標識分子的磁分離、磁流體器件采用全新的“磁”技術。在材料采用方面，大磁矩超順磁納米粒子材料，磁傳感器包括量子隧穿傳感材料，新的磁粒子和磁傳感表面的包裹和生物功能化材料都是全新和系統的引入。在生物分子識別和檢測模式上，提出以磁傳感器為核心的單分子高靈敏檢測技術，將突破以光、聲、影為主要生物分子識別和檢測技術的局限性，開辟全新的磁生物分子識別和檢測技術。本發明主要針對基于抗原一抗體、細胞因子一細胞因子受體、生物活性肽一受體、生物素一親和素、手性分子等系統構成的免疫標記生物分子檢測、監測和識別方法。以超順磁的磁性粒子和高性能磁傳感器構成生物分子探針和探測系統。
[0011]本發明的目的是提供了一種高通量多通道低豐度多通道生物分子的磁傳感識別方法，包括如下步驟:
第I步、磁納米粒子的表面修飾:在磁納米粒子上包覆殼層，所述的殼層的材料是惰性金屬、高分子聚合物或者二氧化硅，得到表面修飾的磁納米粒子；
第2步、磁粒子的表面生物功能化:在第I步所得的表面修飾的磁納米粒子上包覆上鏈霉親和素，得到探測探針；
第3步、磁傳感器薄膜的沉積:利用薄膜真空沉積方法制作磁傳感器薄膜；
第4步、磁傳感器微納米制造:將磁傳感器薄膜制造成傳感器陣列，并在傳感器的兩端安裝釘扎層器件結構；
第5步、標定磁傳感器的磁電阻:對第4步制得的傳感器進行磁電阻的測定；
第6步、磁量子傳感器的表面修飾:在磁傳感器上依次進行金屬氧化物和高分子多表面層的修飾，再在高分子多層表面層上鍵合要檢測的生物分子抗原對應的抗體，得到鍵合抗體的磁量子傳感器；
第7步、生物分子與傳感器的偶聯:將設定濃度的需要檢測的生物分子作為抗原偶聯在第6步所得的磁量子傳感器的抗體上；
第8步、分析抗體與生物素的偶聯:將要檢測的生物分子抗原對應的抗體與生物素偶
聯；
第9步、將第8步得到的偶聯生物素的抗體與第7步所得的磁量子傳感器通過抗原-抗體結合，得到有抗體-抗原-生物素偶聯抗體的磁量子傳感器；
第10步、探測探針的偶聯:將第2步得到的探測探針偶聯至第9步中得到有生物素偶聯的抗體上；
第11步、偶聯和非偶聯磁性探針的磁分離:開啟磁場，將沒有和有生物素偶聯的磁量子傳感器偶聯的探測探針從傳感器表面分離；
第12步、標準曲線的繪制以及生物分子的測定:測定第11步所得的磁量子傳感器的磁電阻，與事先在第5步標定的磁電阻進行比較，得到來自磁探針的響應；
第13步、改變抗原的濃度，重復第7步-第12步，得到抗原的濃度與磁電阻值之間關系的標準曲線；
第14步、對待測樣本進行測定，通過標準曲線計算得到待測樣本中抗原的濃度。
[0012]本發明所述的生物分子包括:抗原一抗體、細胞因子一細胞因子受體、生物活性肽一受體、生物素一親和素、手性分子等生物分子。
[0013]生物素-親合素系統(BAS)，是七十年代后期發展起來的一種生物反應放大系統。二者具有高度的特異的親和性。生物素為小分子物質；親和素有卵白素(又稱親和素)和鏈親和素。生物素與親和素/鏈親和素之間的親和性，至少是抗原(Ag)抗體(Ab)間的一萬倍以，且不易受外界干擾，復合物穩定。二者均可偶聯蛋白質、核、多糖和酶等生物活性物質，同時還能與固相材料結合，通過這些特性可將它們偶聯起來。
[0014]生物素-親和素/鏈親和素既可偶聯生物大分子，又可連接標記材料。因此，該方法的應用范圍是具有抗原及其對應抗體的廣泛標本的檢測中，例如:可以用于對蛋白質、核酸、多糖、HBsAg, TP、HCV、HIV等生物大分子，也可將其應用于生物標記物的檢測，例如:對腫瘤標志物如前列腺癌(PSA, PAP)，乳腺癌(CA15-3，CA125, CA27.29，CEABRCA1,BRCA2, MUC-1, CEA, NY-BR-1, ING-1),白血病(Chromosomalabnormalities),睪丸癌(a -Fetoprotein (AFP), β -human chor1nic, gonadatropin, CAGE-1, ESO—1)，卵巢癌(CA125, AFP, hCG, p51, CEA),其他固體腫瘤(Circulating tumour cells in b1logicalfluids, express1n of targeted growth factor receptors),結腸癌和膜腺癌(CEA,CA19-9, CA24-2, p53),肺癌(NY-ESO-l, CEA, CA19-9, SCC, CYFRA21-1, NSE),黑素瘤(Tyrosinase, NY-ESO-l)，肝癌甲胎蛋白(AFP)，CEA,胃癌(CA72-4，CEA, CA19-9)，食道癌(SCC)，滋養層腫瘤(SCC, hCG)，膀胱癌(BAT, FDP, NMP22, HA-Hase, BLCA-4, CYFRA21-1)、前列腺特異性抗原(PSA)等的檢測，和對雌二醇、雌三醇、T3、T4、人促甲狀腺激素等激素類分子的檢測。該方法也可以應用于樣本中的細菌、農藥、激素等的檢測。在食品安全檢測中，可以對肉制品、水產品、乳制品、蜂蜜等動物源性食品中氯霉素，水產品、乳制品中蓖麻毒素B，魚、蝦等水產品中孔雀石綠，肉、食品中的膠質纖維蛋白，牛奶中的葡萄球菌，C2型腸毒素，蔬菜、水果中的氨基甲酸甲酯，肉或肉制品中的肉毒毒素B，畜禽、水產品、組織中的鹽酸克倫特羅，食糖、餅干、自制葡萄酒中的罌粟堿，哺乳動物口腔唾液、胃液、反流嘔吐等中的幽門螺桿菌，轉基因玉米、大豆中的CryI (Ab)和CP4-EPSPS蛋白，火鍋湯料，調料，涼皮中的阿片生物堿，米、面包、和餅干中的葡萄球菌等。
[0015]本發明中所述的磁納米粒子是指:超順磁性Fe3O4或者MFe2O4 (Μ是指Mn、Mg、Fe、Co、Ni或者Zn中的一種),或者是鐵磁性的金屬元素(例如Fe、Co、Ni)或者其合金(例如:FeCo、FeN1、CoNi和三元系(FeCoNi ))，本發明采用的磁量子顆粒具有小尺寸、單分散、窄尺寸分布、粒徑和形貌可控的其磁化強度和磁化率可調可控。目前已知和在商業上很容易獲得多種形式的磁納米粒子。示例包括在US-A-4554088和US-A-3917538中所述的氧化鐵顆粒、如在B1tec.和B1engr.XIX:101-124( 1977)中所述的氧化鎳顆粒、如在US-A-4732811中所述的包含磁顆粒的瓊脂糖-聚醛小球、DYNAL小球(商業上可獲得的、磁性聚苯乙烯涂覆的小球)、Magogel44 (磁性聚丙烯酰胺-瓊脂糖小球)、如在Clin.Chim.Acta.69:387-396(1976)中所述的ENZACRY (聚M苯二胺/氧化鐵)。包含氧化鐵顆粒的纖維素在Clin.Chem.26:1281-1284 (1980)中介紹，且白蛋白磁微球在 J.1MMUNOL.Methods53:109-122(1982)中介紹。磁多孔玻璃顆粒在W0-A-93/10162中介紹。Fe3O4是已知的和在商業上很容易獲得的磁納米粒子。MFe2O4磁納米粒子需要通過化學合成獲得。
[0016]本發明的超順磁性是指在無外加磁場時，超順磁性粒子無任何磁性是單相分離的納微米粒子，不會產生粒子集聚。當超順磁性粒子暴露在磁場時，超順磁性粒子發生磁化，產生磁偶極子。本領域的技術人員公知，一般情況下，在飽和磁化時，一克5納米超順磁性粒子具有45emu的磁動量和每一 5納米超順磁性粒子在飽和磁化下能在I微米的距離處產生3?4 Oe的邊緣場。
[0017]在第I步中，在磁納米粒子上包覆殼層的目的是為了實現穩定的磁性納米粒子的磁學特性、避免后續的化學和生物過程對磁粒子修飾和容易實現鏈酶親和素和磁性納米粒子的偶聯。所述的殼層的材料是可以選自惰性金屬、高分子聚合物或者二氧化硅等。這些包覆方法可以采用常規的化學方法實現。例如JfTriton X-100均勻混合，形成透明穩定的微乳液體系。再向其中加入Fe3O4，用超聲處理后取出上層液，攪拌使之均勻。加入濃氨水和正硅酸乙酯攪拌10小時。靜置沉淀，用乙醇清洗，將清洗后的粒子在高溫下鍛燒1-4小時，收集粒子，得到S12殼修飾的磁納米粒子。
[0018]第2步中，包覆鏈酶親和素的方法可以采用常規的生物分子偶聯方法。具體方法分為二個步驟:首先實現磁性粒子的氨基膠鏈，然后實現鏈霉親和素的偶聯。在惰性金屬、高分子或者氧化硅材料上的氨基膠鏈包覆的方法可采用共性的[N- (2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷](AEAPS)磁性納米粒子表面偶聯方法。具體方法為:取一定量的S12表面修飾的磁性納米粒子加入到一定量的甲醇和丙三醇的混合溶液中，超聲處理號；取一定量的AEAPS加入到混合溶液中，超聲處理使溶液混合均勻；在一定溫度下，反應2-3個小時，然后取出粒子用甲醇清洗和一定溫度下真空干燥兩小時，收集粒子。鏈霉親和素的偶聯的具體方法為:用去Rnase酶水配置PB緩沖液(磷酸鹽緩沖溶液)，然后進行高壓滅菌。將鏈霉親和素溶于PB溶液中，取一定量裝在EP管中。將修飾好氨基的粒子放入滅菌水中浸泡，用PB緩沖清洗后，再加入PB和超聲分散。以后將修飾好氨基的粒子PB懸濁液加入上述鏈酶親和素溶液，室溫下振蕩反應一定時間。反應完全后，向其中加入戊二醛培養。然后用PB緩沖液洗滌多次，最后將粒子分散在PB溶液中，40°C下保存待用。
[0019]本發明中所述的磁傳感器是指以下傳感器:各向異性磁電阻傳感器(Anisotropicmagnetic resistance, AMR)、電線圈感應傳感器(Coil inducted sensor)、巨磁阻傳感器(Giant Magnetoresistance,GMR)和自旋電子隧穿傳感器(Tunneling Magneto Resistance,TMR);從原理上來看，這些傳感器都能用于本發明的生物分子檢測。傳感器的選擇取決于實際生物分子檢測量對傳感器靈敏度的要求。在巨磁阻傳感器和自旋電子隧穿傳感器的器件結構設計中，為提高靈敏度、信號輸出和抑制傳感器噪聲，本發明在巨磁阻和自旋電子隧穿傳感器結構設計中在傳感器的兩端引入超晶格反鐵磁釘扎層。超晶格反鐵磁釘扎層由硬磁CoPt/Ru/CoPt材料構成，在退火磁化后，超晶格反鐵磁釘扎層提供強的磁釘場，其能夠釘著傳感器自由層中邊緣磁疇的旋轉、抑制薄膜磁噪聲從而增強傳感器信號，這些傳感器經優化后能提供足夠的供生物分子檢測的靈敏度。
[0020]第3步中，在磁傳感器上依次修飾上金屬氧化物和高分子材料的方法，是用等離子化學氣相沉積和化學方法形成。例如:首先用等離子化學氣相沉積方法在傳感器表面沉積金屬氧化物(Ti02、RuO2, Ta3O5等)，然后用聚烯丙基胺溶液化學反應方法沉積高分子1-乙基-3- (3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和N -羥基琥珀酰亞胺層。在磁傳感器上修飾抗體的方法可以采用常規的生物滴入、沖洗和偶聯。首先用移液器在傳感器表面滴入被測量抗原的抗體，在4°C溫度下停放12小時最后用封閉緩沖液沖洗兩次，并進一步在同一緩沖液中和在室溫下阻斷60分鐘。
[0021]第5步中，探測抗體與生物素偶聯的方法是采用常規的生物和化學反應方法:用無水DMSO配制生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。探測抗體用硼酸鹽緩沖配制適當濃度的抗體溶液，按比率將生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育。將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結合的生物素。
[0022]作為本方法的改進，可以在同一個檢測系統中設置針對多種目標分子的磁納米粒子探針以及修改的磁感應器，可以實現多種目標分子的同時檢測。
[0023]有益效果
本發明能極大的提高生物分子識別、檢測和監測的靈敏度同時實現高通量和多通道的即時、在位的檢測和監測。在檢測靈敏度上，本發明可以實現單生物分子的檢測；本發明構建高性能微納磁傳感器陣列(在標準化驗薄片上集成10000個器件，可參見圖8)可對多種生物分子同時進行多通道檢測；由于采用磁傳感檢測、磁分離器件、磁微流體器件、新的生物分子包裹和功能化和微弱電信號的檢測和處理器件，本發明極大的提高了檢測的效率，對100個標志物同時測量的時間〈10分鐘，實現高通量的生物分子識別、檢測和監測。
[0024]【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1是磁傳感生物分子檢測原理的示意圖；
圖2是生物分子識別和探測的磁傳感系統的總體結構；
圖3(a)和圖3 (b)是磁納米粒子表面修飾的示意圖,其中圖3 Ca)是指:磁納米粒子的表面用金屬、高分子聚合物或者二氧化硅的修飾，產生了修飾層，圖3 (b)是指:在磁納米粒子的修飾層上再進行表面生物功能化；
圖4是磁納米粒子和探測分子(抗體)的生物偶聯；
圖5是磁傳感器和超晶格反鐵磁釘扎層器件結構；
圖6是磁傳感器多層超薄金屬氧化物膜和高分子聚合物表面改性；
圖7是捕獲分子和傳感器表面的生物偶聯；
圖8是磁流體器件的系統結構；
圖9a是磁場開啟前的微型磁分離系統；
圖9b是磁場開啟后的微型磁分離系統 圖10超晶格反鐵磁釘扎層的傳感器系統
圖11實施例1中利用這種傳感器檢測乳腺癌生物標志物分子的結果(可檢測Femto M(10 15)濃度的分子)。
[0026]圖12實施例2中使用傳感器檢測大米中黃曲霉毒素(AFBl)的結果(可檢測NanoM(10_9)濃度的分子)。
[0027]
【具體實施方式】
[0028]實施例1:醫學應用:乳腺癌標志物分子CEA的檢測
整個的識別方法的原理示意圖可以如圖1，其顯示了各個無器件、抗體、抗原之前的連接修飾方式；整個步驟過程，如圖2所示；
第I步磁納米粒子的合成和表面修飾:
為改善磁粒子的化學穩定性和生物相容性，考慮三維空間結構、氫鍵、靜電力、疏水作用，本發明在磁納米粒子表面采用包裹惰性金屬、高分子聚合物以及二氧化硅殼層直接表面改性技術，使磁納米粒子表面具有化學穩定性和優異的生物相容性。本實施例中以Fe3O4磁性粒子為例，具體方法為稱取氯化亞鐵1.2 gFeCl2.4H20溶于60 mL超聲脫氣蒸餾水中，加入15 mL0.6 mo I/L的氯化鐵FeCl3.6H20水溶液。在60 °C、攪拌與超聲作用下，用噴霧器向溶液中噴入2 mol/L的氫氧化鈉NaOH溶液使pH值達到11?12，反應60 min，使所得Fe3O4微粒充分熟化。磁分離Fe3O4微粒并用蒸餾水清洗5次，攪拌，分散Fe3O4微粒于120mL水中，超聲震蕩15 min，加入油酸鈉水溶液，攪拌，于80 °C反應30 min,降溫至30 V，再加入十二烷基苯磺酸(SDBS)鈉水溶液，調節溶液pH值為7，再反應15 min后稀釋到250mL,超聲Imin ,冷卻，即得穩定的水基Fe3O4磁性粒子。
[0029]接下來，將Triton X_100(聚乙二醇辛基苯基醚)、正己醇、環己烷按體積比1:2:5的比例均勻混合，形成透明穩定的微乳液體系。再向其中加入0.5g的Fe3O4磁性粒子,用超聲處理6分鐘后取出上層液倒入三頸瓶中，攪拌30分鐘使之均勻。加入Iml濃氨水和3ml正硅酸乙酯30°C攪拌10小時。靜置沉淀，用乙醇清洗，將清洗后的粒子在400-700°C的條件下鍛燒1-4小時，收集粒子，得到S12殼修飾的磁納米粒子，如圖3 Ca)所示。
[0030]第2步、磁粒子的表面生物功能化:在第I步所得的S12殼修飾的磁納米粒子上包覆上鏈霉親和素，得到探測探針，首先實現磁性粒子的氨基膠鏈。包覆的方法采用[N-(2-氨基乙基)-3-氨基丙基三甲氧基硅烷](AEAPS)磁性納米粒子表面。
[0031]取20mgSi02表面修飾的磁性納米粒子加入到500mL的甲醇和丙三醇的混合溶液中，超聲30分鐘。用超聲波處理20-60分鐘；取50uL的AEAPS加入到混合溶液中，超聲處理10-60分鐘，使溶液混合均勻；在15-90°C的反應條件下，反應2-3個小時，然后取出粒子用甲醇清洗2-3次，一定溫度下真空干燥兩小時，收集粒子。
[0032]然后在磁性納米粒子上連接鏈酶親和素。具體方法為用去Rnase酶水配置PB緩沖液(磷酸鹽緩沖溶液)(0.lmol/L,PH=7.0)，進行高壓滅菌。將0.5mg的鏈霉親和素(上海生工)溶于0.5mL的PB溶液中，取50 μ L裝在EP管中。將5mg修飾好氨基的粒子放入滅菌水中浸泡，用PB緩沖清洗3次后，再加入ImL PB,超聲分散10 min。將修飾好氨基的粒子PB懸濁液500 μ L，加入50 μ L的上述鏈酶親和素溶液，室溫下振蕩反應24h。反應完全后，向其中加入I mL的戊二醛培養兩小時。用PB緩沖液洗滌清洗4次，每次用量為I mL，最后將粒子分散在I mL的PB溶液中，40°C保存待用。[0033]整個修飾完成后的結構如圖3(b)所示。
[0034]第3步、磁量子傳感器陣列的制造:在磁傳感器上依次進行金屬氧化物和高分子多層表面層的修飾，再在高分子多層表面層上鍵合需要檢測的生物分子對應的抗體，得到修飾后的磁量子傳感器；金屬氧化物的表面修飾薄膜和磁傳感器多層膜的沉積是用同一PVD (物理氣相沉積)連續沉積的。金屬氧化物層可以是Ti02、Ta305、Ru0等。
[0035]具體的磁各向異性磁電阻傳感器、電線圈感應傳感器、巨磁阻傳感器(GMR)和自旋電子隧穿傳感器(TMR)和金屬氧化物薄膜的具體制作過程是:(1)磁各向異性電阻傳感器:利用磁控濺射在清洗過的熱氧化二氧化硅單晶硅片上沉積100納米磁性材料(N1、Co、Fe、Mn、NiFe, CoFe, NiMn, CoMn, NiFeCoJP NiCoMn)，以后用化學氣相沉積方法沉積T12 (30nm)層，做后利用半導體工藝將磁各向異性薄膜微制造成120X120微米的微傳感器陣列；(2)電線圈感應傳感器:利用電鍍的方法在化學清洗過的熱氧化二氧化硅單晶硅片上沉積I微米的非磁性的金屬薄膜(Cu、Au、Ag、Al等)，然后在利用半導體工藝將非磁性的金屬薄膜微制造成直徑為100微米的微線圈后，用化學氣相沉積方法在微線圈上沉積T12 (30nm)層。最后用半導體工藝制作120X120微米的微傳感器陣列；(3)巨磁阻傳感器(GMR)和金屬氧化物薄膜:在清洗過的熱氧化二氧化硅單晶硅片上，通過磁控濺射(Veeco, CMY PVD)依次沉積 CoFe (5nm) /IrMn (7nm) /CoFe (2.5nm) /Ru (8.4nm) /NiFe (3.5nm) /Ta (5nm) /Ru (1nm) /Ta (20nm),以后用化學氣相沉積方法沉積T12 (30nm)層；然后利用利用半導體工藝技術同步形成幾十或幾百微米尺寸的微傳感器陣列和在每個微傳感器兩側導入超晶格反鐵磁釘扎層器件結構，其結構如圖5所示，最終將GMR薄膜微制造成微傳感器件陣列。(4)自旋電子隧穿傳感器(TMR)和金屬氧化物薄膜:利用Anelva磁控濺射設備依次沉積作 NiFe (I μ m)/CoFe (2.5nm) /IrMn (5nm) /CoFe (2.lnm) /Ru (0.84nm) /CoFe (2.3nm) /Mg (0.2nm) /MgO (2.5nm) /MgO (0.3nm) /CoFe (2.lnm) /NiFe (2.5nm) /Ta (4.5nm) /Ru (12nm) /Ta (6nm) /T12 (30nm)超晶格TMR結構和金屬氧化物層，T12層是專為生物功能化的金屬氧化物層；然后利用利用半導體工藝技術同步形成幾十或幾百微米尺寸的微傳感器陣列和在每個微傳感器兩側導入超晶格反鐵磁釘扎層器件結構，最終將TMR薄膜微制造成120X120微米的微傳感器件陣列。
[0036]120X120微米尺寸的AMR傳感器具有250歐姆的電阻和在100 Oe磁場下產生1.5%的磁電阻變化；相同尺寸的GMR微傳感器具有700歐姆的電阻和在100 Oe磁場下產生7%的磁電阻變化。TMR微傳感器具有30K歐姆的電阻和在100 Oe磁場下產生45%的磁電阻變化。最后在傳感器的電極引線被電子束蒸發的三層(S1 20nm/Si3N4 50nm/Si0 20nm)鈍化膜所保護后，微傳感器被移至進一步的表面化學和生物功能化處理。
[0037]金屬氧化物層和高分子層修飾的目的是消除其他化學生物環境對靶分子與目標分子相互作用的干擾，實現對靶分子的特異性相互作用，實現捕獲抗體分子和感應器表面的直接鍵合。
[0038]在對傳感器陣列上進行高分子修飾之前，需要測量表面修飾前的傳感器的磁電阻。
[0039]第4步、磁量子傳感器的表面修飾:在高分子層上鍵合檢測生物分子抗原對應的抗體的方法是:本實施例中采用GMR傳感器，在該傳感器T12表面先用丙酮、甲醇、異丙醇清洗，并隨后暴露于氧等離子體3分鐘。在Mill1-Q純凈水(經0.22 μ m孔隙的濾膜過濾，電阻率?18.2ΜΩ.cm，25°C)加入2% (重量/體積)聚烯丙基胺溶液。傳感器陣列侵泡在溶液里5分鐘后用Mill1-Q水漂洗三次和150 °C烘烤45分鐘。然后在傳感器表面用移液器滴入10% (重量/體積)1-乙基-3- (3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和10% (重量/體積)N -羥基琥珀酰亞胺溶液，在室溫下放置I小時后，該傳感器陣列在40°C溫度下干燥和形成制備好的高分子生物功能化的表面，整個修飾完成的傳感器及表面結構如圖6所示。
[0040]第5步、捕獲抗體與傳感器表面鍵合的化學方法:用移液器在傳感器表面分三次(每次360pL)滴入總數InL的CEA抗原的抗體，(從美國R & D system Inc.或中國上海生物化學購買)用移液器在傳感器表面分三次(每次360pL)滴入總數InL的CEA捕獲抗體。在控制傳感器部分(沒有捕獲抗體的傳感器)用移液器滴入50mL牛血清白蛋白(bovineserum albumin, BSA)。傳感器芯片然后在4°C溫度下停放12小時最后用封閉緩沖液(I %BSA和0.2% Tween 20加入PBS)沖洗兩次，并進一步在同一緩沖液中和在室溫下阻斷60分鐘。傳感器表面的偶聯方式一般是放上抗原或抗體、細胞因子或細胞因子受體、生物活性肽或受體、生物素或親和素，抗原一抗體、細胞因子一細胞因子受體、生物活性肽一受體、生物素一親和素。
[0041]第6步、檢測分子的生物偶聯:將需要檢測的生物分子的抗原偶聯在第5步所得的抗體上；具體步驟為:被測試生物分子乳腺癌抗原(CEA)分子(從美國R & D system Inc.或中國上海生物化學購買)首先以PBS緩沖液中稀釋到所需濃度。用移液器滴入20 μ L該分子溶液至傳感器芯片表面并在室溫下孵育I小時，接著，芯片用封閉緩沖液(I % BSA和
0.2% Tween 20加入PBS)漂洗兩次。
[0042]第7步、探測分子的生物偶聯:先將探測分子的抗體與生物素偶聯:以后與檢測生物分子的抗原偶聯，形成抗體-抗原-抗體(含有生物素)的三明治結構。首先制備生物素和抗體連接:用無水DMSO配制10mg/ml生物素N-輕基琥拍酰亞胺酯溶液。乳腺癌胚CEA抗原對應的抗體(上海卡努生物科技有限公司)用硼酸鹽緩沖(0.lmol/L, pH8.8)配制濃度至少為I?3mg/ml的抗體溶液，若抗體儲存時加入了疊氮鈉，則標記前須先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉。按25?100 μ g/mg的比率將生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液加入抗體中，混合均勻并在室溫下孵育4小時。在完成結合反應之前DMSO的終濃度不能低于5%，否則生物素酯會出現沉淀。高濃度的生物素酯會導致多個生物素分子結合在抗體上，因此可能會使所有抗體都被標記。較低的比率則會是使生物素化保持在最低限度(25 μ g生物素酯/mg抗體的最初摩爾比為10:1)。每250 μ g生物素酯內加入20 μ mol/L的氯化銨，室溫孵育10分鐘。將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結合的生物素。由于生物素分子較大，故透析比預料中的要慢，或者用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體。按純化抗體的儲存方法保存標記抗體。
[0043]再將生物素偶聯抗體與磁感應器上的抗原連接。具體的方法是:將生物素偶聯抗體首先以PBS緩沖液中稀釋到所需濃度。用移液器滴入10 μ L該分子溶液至感應器表面并在室溫下孵育I小時，接著，芯片用封閉緩沖液(I% BSA和0.2% Tween 20加入PBS)漂洗三次。
[0044]第8步、探針分子的生物偶聯:第2步產生的帶有鏈霉親和素的磁性探針和第7步中帶有生物素的抗體偶聯，形成抗體-抗原-抗體(生物素)-磁性針(鏈霉親和素)結構，如圖4所示。具體過程為:鏈酶親和素連接的磁性納米粒子(50/μυ放入磁和水混合的流體系統。磁流體系統循環速率約100ml/min。10分鐘后，磁流體系統停止運行，磁納米粒子在室溫下和無攪拌下孵育20分鐘。這樣完成了在磁量子傳感器上抗體-抗原-抗體=生物素-鏈霉親和素=探測磁性粒子的生物偶聯，如圖7所示。
[0045]第9步、偶聯和非偶聯磁性探針的磁分離:開啟磁場,加電流200mA，產生100e的磁場，沒有和抗體(生物素)偶聯-的磁性針(鏈霉親和素)從磁量子傳感器表面分離出去。在磁量子傳感器表面只留下實現了抗體-抗原-抗體(生物素)_磁性針(鏈霉親和素)偶聯的磁性粒子。應用外加磁場進行未偶聯和偶聯磁探針的分離是一種簡易的物理方法，其優勢是避免傳統化學飄洗帶來的對磁性粒子的化學腐蝕和磁學性能的損傷。
[0046]第10步、傳感器檢測:開啟掃描磁場，測試擁有抗體-抗原-抗體(生物素)_磁性針(鏈霉親和素)偶聯的傳感器和控制傳感器的磁電阻。通過比較得出傳感器的信號強度和生物分子量的大小。
[0047]利用這種方法，可實現fL (10_15 molar)量級的CEA檢測，在5個不同的傳感器芯片上和連續5次的測量，獲得小于1%精確性。利用這種方法檢測的結果如圖11所示。
[0048]在圖11中，橫坐標是CEA抗原的濃度，單位是Log (摩爾分數)，縱坐標是GMR傳感器的輸出電壓，單位是Log (電壓(毫伏))，從圖中可以看出，在該濃度范圍內，抗原濃度與輸出電壓的對數值，呈一定的線性關系，可以通過該方法對該CEA抗原進行識別以及定量分析。
[0049]實施例2:食品安全應用:大米中黃曲霉毒素(AFBl)含量的檢測 第I步磁納米粒子的合成和表面修飾:與實施例1第I步相同。
[0050]第2步、磁粒子的表面生物功能化:與實施例1第2步相同。
[0051]第3步、磁量子傳感器陣列的制造:與實施例1第3步相同，但傳感器陣列的尺寸為 50x50 微米(μπι)。
[0052]第4步、磁量子傳感器的表面修飾:與實施例1第4步相同。
[0053]第5步、捕獲抗體與傳感器表面鍵合的化學方法:用移液器在傳感器表面滴入50nL的AFBl抗原的抗體，(美國，Sigma - Aldrich, St.Louis, MO,購買),在控制傳感器部分用移液器滴入50mL牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)?傳感器芯片然后在4°C溫度下停放12小時最后用封閉緩沖液(1% BSA和0.2% Tween 20加入PBS)沖洗兩次，并進一步在同一緩沖液中和在室溫下阻斷60分鐘。
[0054]第6步、檢測分子的生物偶聯:用將黃曲霉毒素AFBl的標準品(美國，Sigma-Aldrich, St.Louis, MO,購買)配置成不同濃度的溶液，樣品通過搖動45分鐘，再并用PBS稀釋(溶液:PBS=1:5，V / V，體積比)。用移液器滴入20 μ L該樣品溶液至傳感器芯片表面并在室溫下孵育I小時，接著，芯片用封閉緩沖液(I% BSA和0.2% Tween 20加入PBS)漂洗兩次。
[0055]第7步、探測分子的生物偶聯:先將探測分子的抗體與生物素偶聯:以后與檢測生物分子的抗原偶聯，形成抗體-抗原-抗體(含有生物素)的三明治結構。首先制備生物素和抗體連接:用無水DMSO配制10mg/ml生物素N-羥基琥拍酰亞胺酯溶液。AFBl抗原的抗體，(美國，Sigma - Aldrich, St.Louis, MO,購買)用硼酸鹽緩沖(0.2mol/L, ρΗ8.6)配制濃度至少為I~3mg/ml的抗體溶液。按25~100 μ g/mg的比率將生物素N-羥基琥珀酰亞胺酷溶液加入抗體中，混合均勾并在室溫下鮮育4小時。在完成結合反應之如DMSO的終濃度不能低于5%，否則生物素酯會出現沉淀。高濃度的生物素酯會導致多個生物素分子結合在抗體上，因此可能會使所有抗體都被標記。較低的比率則會是使生物素化保持在最低限度(25 μ g生物素酯/mg抗體的最初摩爾比為10:1)。每250 μ g生物素酯內加入20μηιο1/L的氯化銨，室溫孵育10分鐘。將抗體溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結合的生物素。由于生物素分子較大，故透析比預料中的要慢，或者用蛋白A或蛋白G層析柱再次純化抗體。按純化抗體的儲存方法保存標記抗體。
[0056]再將生物素偶聯抗體與磁感應器上的抗原連接。具體的方法是:將生物素偶聯抗體首先以PBS緩沖液中稀釋到所需濃度。用移液器滴入10 μ L該樣品溶液至感應器表面并在室溫下孵育I小時，接著，芯片用封閉緩沖液(I% BSA和0.2% Tween 20加入PBS)漂洗三次。
[0057]第8步、探針分子的生物偶聯:第2步產生的帶有鏈霉親和素的磁性探針和第7步中帶有生物素的抗體偶聯，形成抗體-抗原-抗體(生物素)-磁性針(鏈霉親和素)結構。具體過程為:鏈酶親和素連接的磁性納米粒子(50/yL)放入磁和水混合的流體系統。磁流體系統循環速率約100ml/min。10分鐘后，磁流體系統停止運行，磁納米粒子在室溫下和無攪拌下孵育20分鐘。這樣完成了在磁量子傳感器上抗體-抗原-抗體=生物素-鏈霉親和素=探測磁性粒子的生物偶聯。
[0058]第9步、偶聯和非偶聯磁性探針的磁分離:開啟磁場,加電流200mA，產生100e的磁場，沒有和抗體(生物素)偶聯-的磁性針(鏈霉親和素)從磁量子傳感器表面分離出去。在磁量子傳感器表面只留下實現了抗體-抗原-抗體(生物素)_磁性針(鏈霉親和素)偶聯的磁性粒子。應用外加磁場進行未偶聯和偶聯磁探針的分離是一種簡易的物理方法，其優勢是避免傳統化學飄洗帶來的對磁性粒子的化學腐蝕和磁學性能的損傷，磁場開啟前后的磁傳感器的表面形式圖，如圖9a和圖9b所示，開啟磁場之后，未與磁傳感器結合的探針器件在流場中被分離。
[0059]第10步、傳感器檢測:開啟掃描磁場，測試擁有抗體-抗原-抗體(生物素)_磁性針(鏈霉親和素)偶聯的傳感器和控制傳感器的磁電阻。通過比較得出傳感器的信號強度和生物分子量的大小。
[0060]利用這種方法,可實現年nL (10_9 molar)量級的AFBl檢測，在5個不同的傳感器芯片上和連續5次的測量，獲得小于2%精確性。利用這種方法檢測的結果如圖12所示。
[0061]在圖12中，橫坐標是AFBl抗原的濃度，單位是Log(摩爾分數)，縱坐標是GMR傳感器的輸出電壓，單位是Log (電壓(毫伏))，從圖中可以看出，在該濃度范圍內，抗原濃度與輸出電壓的對數值，呈一定的線性關系和大的測量范圍。
[0062]樣品檢測:無污染的大米(從本地市場)研磨后，在渦旋混合器上混合后，加入5ml的溶劑(80%甲醇)，并分別摻入了 10nM、100nM、100nM濃度的黃曲霉毒素AFBl (美國，Sigma - Aldrich, St.Louis, MO,購買),樣品通過搖動45分鐘,混合,然后以5000rpm的速率離心10分鐘。將上清液小心地取出并用PBS稀釋(1:5，V/V，體積比)。用移液器滴入20 μ L該樣品溶液至第6步中的傳感器芯片表面并在室溫下孵育I小時，接著，芯片用封閉緩沖液(I % BSA和0.2% Tween 20加入PBS)漂洗兩次。再依同法進行檢測，代入標準曲線中計算加樣回收率，結果如表I所示。[0063]表1不同標準品加入量的條件下的檢測回收率
【權利要求】
1.一種高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識別方法，其特征在于，包括如下步驟: 第I步、磁納米粒子的表面修飾:在磁納米粒子上包覆殼層，所述的殼層的材料是惰性金屬、高分子聚合物或者二氧化硅，得到表面修飾的磁納米粒子； 第2步、磁粒子的表面生物功能化:在第I步所得的表面修飾的磁納米粒子上包覆上鏈霉親和素，得到探測探針； 第3步、磁傳感器薄膜的沉積:利用薄膜真空沉積方法制作磁傳感器薄膜； 第4步、磁傳感器微納米制造:將磁傳感器薄膜制造成傳感器陣列，并在傳感器的兩端安裝釘扎層器件結構； 第5步、標定磁傳感器的磁電阻:對第4步制得的傳感器進行磁電阻的測定； 第6步、磁量子傳感器的表面修飾:在磁傳感器上依次進行金屬氧化物和高分子多表面層的修飾，再在高分子多層表面層上鍵合要檢測的生物分子抗原對應的抗體，得到鍵合抗體的磁量子傳感器； 第7步、生物分子與傳感器的偶聯:將設定濃度的需要檢測的生物分子作為抗原偶聯在第6步所得的磁量子傳感器的抗體上； 第8步、分析抗體與生物素的偶聯:將要檢測的生物分子抗原對應的抗體與生物素偶聯； 第9步、將第8步得到的偶聯生物素的抗體與第7步所得的磁量子傳感器通過抗原-抗體結合，得到有抗體-抗原-生物素偶聯抗體的磁量子傳感器； 第10步、探測探針的偶聯:將第2步得到的探測探針偶聯至第9步中得到有生物素偶聯的抗體上； 第11步、偶聯和非偶聯磁性探針的磁分離:開啟磁場，將沒有和有生物素偶聯的磁量子傳感器偶聯的探測探針從傳感器表面分離； 第12步、標準曲線的繪制以及生物分子的測定:測定第11步所得的磁量子傳感器的磁電阻，與事先在第5步標定的磁電阻進行比較，得到來自磁探針的響應； 第13步、改變抗原的濃度，重復第7步-第12步，得到抗原的濃度與磁電阻值之間關系的標準曲線； 第14步、對待測樣本進行測定，通過標準曲線計算得到待測樣本中抗原的濃度。
2.根據權利要求1所述的高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識別方法，其特征在于，所述的生物分子是可以通過免疫學方法連接的生物大分子、生物標記物、細菌、激素或者農藥。
3.根據權利要求1所述的高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識別方法，其特征在于:所述的磁納米粒子是指:超順磁性Fe3O4或者MFe2O4,所述的M是指Mn、Mg、Fe、Co、Ni或者Zn中的一種；或者是鐵磁性的金屬元素或者其合金,所述的合金是指:FeCo、FeN1、CoNi或者 FeCoNi。
4.根據權利要求1所述的高通量多通道低豐度生物的磁傳感識別方法，其特征在于，所述的第2步中，是通過AEAPS磁性納米粒子表面偶聯方法進行鏈霉親和素的包覆。
5.根據權利要求1所述的高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識別方法，其特征在于:所述的磁傳感器是各向異性磁電阻傳感器、電線圈感應傳感器、巨磁阻傳感器或者自旋電子隧穿傳感器中的一種。
6.根據權利要求1所述的高通量多通道低豐度生物分子的磁傳感識別方法，其特征在于:第3步中，通過等離子化學氣相沉積法在磁傳感器上修飾金屬氧化物層；通過聚烯丙基胺溶液化學反應方法沉 積高分子層。
【文檔編號】G01N27/72GK104034881SQ201410213233
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月20日 優先權日:2014年5月20日
【發明者】章偉, 胡雪峰 申請人:南京益得冠電子科技有限公司