一種海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法
【專利摘要】本發明屬于水體硝酸鹽污染治理與控制【技術領域】，具體的說是一種海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法。利用無N2O還原酶活性的反硝化細菌將待測海水中硝酸鹽進行離線處理后轉化為氧化亞氮氣體，使用痕量氣體預濃縮裝置(Precon)-氣相色譜(GC)-同位素比質譜儀(MS)聯機進行氮氧穩定同位素的在線連續測定。本發明優化了反硝化細菌培養方法，改進培養基配方，不再添加硝酸鹽,培養效果更佳，細菌生長穩定，無需檢驗富集培養后的培養基是否殘留硝酸鹽，不會對后續樣品處理造成污染；該培養基細菌富集效果好，細菌培養周期短、效率高，并且降低了培養成本。
【專利說明】
一種海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于水體硝酸鹽污染治理與控制【技術領域】，具體的說是一種海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法。
【背景技術】
[0002]近幾十年來，隨著社會經濟的迅速發展和人類活動的加劇，工業、生活、農業活動產生的大量污染物進入近岸海域，導致我國近海海域氮營養鹽濃度嚴重超標，海域富營養化程度逐年嚴重，赤潮頻繁發生。因此，控制近海海域的氮污染，研究水體中氮的來源以及生物地球化學循環顯得尤為重要。
[0003]穩定同位素方法作為一門新興技術，已被廣泛應用于海洋學的研究。在海洋氮循環和海洋生物地球化學研究中，氮同位素有著不可替代的獨特作用。穩定氮同位素組成的變化可以示蹤氮的來源，判斷氮的生物地球化學過程，還可以作為河口海域富營養化程度的指示參數。因此，利用穩定氮同位素方法來研究海水體系中氮的遷移、轉化等環境生物地球化學過程，揭示其環境行為，具有重要的科學意義和現實意義。
[0004]為滿足質譜儀進樣要求，硝酸鹽氮氧同位素測定前需要對硝酸鹽進行預處理，目前常用的預處理方法有:高溫燃燒法、疊氮化鈉法、細菌反硝化法。高溫燃燒法利用陰離子交換樹脂吸附和富集no3_，不適用于成分復雜的海水樣品的預處理。疊氮化鈉法利用疊氮化物將N03_轉化為N2O,具有一定爆炸危險性。細菌反硝化法利用缺乏N2O還原酶的反硝化細菌將N03_轉化為N2O,通過質譜儀分析N2O的δ15Ν和δ180，前處理簡單易行、操作時間短、分析成本低、所需樣品量小，適用于海水樣品的硝酸鹽氮氧同位素測定。細菌反硝化法已在國外廣泛應用，目前國內反硝化法測定硝酸鹽氮氧同位素的應用很少，影響該方法在國內廣泛推廣的原因主要有:(I)反硝化細菌培養條件要求較為苛刻，培養不連續、不穩定均會影響樣品預處理結果；(2)國內外常用的反硝化細菌培養配方中添加了硝酸鹽，若細菌富集培養過程未消耗凈添加的硝酸鹽，會污染樣品，對樣品測定造成誤差。(3)N2O氣體的在線連續測定一般常用Tracegas或Gasbench進行氣體的預濃縮和分離,這些儀器價格較為昂貴，國內已購置這些儀器的單位較少，限制了該方法在國內的應用。
【發明內容】
[0005]本發明針對現有技術的不足，提供一種海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采用的技術方案為:一種海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法，利用無N2O還原酶活性的反硝化細菌將待測海水中硝酸鹽進行離線處理后轉化為氧化亞氮氣體，使用痕量氣體預濃縮裝置(Precon)-氣相色譜(GC)-同位素比質譜儀(MS)聯機進行氮氧穩定同位素的在線連續測定。
[0007]所述離線處理是將無N2O還原酶活性的反硝化細菌接種到牛肉膏蛋白胨培養液中，恒溫震蕩(30°C，120rpm)富集培養5_10天，待細菌生長旺盛后，將菌液離心，使得菌液濃度濃縮至富集培養后菌液濃度的10-20倍，震蕩混勻后加入抑泡劑(Sigma)，待用。
[0008]將上述離線處理后所得濃縮菌液置于樣品瓶中，樣品瓶倒置連接到曝氣裝置上，并通氦氣吹掃菌液及樣品瓶頂空氣3h，而后注入待測水樣使樣品中硝酸鹽氮含量為
0.2-20 μ g，倒置放于恒溫搖床20-30°C震蕩過夜培養，培養后離心并使用Precon-GC-MS聯機測定，得出N2O氮氧穩定同位素值。
[0009]另，將上述測定的氮氧同位素測試結果進行校正，使用多點校正法，取國際原子能標準品USGS32、USGS34以及USGS32和USGS34混合配制后的標準品共五個標準品，標準品與樣品一起進行同樣的離線處理并同一批次測定，使用五個標準品的測量值和真值建立標準曲線，對樣品測定結果進行校正。
[0010]所述無N2O還原酶活性的反硝化細菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，分類學命名為pseudomonas.chlororaphis subsp Aureofaciens (綠針假單胞菌金色亞種)，保藏編號為CGMCC1.3351。
[0011]所述固體牛肉膏蛋白胨培養基的配方為:2.5-3.5g牛肉膏，9.5-10.5g蛋白胨，
4.5-5.5g氯化鈉，14.5-15.5g瓊脂，1.0L去離子水；液體牛肉膏蛋白胨培養液的配方為:
2.5-3.5g牛肉膏，9.5-10.5g蛋白胨，4.5-5.5g氯化鈉，1.0L去離子水。
[0012]相對于現有技術，本發明具有以下優點:
[0013]1.本發明優化了反硝化細菌培養方法，改進培養基配方，不再添加硝酸鹽，培養效果更佳，細菌生長穩定，無需檢驗富集培養后的培養基是否殘留硝酸鹽，不會對后續樣品處理造成污染；該培養基細菌富集效果好，細菌培養周期短、效率高，并且降低了培養成本。
[0014]2.本發明首次針對Precon進行改造，實現了硝酸鹽氮氧穩定同位素的在線連續檢測。較國內外常用的tracegas和Gasbench的反硝化組件，Precon價格更低廉，降低了測試成本，推動了國內水體中硝酸鹽氮氧同位素測定方法的發展。
[0015]3.本發明提供的檢測方式可在線連續的測定，包括反硝化細菌的培養、樣品的預處理、樣品的在線連續檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為本發明實施例提供的加長進樣針。
[0017]圖2為本發明實施例提供的20mL頂空瓶進樣架。
[0018]圖3為本發明實施例提供的40mL頂空瓶進樣架。
[0019]圖4A和圖4B為本發明實施例1提供的硝酸鹽氮、氧穩定同位素的標準曲線。
[0020]圖5A和圖5B為本發明實施例2提供的硝酸鹽氮、氧穩定同位素的標準曲線。
【具體實施方式】
[0021]實施例1
[0022]1.反硝化細菌的富集培養
[0023]固體牛肉膏蛋白胨培養基的配方為:3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化鈉，15.0g瓊脂，1.0L去離子水。液體牛肉膏蛋白胨培養液的配方為:3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化鈉，1.0L去離子水。
[0024]配置固體牛肉膏蛋白胨培養基，高溫高壓滅菌制備固體平板。劃線接種無N2O還原酶活性的反硝化細菌，培養三天后，取單菌落接種至已滅菌的5mL液體牛肉膏蛋白胨培養液中，在搖床上30°C, 120rpm下繼續培養一天后,轉接至600mL已滅菌的液體牛肉膏蛋白胨培養液中30°C，120rpm下富集培養。
[0025]所述無N2O還原酶活性的反硝化細菌購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，分類學命名為pseudomonas.chlororaphis subsp Aureofaciens (綠針假單胞菌金色亞種)，保藏編號為CGMCC1.3351。
[0026]2.反硝化細菌的濃縮
[0027]將上述富集培養五天后的菌液于低溫離心機中18°C、7500g離心10分鐘。移除上層清液后，將離心后底層沉淀細菌加入至一定體積的新鮮已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養液，使得配置后菌液濃度為富集培養后菌液濃度十倍，而后菌體震蕩混勻，加入約0.5mL抑泡劑(Antiform B Emuls1n, Sigma)備用。
[0028]3.反硝化細菌及樣品瓶的凈化
[0029]取3mL上述濃縮菌液加入20mL頂空瓶中后，封緊頂空瓶。將樣品瓶倒置連接到曝氣裝置上，連接時曝氣裝置進氣針和出氣針均插入倒置的頂空瓶瓶口，進氣針置于液面內，出氣針置于液面上方頂空，通入氦氣吹掃3h，以除去液體及頂空中殘余的氧化亞氮，并使樣品瓶內充滿氦氣。
[0030]4.將樣品中的硝酸鹽轉化為N2O
[0031 ] 取凈化后樣品瓶，使用微量進樣器分別加入0.05mL200 μ mol/L的USGS32、
0.05mL200 μ mol/L 的 USGS34、0.05ml200 μ mol/L 的配置標準品 A (配置標準品 A 為四分之一體積的200 μ mol/L USGS32和四分之三體積的200 μ mol/L USGS34混合)、
0.05ml200 μ mol/L的配置標準品B (配置標準品B為二分之一體積的200 μ mol/L USGS32和二分之一體積的200 μ mol/L USGS34混合)、0.05ml200 μ mol/L的配置標準品C (配置標準品C四分之三體積的200 μ mol/L USGS32和四分之一體積的200 μ mol/L USGS34混合)，均設置三個重復樣。樣品瓶倒置放于恒溫搖床30°C過夜培養，細菌將樣品中的硝酸鹽轉化為 N2O0
[0032]5.N2O氮氧穩定同位素的在線連續測定
[0033]取步驟(4)頂空瓶,使用Precon-GC-MS聯機測定，具體設置的程序為:precon階段:氦氣作為載氣將樣品瓶中樣品氣帶到化學肼，然后進行700秒的液氮冷阱I凍存富集，之后升溫，將液氮冷阱I中的樣品氣轉移到液氮冷阱II繼續凍存280秒，實現待測定N2O氣體的富集和分離，消除雜質氣體的干擾。富集后N2O經過GC加熱的長色譜柱，達到進一步分離N2O和其他雜質氣體的目的，最后進入同位素質譜儀進行同位素比值測定。
[0034]Precon的進樣針進行相應的改裝(圖2)，改裝后自動進樣針可伸入樣品液面以下將頂空氣及液體中的氧化亞氮均吹出進入Precon，提高樣品檢測精密度。具體為，根據所選用樣品瓶的高度、三通閥和兩通閥高度，剪掉原長針和短針上方螺絲后，將較細的長針(I)套設于較粗的短針(2)內。根據樣品瓶內液面高度，調整長短針之間距離，使得套針插入樣品瓶后，長針位于液面下，短針位于液面上方(樣品瓶口處)。將套針接入三通閥(3)，使用配套墊片將在三通閥下口的短針密封。長針伸出三通閥，使用配套墊片將長針與三通閥上口密封好后，再使用配套墊片將長針與兩通閥(4)下口密封連接在一起。使用套針時兩通閥上口用配套墊片密封接Precon氦氣進氣管,三通閥左方用配套墊片密封接precon氦氣與樣品氣混合氣的出氣管。改裝后使用套針時氦氣進樣孔(長針)可以伸入樣品液面以下將頂空氣及液體中的氧化亞氮均吹出，樣品氣進而從短針進入Precon，提高樣品檢測精密度。
[0035]結果如下:
[0036]結果顯示，測定硝酸鹽標準品的氮氧穩定同位素各自測量值和真實值的標準曲線均線性良好，R2均大于0.99，滿足樣品測定的要求，可以用于校正同批次未知樣品的測量值，獲取未知樣品的氮氧穩定同位素真實值(圖4A，圖4B)。該標準曲線實際反映了本次測量所有樣品(標準品)真實值和測量值的函數對應關系(線性)，也是從未知樣品測量值反推真實值的公式依據。
[0037]所說的在線連續測定，是針對precon-GC-MS聯機進行改造，使其適用于反硝化細菌法離線樣品制備后的在線連續測定，24小時可完成多達60-70個樣品的測定。具體是改裝自動進樣器進樣針，加長進樣針長度，使進樣針可以伸入樣品液面以下，進樣時可將液體中的氧化亞氮吹出，從而提高樣品檢測精密度；將原放置12mL樣品瓶的自動進樣器樣品盤改裝為可放置20mL(圖2)和40mL(圖3)頂空瓶的樣品盤，可直接用20mL樣品瓶或40mL樣品瓶自動進樣，無需將樣品氣轉到12mL樣品瓶中。
[0038]實施例2
[0039]1.反硝化細菌的富集培養
[0040]固體牛肉膏蛋白胨培養基的配方為:3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化鈉，15.0g瓊脂，1.0L去離子水。液體牛肉膏蛋白胨培養液的配方為:3.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g氯化鈉，1.0L去離子水。
[0041]配置固體牛肉膏蛋白胨培養基，高溫高壓滅菌制備固體平板。劃線接種無N2O還原酶活性的反硝化細菌，培養三天后，取單菌落接種至已滅菌的5mL液體牛肉膏蛋白胨培養液中，在搖床上30°C, 120rpm下繼續培養一天后,轉接至600mL已滅菌的液體牛肉膏蛋白胨培養液中30°C，120rpm下富集培養。
[0042]所述無N2O還原酶活性的反硝化細菌購自于保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，分類學命名為pseudomonas.chlororaphis subsp Aureofaciens (綠針假單胞菌金色亞種)，保藏編號為CGMCC1.3351。
[0043]2.反硝化細菌的濃縮
[0044]將上述富集培養五天后的菌液于低溫離心機中18°C、7500g離心10分鐘。移除上層清液后，將離心后底層沉淀細菌加入至一定體積的新鮮已滅菌的牛肉膏蛋白胨培養液，使得配置后菌液濃度為富集培養后菌液濃度十倍，而后菌體震蕩混勻，加入約0.5mL抑泡劑(Antiform B Emuls1n, Sigma)備用。
[0045]3.反硝化細菌及樣品瓶的凈化
[0046]取3mL上述濃縮菌液加入20mL頂空瓶中后，封緊頂空瓶。將樣品瓶倒置連接到曝氣裝置上，連接時曝氣裝置進氣針和出氣針均插入倒置的頂空瓶瓶口，進氣針置于液面內，出氣針置于液面上方頂空，通入氦氣吹掃3h，以除去液體及頂空中殘余的氧化亞氮，并使樣品瓶內充滿氦氣。
[0047]4.將樣品中的硝酸鹽轉化為N2O
[0048]取凈化后樣品瓶，使用微量進樣器分別加入0.05mL200 μ mol/L的USGS32、
0.05mL200 μ mol/L 的 USGS34、0.05ml200 μ mol/L 的配置標準品 A (配置標準品 A 為四分之一體積的200 μ mol/L USGS32和四分之三體積的200 μ mol/L USGS34混合)、0.05ml200 μ mol/L的配置標準品B (配置標準品B為二分之一體積的200 μ mol/L USGS32和二分之一體積的200 μ mol/L USGS34混合)、0.05ml200 μ mol/L的配置標準品C (配置標準品C四分之三體積的200 μ mol/L USGS32和四分之一體積的200 μ mol/L USGS34混合)、Iml未知海水樣品X，均設置三個重復樣。樣品瓶倒置放于恒溫搖床30°C過夜培養，細菌將樣品中的硝酸鹽轉化為N20。
[0049]5.N2O氮氧穩定同位素的在線連續測定
[0050]取步驟(4)頂空瓶,使用Precon-GC-MS聯機測定，具體設置的程序為:precon階段:氦氣作為載氣將樣品瓶中樣品氣帶到化學肼，然后進行700秒的液氮冷阱I凍存富集，之后升溫，將液氮冷阱I中的樣品氣轉移到液氮冷阱II繼續凍存280秒，實現待測定N2O氣體的富集和分離，消除雜質氣體的干擾。富集后N2O經過GC加熱的長色譜柱，達到進一步分離N2O和其他雜質氣體的目的，最后進入同位素質譜儀進行同位素比值測定。
[0051]結果如下:
[0052]結果顯示，測定硝酸鹽標準品的氮氧穩定同位素各自測量值和真實值的標準曲線均線性良好，R2均大于0.99，滿足樣品測定的要求，可以用于校正同批次未知樣品的測量值，獲取未知樣品的氮氧穩定同位素真實值(圖5A，圖5B)。該標準曲線實際反映了本次測量所有樣品(標準品及未知樣品)真實值和測量值的函數對應關系(線性)，也是從未知樣品測量值反推真實值的公式依據。未知海水樣品X經公式校正后，其氮氧穩定同位素真實值為:δ 15Nx = 21.4%ο, δ 18Ox = 25.3%。。根據文獻，這個值符合海洋中天然豐度的硝酸鹽氮氧穩定同位素分布范圍。
【權利要求】
1.一種海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法，其特征在于:利用無N2O還原酶活性的反硝化細菌將待測海水中硝酸鹽進行離線處理后轉化為氧化亞氮氣體，使用痕量氣體預濃縮裝置(Precon)-氣相色譜(GC)-同位素比質譜儀(MS)聯機進行氮氧穩定同位素的在線連續測定。
2.按權利要求1所述的海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法，其特征在于: 所述離線處理是將無N2O還原酶活性的反硝化細菌接種到牛肉膏蛋白胨培養液中，在恒溫震蕩富集培養5-10天后，將菌液離心，取底層沉淀細菌加入牛肉膏蛋白胨培養液中，使得菌液濃度濃縮至富集培養后菌液濃度的10-20倍，震蕩混勻后加入抑泡劑(Sigma)，待用。
3.按權利要求1所述的海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法，其特征在于: 將上述離線處理后所得濃縮菌液置于倒置的樣品瓶中，并通氦氣吹掃菌液及樣品瓶頂空氣3h，而后注入待測水樣使樣品中硝酸鹽氮含量為0.2-20 μ g，倒置放于恒溫搖床20-30°C震蕩過夜培養，培養后離心并使用Precon-GC-MS聯機測定，得出N2O氮氧穩定同位素值。
4.按權利要求1所述的海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法，其特征在于: 將上述測定的氮氧同位素測試結果進行校正，使用多點校正法，取國際原子能標準品USGS32、USGS34以及USGS32和USGS34混合配制后的標準品共五個標準品，標準品與樣品一起進行同樣的離線處理并同一批次測定，使用五個標準品的測量值和真值建立標準曲線，對樣品測定結果進行校正。
5.按權利要求1所述的海水硝酸鹽氮氧穩定同位素測定的方法，其特征在于:所述無N2O還原酶活性的反硝化細菌保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，分類學命名為pseudomonas.chlororaphis subsp Aureofaciens (綠針假單胞菌金色亞種)，保藏編號為CGMCC1.3351。
【文檔編號】G01N30/02GK104181247SQ201410419225
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月22日 優先權日:2014年8月22日
【發明者】俞志明, 于海燕, 吳在興 申請人:中國科學院海洋研究所
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