基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒，其中，該試劑盒由具有富集抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠、多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質控品以及PBST緩沖液所組成；質控品包括陽性質控品以及陰性質控品；陽性質控品為人肺炎鏈球菌感染者的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體分別為陽性的血清；陰性質控品是抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG均為陰性的人血清。本發明具有簡便、快速以及高靈敏度的優點，可實現對抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體的同步檢測。
【專利說明】基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫學檢測【技術領域】，具體為一種基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的檢測方法及檢測試劑盒，以及該檢測試劑盒的制備及使用方法。
【背景技術】
[0002]人肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae, Sp)是兒童呼吸道感染的重要病原體。主要經飛沫傳播而進入呼吸道，從而寄生于人體的鼻咽部，或侵入人體不易清除的部位引起一系列的疾病，如大葉性肺炎，腦膜炎，支氣管炎，中耳炎等。它是全球所有年齡組高發病率和病死率的主要病原菌。其中，在發展中國家，嬰幼兒、老年人及免疫缺陷人群中尤為嚴重。肺炎鏈球菌于1881年首次由巴斯德(Louis Pasteur)及G.M.Sternberg分別在法國及美國從患者痰液中分離出。其為革蘭氏染色陽性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙球菌，有毒株菌體外有化學成分為多糖的莢膜。其莢膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌分型的依據。根據莢膜多糖抗原性的不同將肺炎球菌分為91個血清型。肺炎鏈球菌菌體抗原主要為C多糖，其存在于肺炎鏈球菌細胞壁中，具有種特異性，為各型菌株所共有。C多糖可被血清中C-反應蛋白沉淀。在鈣離子存在時，C多糖可與正常人血清中稱為C-反應蛋白(C reactive protein, CRP)的β球蛋白結合,發生沉淀。目前針對人肺炎鏈球菌抗原的檢測亦主要是針對此抗原，而該抗原非肺炎鏈球菌獨有，如緩和鏈球菌亦含有該抗原。在肺炎鏈球菌表面還有一種與毒力相關的重要抗原，為肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA),其存在于肺炎鏈球菌所有血清型中，是肺炎鏈球菌的特異性抗原。但是PspA分子結構高度變異，具有抗原多樣性，其富含脯氨酸的結構域上游被稱為CDR域，具有多樣性。根據CDR域的不同將 PspA 分為 3 個家族 6 亞類:Cladel, Clade2, Clade3, Clade4, Clade5, Clade6。其中Cladel, Clade2 屬于 Faml 家族；Clade3, Clade4, Clade5 屬于 Fam2 家族，Clade6 屬于 Fam3家族。具有Faml或Fam2家族PspA蛋白的人肺炎鏈球菌占到了臨床分離的人肺炎鏈球菌種類的99%以上。我國目前還未見具有fam3家族PspA蛋白的肺炎鏈球菌的臨床分離報道。研究表明同一家族亞類間PspA蛋白間存在廣泛的抗原抗體交叉反應，而異家族亞類間則無此交叉反應。
[0003]臨床病人由于不同的呼吸道病原體(如副流感病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病癥狀可以十分相似，這導致了流行診斷比較困難，確診往往依賴于實驗室診斷?？焖儆行У脑\斷方法應該是在疾病的發病初期就可以得到明確的診斷，便于實施針對性的治療，阻止病情的發展遷延。
[0004]在人肺炎鏈球菌感染的實驗室診斷上，被檢者血清中抗肺炎鏈球菌抗體指標則是診斷結果的重要依據之一。
[0005]免疫球蛋白M(Immunoglobulin M, IgM)和免疫球蛋白 G (Immunoglobulin G, IgG)是人體內最重要的兩種抗體。當人肺炎鏈球菌進入機體后，最早出現的免疫球蛋白是IgM抗體，之后出現IgG,通過檢測體內特異性IgM、IgG抗體的存在,可診斷人體對人肺炎鏈球菌的免疫反應狀態。若檢測出特異性IgM抗體，表明有近期感染的發生，但IgM抗體半衰期較短，IgM的檢測陰性并不能證明機體未受感染，還需要檢測半衰期較長，含量最高的IgG抗體，以明確診斷。
[0006]目前，血清中特異性IgM及IgG抗體的檢測方法主要有冷凝集實驗、明膠顆粒凝集實驗、酶聯免疫吸附實驗、金標免疫斑點法及金標免疫層析法。冷凝集實驗的特異度和敏感度均為最低，因此其臨床診斷價值不大；金標免疫斑點法及金標免疫層析法雖操作簡便快捷，但敏感度略低，對抗體水平較低的患者有漏診的可能；明膠凝集實驗試劑準備與操作過程較為繁瑣，且需要專業操作人員。酶聯免疫吸附法具有特異、敏感等優點，已用于檢查各種抗體或抗原，但此方法存在以下問題:(I)每一批試驗從加樣、溫浴、洗版等步驟較多，操作繁瑣，時間較長(總共需要2-4小時)；(2)檢測中需分別加入顯色成分A液與B液，且還要在規定時間內完成讀數，一定程度上增加了勞動強度和操作失誤的可能性；(3)該法無法做到對IgM及IgG兩種抗體的同時檢測。雖然單獨檢測IgM和IgG抗體后，再綜合分析檢測結果對疾病的診斷并無影響，但操作過程繁瑣，檢測不夠方便快捷，檢測成本較共檢亦會增加。
[0007]因此，建立具備高靈敏度、能對抗人肺炎鏈球菌的特異性IgM、IgG抗體進行快速同步共檢的檢測方法顯得十分必要。
【發明內容】
[0008]針對【背景技術】中存在的這些技術問題，本發明提供了一種基于磁性分離和多色量子點標記的能簡便、快速、高靈敏度的同步共檢抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體的檢測方法和試劑盒，以及該試劑盒的制備及使用方法。
[0009]本發明是通過以下技術方案來實現的:
[0010]一種基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟:
[0011 ] I)重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備；
[0012]2)將步驟I)制備得到的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白與納米磁珠通過共價偶聯，制得抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠；
[0013]3)將鼠抗人IgM單克隆抗體與發射波長為520nm的納米量子點通過共價偶聯，制備量子點標記的抗人IgM納米探針；將鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600nm的納米量子點通過共價偶聯，制備量子點標記的抗人IgG納米探針；將量子點標記的抗人IgM納米探針與量子點標記的抗人IgG納米探針等量混合即制得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針；
[0014]4)取人血清樣本，用PBSA緩沖液適當稀釋后，分別向血清稀釋液中加入步驟2)制備得到的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠以及步驟3)制備得到的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針,充分混合，反應10-45min后進行磁分離，以PBST緩沖液洗漆2遍后，使用熒光酶標儀，在發射波長(Em)分別為520nm及600nm下分別讀取熒光值；所述PBSA緩沖液中各組分含量分別為:8g/LNaCL，0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA(牛血清白蛋白);所述PBSA緩沖液的pH = 7.4 ;所述PBST緩沖液中各組分含量分別為:8g/LNaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA(牛血清白蛋白)，0.3g/L NaN3,0.5ml/L Tween-20 ;所述 PBST 緩沖液的 pH = 7.4 ；
[0015]5)根據步驟4)的方法檢測至少30份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本,分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的熒光值；所述抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本簡稱人肺炎鏈球菌抗體陰性對照樣品；所述人肺炎鏈球菌抗體陰性對照樣品在發射波長(Em)為520nm的熒光值的平均值與3倍標準差之和記為CUT-OFFl值；所述人肺炎鏈球菌抗體陰性對照樣品在發射波長(Em)為600nm的熒光值的平均值與3倍標準差之和記為⑶T-0FF2值；若步驟4)中人血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測熒光值大于CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽性；若步驟4)中人血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測熒光值小于CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性；若步驟4)中人血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測熒光值大于CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性；若步驟4)中人血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測熒光值小于CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性。
[0016]一種基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒，其特征在于:所述基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒由具有富集抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠、多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質控品以及PBST緩沖液所組成；所述質控品包括陽性質控品以及陰性質控品；所述陽性質控品由兩份人肺炎鏈球菌感染者的抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性的血清及兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性的血清組成；所述陰性質控品是四份抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清。
[0017]一種用于制備基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的方法，其特征在于:所述制備方法包括以下步驟:
[0018]I)抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠的制備:
[0019]1.1)重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備、純化:
[0020]1.1.1)對人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白進行生物信息學分析，分別獲取人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白胞外結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對應的基因序列；
[0021]1.1.2)在步驟1.1.1)中所得到的基因序列的5’端及3’端分別引入酶切位點并分別化學合成全基因序列，同時標記記為PspAl、PspA2 ;其序列參見序列表；
[0022]1.1.3)將步驟L 1.2)中所得到的PspAl、PspA2按分子生物學方法分別克隆入表達載體pET-28a(+)后轉入大腸桿菌中表達重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白；所述重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白均以可溶性表達形式存在于基因工程菌體中；
[0023]1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.3)所得到的重組PspAl-His、PspA2_His融合蛋白，SDS-PAGE檢測其純度后，用PBS緩沖液分別透析過夜；收集透析液，經bradford試劑盒進行蛋白質濃度測定后，用PBS緩沖液分別調整濃度均為2mg/mL ;所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4, L 44g/LNa2HP04，所述 PBS 緩沖液的 pH=7.4 ；
[0024]1.1.5)將步驟1.1.4)得到的兩種重組蛋白溶液按體積比1:1混合即制得重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白；
[0025]1.2)納米磁珠的包被:
[0026]1.2.1)取5mg磁珠，用Iml MES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、粒徑為1150nm的羧基磁珠；所述MES緩沖液是質量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES緩沖液的pH = 6.0 ;所述納米磁分離器的磁性強度是0.4T；
[0027]1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8_12mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以10-40rpm/min于旋轉混合儀中活化Ihr,置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0028]1.2.3)取5個離心管，在每個離心管中加入200 μ L步驟1.2.2)所得到的活化后的磁珠，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為100-400 μ g/ml的由步驟1.1.5)所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各lml，室溫下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應2_6h，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液,室溫下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應2h以封閉磁珠上未與抗體反應的羧基；所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/LNaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,所述 PBS 緩沖液的 pH = 7.4 ；
[0029]1.2.4)封閉反應完成后，將該5個離心管置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，各用Iml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.5ml/L Tween-20，所述洗滌緩沖液的pH =
7.4；
[0030]1.2.5)向各個離心管中分別加入Iml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存備用；至此制得抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠；所述保存緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/LNaNs, 5g/L 牛血清白蛋白(BSA)，所述保存緩沖液的pH = 7.4 ;
[0031]2)多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針的制備:
[0032]其具體制備方法包括:
[0033]2.1)向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點、600nmol N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為5ml，混合溶液，37°C反應30min后,透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及EDC,得到活化后的量子點；所述羧基水溶性量子點的發射波長是520nm ;所述磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩沖液的pH = 7.4 ;
[0034]2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入8-16nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h，加入單端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為1%，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應Ih ；
[0035]2.3)用0.2 μ m PES濾器過濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發生偶聯反應的抗體和反應中的副產物；
[0036]2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉移到一個新的50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液中，置于4°C保存備用，至此制得量子點標記的抗人IgM納米探針；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH = 7.4 ;所述磷酸鹽保存液中各成分含量如下:
2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH = 7.4 ;
[0037]2.5)按與步驟2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600 nm的羧基水溶性量子點制得量子點標記的抗人IgG納米探針；將上述兩種量子點標記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即制得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針；
[0038]3) PBST緩沖液的配制:
[0039]其具體配制方法包括:
[0040]取8g NaCL, 0.2g KC1,0.24 KH2PO4,1.44g Na2HPO4, 5g BSA，0.3g NaN3, 0.5mlTween-20溶解于900ml蒸餾水中，用5M NaOH調整pH至7.4，再定容至100ml ；
[0041]4)質控品的制備:
[0042]4.1)陽性質控品:
[0043]4.1.1)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽性的血清構成；
[0044]4.1.2)抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性的血清構成；
[0045]4.2)陰性質控品:由0.5ml抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清構成。
[0046]作為優選，本發明在步驟1.2.2)中，依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以15rpm/min于旋轉混合儀中活化Ihr,置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠；
[0047]所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為200 μ g/ml的由步驟1.1.5)所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各Iml,室溫下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應3h，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液；
[0048]所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入12nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h。
[0049]作為優選，本發明所采用的量子點是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點。
[0050]作為優選，本發明所采用的磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團為羧基、粒徑為1150nm的羧基磁珠。
[0051]一種基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的使用方法，其特征在于:所述使用方法包括以下步驟:
[0052]I)取待檢血清樣本5 μ I用995 μ I PBSA緩沖液稀釋后將稀釋液轉入1.5ml普通離心管中；所述PBSA緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,
1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA ;所述 PBSA 緩沖液的 pH = 7.4 ；
[0053]2)向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠10-100 μ I及基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min于旋轉混合儀上反應5-25min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清；
[0054]3)添加基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的PBST緩沖液Iml洗滌兩遍，采用納米磁分離器磁分離后吸出洗滌液，最后用0.2ml PBS緩沖液重懸磁珠，制得納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點“三明治”復合物；所述PBS 緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4 ；所述PBS緩沖液的pH = 7.4 ;
[0055]4)將步驟3)得到的納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點復合物載于酶標板中，使用熒光酶標儀在激發波長(Ex)同為365nm，發射波長(Em)分別為520nm及600nm的參數下分別對其熒光值進行分別讀數；
[0056]5)按上述同樣的方法檢測至少30份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本,分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的熒光值；所述經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長(Em)為520nm的熒光值的平均值與3倍標準差之和記為⑶T-OFFl值；所述經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長(Em)為600nm的熒光值的平均值與3倍標準差之和記為⑶T-0FF2值；同時檢測試劑盒中提供的四份陰性質控品樣品及四份陽性質控品樣品，分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的突光值；四份陰性質控品樣品在發射波長(Em)為520nm的突光值的平均值記為NCXl ;四份陰性質控品樣品在發射波長(Em)為600nm的熒光值的平均值記為NCX2值；兩份抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性質控品樣品在發射波長(Em)為520nm的熒光平均值為PCXl ;兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽性質控品樣品在發射波長(Em)為及600nm下的熒光值記為PCX2 ;若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測熒光值大于⑶T-OFFl值且PCX1/NCX1 ^ 2.1,則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽性；若步驟4)中待檢樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測熒光值小于CUT-OFFl值且PCX1/NCX1 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測熒光值大于CUT-0FF2值且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測熒光值小于⑶T-0FF2值且PCX2/NCX2彡2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性；若PCX1/NCX1 < 2.1或PCX2/NCX2 < 2.1，均表明試劑盒失效。
[0057]作為優選，本發明所提出的步驟2)中，向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠20 μ I及基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min于旋轉混合儀上反應15min后取下,將離心管插入納米磁分離器磁分離3min,用移液器吸出上清。
[0058]本發明所需的羧基水溶性納米量子點、1150nm羧基磁珠，鼠抗人IgM單克隆抗體、鼠抗人IgG單克隆抗體等可到相關專業的研究單位、公司購買或定制；所需的儀器、設備、藥品均有市售。
[0059]本發明相比現有技術具有如下優點:
[0060]1、本發明利用了納米磁珠對樣品的可富集性、分離的速度快、效率高等優點，同時結合量子點光化學穩定性高、熒光強度高等特性，使得檢測體系具備多重信號協同放大的效果，從而具有超高的檢測靈敏度與準確度。
[0061]2、本發明所用的捕獲抗原是包含有人肺炎鏈球菌特異性Faml PspA及Fam2PspA蛋白抗原胞外區富含抗原表位的混合抗原，病人血清中針對其產生的抗體水平高，因此捕獲效果好。
[0062]3、本發明所用的捕獲抗原特異性高，與其他常見的呼吸道病原體(如甲、乙型人流感病毒、人流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、人肺炎支原體、人肺炎衣原體等)的抗體之間無抗原抗體交叉反應。
[0063]4、本發明所用抗原為基因工程重組抗原，蛋白質表達量高，且為可溶性表達，無需復性，故較為廉價易得。
[0064]5、本發明檢測方法簡單，檢測快速(30min之內)，易于判定，檢測成本低廉，克服了現有技術檢測陽性率低、成本高、操作復雜繁瑣、耗時長、臨床應用不便的不足。
[0065]6、本發明可實現抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體的同步檢測，解決了分項檢測所帶來的操作過程繁瑣，檢測不夠方便快捷，檢測成本較高等問題，而目前市面上還未曾見到抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體同步檢測的產品或者相關科學報道的出現。
【具體實施方式】
[0066]本發明是根據免疫學中的抗體抗原反應原理，利用納米磁珠對樣品的可富集性、分離的速度快、效率高等優點，結合量子點光化學穩定性高、熒光強度高等特性，建立的一套具備多重信號協同放大、具有超高靈敏度及高度特異性的快速同步檢測抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體的新方法，具有廣闊的市場應用前景。
[0067]本發明通過以下實施例作進一步具體描述。
[0068]各種試劑的配制及所需材料的說明
[0069]1.PBSA緩沖液:稱取1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，8g氯化鈉，0.2g氯化鉀，5g牛血清白蛋白溶解于900ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.4后用去離子水定容至1000ml。
[0070]2.PBS緩沖液:稱取1.44g磷酸氫二鈉，0.24g磷酸二氫鉀，8g氯化鈉，0.2g氯化鉀溶解于900ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.4后用去離子水定容至1000ml。
[0071]3.重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白:為本發明自制,將本發明自制的濃度均為0.2mg/ml的重組PspAl-His融合蛋白與重組PspA2_His融合蛋白按體積比1:1混合后搖勻，制得重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白。
[0072]4.鼠抗人IgM單克隆抗體:為Abcam公司產品，貨號ab99741，用PBS緩沖液稀釋，搖勻，使溶液中單克隆抗體重量百分比濃度為lmg/ml。
[0073]5.鼠抗人IgG單克隆抗體:為Abcam公司產品，貨號ab99757，用PBS緩沖液稀釋，搖勻，使溶液中單克隆抗體重量百分比濃度為lmg/ml。
[0074]6.量子點:本發明中所用的兩種量子點均為羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點，其發射波長分別為520nm及600nm，自武漢珈源量子點技術開發有限公司購買，產品名稱為羧基水溶性量子點-520及羧基水溶性量子點-600。
[0075]7.磁珠:本發明中所用磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團為羧基、粒徑為分別為50nm、180nm、350nm、1150nm、3 μ m的羧基磁珠,可從陜西北美基因股份有限公司、上海奧潤微納新材料科技有限公司購買。
[0076]實施例1重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備與純化
[0077]1.相關基因的克隆
[0078]對人肺炎鏈球菌Faml PspA, Fam2 PspA蛋白(其NCBI蛋白質數據庫中的access1n number分別為AAF27703、AAF27712)進行生物信息學分析，分別獲取其胞外結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對應的DNA編碼序列，同時在其5’引入酶切位點Ndel、3’端引入終止信號TAA和酶切位點XhoI后分別化學合成全基因序列(全序列合成交由金斯瑞生物科技有限公司完成，交貨時人工合成的基因片段均分別連于載體PUC57上)，記為PspAl, PspA2。其基因全序列如序列表所不。其中，PspAl基因編碼的蛋白質序列為人肺炎鏈球菌Faml PspA蛋白(access1n number:AAF27703)的29_406&3。？8口六2基因編碼的蛋白質序列為人肺炎鏈球菌Fam2 PspA蛋白(access1n number:AAF27712)的26_427aa。將分別含有該兩段人工合成的DNA片段的載體pUC57分別用NdeI及XhoI進行雙酶切后按常規方法分別回收目的片段，備用。同時采用NdeI及XhoI對載體pET-28a(+)進行雙酶切，并按常規方法分別將經雙酶切后獲得的PspAl，PspA2連入pET-28a (+)載體中，并轉化大腸桿菌T0P10，構建pET-PspAl、pET_PspA2表達載體。經酶切和序列測定證實表達載體構建無誤。該載體分別表達重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白。
[0079]2.重組PspAl-His、PspA2_His融合蛋白的表達與純化
[0080]將鑒定正確的陽性克隆菌培養后提取質粒，按常規技術轉入感受態E.coliBL21(DE3)中，轉化完成后將菌液涂布于含50μ g/mL卡那霉素的LB平板上，按常規方法篩選表達菌株。分別挑取pET-PSpAl、pET-PSpA2轉化的具有外源蛋白表達能力的單個菌落并分別接種入10mL LB培養基中，于37°C培養過夜。分別取出菌液后，按1: 100分別接種于10mL含有50 μ g/mL卡那霉素的LB培養基中，于37°C培養至OD6tltl = 0.6時，加入lmol/L IPTG至終濃度為lmmol/L,于37°C搖菌培養,誘導融合蛋白表達。誘導4h后分別于8000r/min下離心1min收集菌體。將此兩份菌體分別用20mL磷酸鹽緩沖液(8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/LKH2P04,1.44g/L Na2HPO4 pH = 7.4)洗滌 3 次并分別用 1mL 上樣緩沖液(20mM Na3PO4, 0.5M NaCl ;30mM咪唑，pH7.4)重懸后進行超聲破碎，操作條件為:50HZ，200W，超聲3S，間歇5S，工作100次。超聲完成后，12000g離心15min分別收集沉淀和上清后進行電泳檢測。發現重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白均以可溶性表達方式存在于菌體中。收集此兩份細胞破碎的上清液，分別用His Trap affinity columns (GE healthcare公司產品)，按照說明書用同樣的方法進行純化。具體方法如下:
[0081]I)用5mL注射器吸滿蒸餾水，擰開柱的塞子，用提供的接頭將柱和注射器連接上，以lmL/min流速洗柱。
[0082]2)用1mL上樣緩沖液平衡，lmL/min流速。
[0083]3)將融合蛋白上樣，lmL/min流速。
[0084]4)用1mL上樣緩沖液，以lmL/min流速洗柱。
[0085]5)用 1mL 洗脫緩沖液(20mM Na3PO4,0.5M NaCl,300mM 咪唑，ρΗ7.4)，以 lmL/min流速洗脫，分管收集，每管lml，12% SDS-PAGE檢測，合并洗脫組分中含有目的蛋白的樣品，用PBS緩沖液透析過夜。收集透析液經bradford試劑盒進行蛋白質濃度測定后,用PBS緩沖液調整濃度為0.2mg/mL。
[0086]3.重組人肺炎鏈球菌PspA融合蛋白的制備
[0087]將上述步驟2制備的分別含重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白的PBS緩沖液按體積比1:1混合即制得重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白，供納米磁珠包被用。
[0088]實施例2抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠的制備
[0089]1.重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白偶聯磁珠反應條件的優化:
[0090]以偶聯了重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的磁珠作為固相載體，量子點標記的鼠抗人IgM單克隆抗體作為檢測抗體，檢測抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性血清，觀察磁珠與重組蛋白的偶聯情況。分別對磁珠的粒徑，以及EDC/NHS活化劑濃度、偶聯抗體濃度、偶聯時間、封閉劑種類等偶聯條件進行了一系列的優化選擇。
[0091]1.1磁珠粒徑的選擇
[0092]選擇粒徑為50nm、180nm、350nm、1150nm、3 μ m的羧基納米磁珠，均加入含4mg/mlEDC及4mg/ml NHS的PBS緩沖液進行活化反應后，分別與重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白偶聯反應。分別將制備好的羧基納米磁珠檢測抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性血清，熒光顯微鏡下觀察結果，選擇熒光強度大，背景熒光干擾少，以及在磁場作用下分離速度較快者為最適磁珠粒徑。結果表明粒徑1150nm的磁珠最符合本發明的要求,確定最適羧基磁珠粒徑為1150nmo
[0093]1.2 EDC/NHS活化劑濃度的選擇
[0094]將反應體系中EDC和NHS濃度各自設為I?10mg/ml后進行濃度梯度組合，分別活化粒徑1150nm的羧基納米磁珠。將制備好的羧基納米磁珠檢測抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性血清，選擇熒光最強者為EDC和NHS溶液的最適活化濃度。結果表明當EDC濃度為5mg/ml、NHS濃度為4mg/ml時偶聯效果最好。
[0095]1.3偶聯抗原濃度的選擇
[0096]將10μ g、50y g、100y g、150y g、200y g、250y g、300y g 的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白分別與Img按上述最優方法活化的粒徑為1150 nm的磁珠進行偶聯。將制備好的羧基納米磁珠分別檢測抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性血清，結果發現，當重組蛋白的投放量小于200μ g/mg時，熒光強度隨著抗體的濃度增加而增加，而當重組蛋白的投放量大于200 μ g/mg時，熒光強度基本不變甚至略有減小，因此本實施例選擇重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的偶聯量為200 μ g/mg。
[0097]1.4偶聯時間的選擇
[0098]確定磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度及抗體偶聯量后，將重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白與磁珠的偶聯反應時間分別設為0.5h、lh、2h、3h、4h、5h。將制備好的羧基納米磁珠分別檢測抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性血清，結果發現，當偶聯時間>3h時，熒光強度趨于穩定，此后再延長偶聯時間，熒光不再增強。因此，確定重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白與磁珠的最適偶聯反應時間為3h。偶聯時間遠少于傳統ELISA法的24h。
[0099]1.5封閉劑的選擇
[0100]按照上述確定的最優條件選擇磁珠的粒徑、EDC/NHS活化劑濃度、抗體偶聯量及偶聯時間后進行偶聯反應。偶聯結束后，選擇BSA，乙醇胺，Tris和D-氨基葡萄糖鹽酸鹽作為納米磁珠封閉劑，制得成品羧基納米磁珠。將制備好的納米磁珠分別檢測抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性血清，結果發現，采用乙醇胺作為封閉劑的納米磁珠的檢測熒光值最高。推測由于乙醇胺的分子較小，可以較好的消耗由于空間位阻未與抗體結合的表面羧基，使封閉更為完全，并且有效減少空間位阻效應對已連接抗體的結構影響。
[0101]同時，以偶聯了重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的羧基納米磁珠作為固相載體，對應的量子點標記的鼠抗人IgG單克隆抗體作為檢測抗體，建立抗人肺炎鏈球菌IgG抗體的檢測體系，對相應的檢測體系中的重組蛋白偶聯磁珠的反應條件進行優化。結果發現，該檢測體系中的最佳偶聯條件均與上述步驟1.1-1.5所給出的結果完全一致。
[0102]2.偶聯過程:
[0103]取5mg磁珠(以超順磁性Fe3O4為內核、粒徑為1150nm的羧基磁珠)于1.5ml普通離心管中，用lml MES緩沖液(2g/L MES, pH6.0)洗滌三次，置于納米磁分離器中進行磁分離(0.4T)后移除上清，依次加入用上述MES緩沖液配制的濃度為10mg/ml的EDC溶液及用上述MES緩沖液配制的濃度為8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以15rpm/min于旋轉混合儀中活化lhr，磁分離后移除上清，用Iml上述的MES緩沖液重懸；取5個離心管，每個離心管中加入200 μ L上述活化的磁珠，磁分離后吸出上清，向各管中加入用PBS緩沖液(8g/L NaCL, 0.2g/LKCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, ρΗ7.4)稀釋的濃度為 200 μ g/ml 的實施例1所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各lml,室溫下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應3h，磁分離移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液，室溫下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應2h以封閉磁珠上未與抗體反應的羧基。磁分離后移除各管上清，各用 Iml 洗滌緩沖液(8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.5ml/L Tween-20,pH7.4)洗滌三遍，最后各用 Iml 保存緩沖液(8g/L NaCL, 0.2g/L KCl,0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/L NaN3, 5g/L BSA, pH7.4)重懸磁珠，置于 4°C保存備用，至此制得抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠。
[0104]實施例3多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針的制備
[0105]1.納米羧基量子點標記鼠抗人IgM單克隆抗體反應條件的優化:
[0106]1.1、羧基量子點標記抗體探針最佳標記pH的確定
[0107]將標記反應中磷酸鹽緩沖液pH分別設為5，6，7，8，9，對標記產物利用全光譜儀進行熒光強度測定，觀察不同PH值對偶聯反應的影響，確定了量子點標記單抗反應的最佳pH為7.0-8.0。本實驗選擇pH7.4。
[0108]1.2、羧基量子點標記抗體探針最佳標記量的確定
[0109]將量子點摩爾濃度與單抗濃度之比分別設置為1:1，1:2，1:3及1:4，進行標記反應后，對標記產物利用全光譜儀進行熒光強度測定，觀察二者不同濃度比對偶聯反應的影響，確定量子點標記鼠抗人IgM單克隆抗體反應的最佳摩爾濃度比為量子點與抗體摩爾比為1:3。本實驗選擇該最優濃度比來確定標記量。
[0110]1.3、羧基量子點標記抗體探針最佳封閉劑種類的確定
[0111]以乙醇胺、Tris, PEG2000-NH2或者BSA作為封閉劑，按步驟1.1及1.2確定的條件進行標記反應后，對標記產物利用全光譜儀進行熒光強度測定，觀察不同的封閉劑對于標記反應的影響，結果發現，PEG2000-NH2為最佳封閉劑，其可顯著提高標記復合物的膠體穩定性及免疫活性。
[0112]納米羧基量子點標記鼠抗人IgG單克隆抗體反應的條件優化結果與步驟1.1-1.3描述的納米羧基量子點標記鼠抗人IgM單克隆抗體反應相關條件的優化結果均完全一致。
[0113]2.標記過程:
[0114]向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點(發射波長520nm)、600nmolN-羥基琥珀酰亞胺(sulfo-NHS)和600nmol碳二亞胺(EDC)，以磷酸鹽緩沖液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，pH 7.4)定容為2ml，不停地混合溶液，37°C反應30min后,透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS與EDC。在活化的量子點中，加入12nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h，加入單端氨基化聚乙二醇(PEG2000_NH2)至終濃度為1%，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應lh。用0.2μπι PES濾器過濾除去抗體聚集物，然后將濾液轉移到50000MW超濾離心管中，以SOOOg離心力在4°C下離心15min，除去未發生偶聯反應的抗體和反應中的副產物。收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗滌液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，pH 7.4)中，再將此溶液轉移到50000MW超濾離心管中，以SOOOg離心力在4°C下離心15min，收集超濾管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液(2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L BSA,
0.3g/L疊氮鈉，pH 7.4)中，至此制得量子點標記的抗人IgM納米探針，置于4°C保存備用。
[0115]按上述相同方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600nm的羧基水溶性量子點制得量子點標記的抗人IgG納米探針。將上述兩種量子點標記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即制得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針；
[0116]實施例4羧基納米磁珠對人肺炎鏈球菌抗原進行免疫捕獲條件的優化
[0117]以偶聯了重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的磁珠作為固相載體，多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針作為檢測抗體，建立人肺炎鏈球菌抗體的檢測體系。分別對檢測體系中羧基納米磁珠的用量，捕獲時間等條件進行了一系列的優化選擇。
[0118]實驗1.羧基納米磁珠加入量的選擇
[0119]將5μ 1、10μ 1、20μ 1、30μ 1、50μ 1、70μ I的由實施例2所制備好的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠分別加入到0.5ml含抗人肺炎鏈球菌IgG抗體的人血清稀釋液中，進行免疫捕獲，再由實施例3所描述的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針進行檢測，記錄熒光值。結果發現，隨著羧基納米磁珠加入量的增加，熒光值逐漸增大，當羧基納米磁珠加入量達到20 μ I時，熒光值達到最大。再繼續增加羧基納米磁珠的量，熒光值反而降低。故本實驗選擇20 μ I作為納米磁珠的最佳加入量。
[0120]實驗2.免疫捕獲時間的選擇
[0121]確定磁珠的加入量后，取四份實施例2所制備好的納米磁珠，在室溫下以1r/min,對抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性血清進行5min、lOmin、15min、20min、30min及40min的免疫捕獲，再由實施例3所描述的量子點標記探針進行檢測，記錄熒光值。結果發現，熒光值在免疫捕獲15min時表現出最大值，隨著時間的延長，數值有所下降。故本實驗選擇15min作為免疫捕獲的最佳時間。
[0122]同時，以偶聯了重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的羧基納米磁珠作為固相載體，對應的量子點標記的鼠抗人IgG單克隆抗體作為檢測抗體，建立抗人肺炎鏈球菌IgG抗體的檢測體系，對相應的檢測體系中的捕獲條件進行優化。結果發現，上述檢測體系中的最佳捕獲條件均與上述實驗I及實驗2所給出的結果完全一致。
[0123]實施例5 PBST緩沖液的配制
[0124]取8g NaCL, 0.2g KC1,0.24 KH2PO4,1.44g Na2HPO4, 5g BSA，0.3g NaN3, 0.5mlTween-20溶解于900ml蒸餾水中，用5M NaOH調整pH至7.4，再定容至1000ml。
[0125]實施例6質控品的制備
[0126]6.1)陽性質控品:
[0127]6.1.1)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽性的血清構成；
[0128]6.1.2)抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性的血清構成；
[0129]6.2)陰性質控品:由0.5ml抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清構成。
[0130]實施例7試劑盒的制備
[0131]由實施例2所描述的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠溶液2ml、實施例3所描述的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針溶液5ml、實施例5所描述的PBST緩沖液200ml、實施例6所描述的質控品一套共同組成基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒。
[0132]實施例8待檢血清稀釋度的確定
[0133]用臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM抗體分別為陰性及陽性的人血清樣本各20份，用PBSA緩沖液分別進行1:50、1:100、1:200、1:400、1:800，1:1600倍稀釋，
選擇陽性血清與陰性血清的檢測熒光數值之比>3的最高稀釋度作為待檢血清的最適工作濃度。結果發現，200倍稀釋的效果最佳。
[0134]同樣，用臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgG抗體分別為陰性及陽性的人血清樣本各20份，用PBSA緩沖液分別進行I:50,1:100、1:200、1:400、1:800，1:1600倍稀釋，選擇陽性血清與陰性血清的檢測熒光數值之比>3的最高稀釋度作為待檢血清的最適工作濃度。結果亦發現，200倍稀釋的效果最佳。
[0135]實施例9試劑盒的使用方法
[0136]I)取待檢血清樣本5 μ I用995 μ I PBSA緩沖液稀釋(200倍稀釋)后將稀釋液轉入1.5ml普通離心管中；
[0137]2)向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠20 μ I及基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min于旋轉混合儀上反應15min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清；
[0138]3)添加基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的PBST緩沖液Iml洗滌兩遍，采用納米磁分離器磁分離后吸出洗滌液，最后用
0.2ml PBS緩沖液重懸磁珠，制得納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點“三明治”復合物；
[0139]4)將步驟3)得到的0.2ml納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點復合物載于酶標板中，使用熒光酶標儀在激發波長(Ex)同為365nm，發射波長(Em)分別為520nm及600nm的參數下分別對其熒光值進行分別讀數；
[0140]5)⑶T-OFF值的確定:按與上述步驟I)-4)同樣的方法檢測100份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本，分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的突光值；所述100份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長(Em)為520nm的熒光值的平均值(58.3)與3倍標準差(11.66)之和記為⑶T-OFFl值(93.28);所述100份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長(Em)為600nm的熒光值的平均值(42.5)與3倍標準差(9.8)之和記為CUT-0FF2值(71.9)；
[0141]6)按與上述步驟1)-4)相同的方法同時檢測試劑盒中提供的四份陰性質控品樣品及四份陽性質控品樣品，分別讀取發射波長(Em)分別為520nm及600nm下的熒光值；四份陰性質控品樣品在發射波長(Em)為520nm的熒光值的平均值記為NCXl ;四份陰性質控品樣品在發射波長(Em)為600nm的熒光值的平均值記為NCX2值；兩份抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性質控品樣品在發射波長(Em)為520nm的熒光平均值為PCXl ;兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽性質控品樣品在發射波長(Em)為及600nm下的熒光值記為PCX2 ;若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測熒光值大于⑶T-OFFl值(93.28)且PCX1/NCX1 ^ 2.1,則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為520nm的檢測熒光值小于⑶T-OFFl值(93.28)且PCX1/NCX1 ^ 2.1，則判斷為人待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測熒光值大于CUT-0FF2值(71.9)且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性；若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長(Em)為600nm的檢測熒光值小于⑶T-0FF2值(71.9)且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性；gPCXl/NCXl< 2.1或PCX2/NCX2 < 2.1，均表明試劑盒失效。
[0142]實施例10試劑盒的特異性試驗
[0143]用呼吸道常見病原體如人呼吸道合胞病毒、人肺炎支原體、人肺炎衣原體、人腺病毒3型、人腺病毒7型、人甲型流感病毒、人乙型流感病毒、人流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌感染者的相應病原體抗體呈陽性的血清來代替人肺炎鏈球菌抗體陽性血清用實施例7所述的試劑盒按實施例9所述的方法進行檢測，發現檢測結果均為陰性。
[0144]實施例11臨床測試例
[0145]應用本發明制備的基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒對臨床診斷明確的抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性血清樣本60份和陰性血清樣本80份進行了檢測，檢測結果如表1。
[0146]表1抗人肺炎鏈球菌IgM抗體臨床血清檢驗結果
[0147]
【權利要求】
1.一種基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢的方法，其特征在于:所述方法包括以下步驟: 1)重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備； 2)將步驟I)制備得到的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白與納米磁珠通過共價偶聯，制得抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠； 3)將鼠抗人IgM單克隆抗體與發射波長為520nm的納米量子點通過共價偶聯，制備量子點標記的抗人IgM納米探針；將鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600nm的納米量子點通過共價偶聯，制備量子點標記的抗人IgG納米探針；將量子點標記的抗人IgM納米探針與量子點標記的抗人IgG納米探針等量混合即制得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針； 4)取人血清樣本，用PBSA緩沖液適當稀釋后，分別向血清稀釋液中加入步驟2)制備得到的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠以及步驟3)制備得到的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針，充分混合，反應10-45min后進行磁分離，以PBST緩沖液洗滌2遍后，使用熒光酶標儀，在發射波長分別為520nm及600nm下分別讀取熒光值；所述PBSA緩沖液中各組分含量分別為:8g/L NaCL, 0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA ;所述PBSA緩沖液的pH = 7.4 ;所述PBST緩沖液中各組分含量分別為:8g/L NaCL,0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA，0.3g/L NaN3,0.5ml/L Tween-20 ；所述PBST緩沖液的pH = 7.4 ; 5)根據步驟4)的方法檢測至少30份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清，分別讀取發射波長分別為520nm及600nm下的熒光值；所述抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清簡稱人肺炎鏈球菌抗體陰性對照樣品；所述人肺炎鏈球菌抗體陰性對照樣品在發射波長為520nm的熒光值的平均值與3倍標準差之和記為CUT-OFFl值；所述人肺炎鏈球菌抗體陰性對照樣品在發射波長為600nm的熒光值的平均值與3倍標準差之和記為⑶T-0FF2值；若步驟4)中人血清樣本在發射波長為520nm的檢測熒光值大于CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽性；若步驟4)中人血清樣本在發射波長為520nm的檢測熒光值小于CUT-OFFl值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性；若步驟4)中人血清樣本在發射波長為600nm的檢測熒光值大于CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性；若步驟4)中人血清樣本在發射波長為600nm的檢測熒光值小于CUT-0FF2值，則判斷為人血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性。
2.一種基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒，其特征在于:所述基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒由具有富集抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體功能的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠、多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG抗體納米探針、質控品以及PBST緩沖液所組成；所述質控品包括陽性質控品以及陰性質控品；所述陽性質控品由兩份人肺炎鏈球菌感染者的抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性的血清及兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性的血清組成；所述陰性質控品是四份抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清。
3.一種用于制備如權利要求2所述的基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的方法,其特征在于:所述方法包括以下步驟: I)抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠的制備: 1.1)重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白的制備、純化: 1.1.D對人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白進行生物信息學分析，分別獲取人肺炎鏈球菌Faml PspA、Fam2 PspA蛋白胞外結構域中抗原表位最為豐富的肽段，找到其對應的基因序列； 1.1.2)在步驟1.1.1)中所得到的基因序列的5’端及3’端分別引入酶切位點并分別化學合成全基因序列，同時標記記為PspAl、PspA2 ； 1.1.3)將步驟1.1.2)中所得到的PspAl、PspA2按分子生物學方法分別克隆入表達載體pET-28a(+)后轉入大腸桿菌中表達重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白；所述重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白均以可溶性表達形式存在于基因工程菌體中； 1.1.4)用鎳柱純化步驟1.1.3)所得到的重組PspAl-His, PspA2_His融合蛋白，SDS-PAGE檢測其純度后，用PBS緩沖液分別透析過夜；收集透析液，經bradford試劑盒進行蛋白質濃度測定后，用PBS緩沖液分別調整濃度均為2mg/mL ;所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/LNa2HP04，所述 PBS 緩沖液的 pH=7.4 ； 1.1.5)將步驟1.1.4)得到的兩種重組蛋白溶液按體積比1:1混合即制得重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白； 1.2)納米磁珠的包被: 1.2.1)取5mg磁珠，用Iml MES緩沖液洗滌三次，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清；所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、粒徑為1150nm的羧基磁珠；所述MES緩沖液是質量濃度是2g/L的2-(N-嗎啉代)乙磺酸；所述MES緩沖液的pH = 6.0 ;所述納米磁分離器的磁性強度是0.4T ； 1.2.2)依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8_12mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是6-10mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以10-40rpm/min于旋轉混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠； 1.2.3)取5個離心管，在每個離心管中加入200 μ L步驟1.2.2)所得到的活化后的磁珠，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為100-400 μ g/ml的由步驟1.1.5)所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各1ml，室溫下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應2_6h，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液,室溫下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應2 h以封閉磁珠上未與抗體反應的羧基；所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/LNaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,所述 PBS 緩沖液的 pH = 7.4 ； 1.2.4)封閉反應完成后，將該5個離心管置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，各用Iml洗滌緩沖液洗滌三遍；所述洗滌緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/LKC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.5ml/L Tween-20，所述洗滌緩沖液的 pH = 7.4 ； 1.2.5)向各個離心管中分別加入Iml保存緩沖液重懸磁珠，置于4°C保存備用；至此制得抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠；所述保存緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KCl，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4,0.3g/LNaN3，5g/L BSA，所述保存緩沖液的pH=7.4 ； 2)多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針的制備: 其具體制備方法包括: 2.1)向微量離心管中依次加入4nmol羧基水溶性量子點、600nmol N-羥基琥珀酰亞胺sulfo-NHS以及600nmol碳二亞胺EDC，以磷酸鹽緩沖液定容為5ml，混合溶液，37°C反應30min后,透析去除過量的作為活化劑的sulfo-NHS及E:DC,得到活化后的量子點；所述羧基水溶性量子點的發射波長是520nm ;所述磷酸鹽緩沖液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉；所述磷酸鹽緩沖液的pH = 7.4 ; 2.2)在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入8-16nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h，加入單端氨基化聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為I %，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應Ih ； 2.3)用0.2μπι PES濾器過濾除去步驟2.2)中的抗體聚集物，然后將濾液轉移到50000MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，除去未發生偶聯反應的抗體和反應中的副產物； 2.4)收集步驟2.3)中超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于2ml磷酸鹽洗滌液中，再將此溶液轉移到一個新的50000 MW超濾離心管中，以8000g離心力在4°C下離心15min，收集超濾離心管濾膜上層量子點-抗體偶聯物溶液，溶于Iml磷酸鹽保存液中，置于4°C保存備用，至此制得量子點標記的抗人IgM納米探針；所述磷酸鹽洗滌液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，4g/L氯化鈉，5ml/L吐溫-20，0.3g/L疊氮鈉，所述磷酸鹽洗滌液的pH = 7.4 ;所述磷酸鹽保存液中各成分含量如下:2.9g/L磷酸氫二鈉，0.295g/L磷酸二氫鈉，2g/L氯化鈉，10g/L牛血清白蛋白，0.3g/L疊氮鈉；所述磷酸鹽保存液的pH = 7.4 ; 2.5)按與步驟2.1)-2.4)相同的方法利用鼠抗人IgG單克隆抗體與發射波長為600nm的羧基水溶性量子點制得量子點標記的抗人IgG納米探針；將上述兩種量子點標記的納米探針溶液按體積比1:1混合，即制得多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針； 3)PBST緩沖液的配制: 其具體配制方法包括:
取 8g NaCL, 0.2g KC1,0.24 KH2PO4,1.44g Na2HPO4, 5g BSA，0.3g NaN3,0.5ml Tween-20溶解于900ml蒸餾水中，用5M NaOH調整pH至7.4，再定容至100ml ； 4)質控品的制備: 4.1)陽性質控品: 4.1.1)抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽性的血清構成； 4.1.2)抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽性質控品:由0.5ml人肺炎鏈球菌感染者的已確定抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性的血清構成； 4.2)陰性質控品:由0.5ml抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清構成。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于:所述步驟1.2.2)中，依次加入用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是10mg/ml的EDC溶液以及用步驟1.2.1)中的MES緩沖液配制的濃度是8mg/ml的sulfo-NHS溶液各0.5ml,以15rpm/min于旋轉混合儀中活化lhr，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清，用Iml步驟1.2.1)中的MES緩沖液重懸，得到活化后的磁珠； 所述步驟1.2.3)中，向各離心管中加入用PBS緩沖液稀釋的濃度為200 μ g/ml的由步驟1.1.5)所制備的重組人肺炎鏈球菌PspA蛋白溶液各Iml,室溫下以15rpm/min于旋轉混合儀中反應3h，置于納米磁分離器中進行磁分離后移除上清后，各加入Iml含lmg/ml乙醇胺的上述PBS緩沖液； 所述步驟2.2)中，在步驟2.1)所得到的活化的量子點中，加入12nmol的鼠抗人IgM單克隆抗體，避光反應2h。
5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于:所述量子點是羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子點。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于:所述磁珠是以超順磁性Fe3O4為內核、殼材料為聚苯乙烯、表面官能團為羧基、粒徑為1150nm的羧基磁珠。
7.一種基于如權利要求2所述的基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒的使用方法，其特征在于:所述使用方法包括以下步驟: 1)取待檢血清樣本5μ I用995 μ I PBSA緩沖液稀釋后將稀釋液轉入1.5ml普通離心管中；所述PBSA緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL,0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4, 5g/L BSA ;所述 PBSA 緩沖液的 pH = 7.4 ； 2)向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠10-100 μ I及基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ I,室溫下以10rpm/min于旋轉混合儀上反應5-25min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清； 3)添加基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的PBST緩沖液Iml洗滌兩遍，采用納米磁分離器磁分離后吸出洗滌液，最后用0.2mlPBS緩沖液重懸磁珠，制得納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點“三明治”復合物；所述PBS緩沖液中各成分含量如下:8g/L NaCL, 0.2g/L KC1，0.24g/L KH2PO4,1.44g/L Na2HPO4Jy^iPBS緩沖液的pH = 7.4 ； 4)將步驟3)得到的納米磁珠-鏈球菌抗體-量子點復合物載于酶標板中，使用熒光酶標儀在激發波長同為365nm，發射波長分別為520nm及600nm的參數下分別對其熒光值進行分別讀數； 5)按上述同樣的方法檢測至少30份經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本，分別讀取發射波長分別為520nm及600nm下的熒光值；所述經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長為520nm的熒光值的平均值與3倍標準差之和記為CUT-OFFl值；所述經臨床各種方法均確定為抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體均為陰性的人血清樣本在發射波長為600nm的熒光值的平均值與3倍標準差之和記為CUT-0FF2值；同時檢測試劑盒中提供的四份陰性質控品樣品及四份陽性質控品樣品，分別讀取發射波長分別為520nm及600nm下的熒光值；四份陰性質控品樣品在發射波長為520nm的熒光值的平均值記為NCXl ;四份陰性質控品樣品在發射波長為600nm的熒光值的平均值記為NCX2值；兩份抗人肺炎鏈球菌IgM抗體陽性質控品樣品在發射波長為520nm的熒光平均值為PCXl ;兩份抗人肺炎鏈球菌IgG抗體陽性質控品樣品在發射波長為及600nm下的熒光值記為PCX2 ； 若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長為520nm的檢測熒光值大于CUT-OFFl值且PCX I/NCXI ^ 2.1,則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陽性； 若步驟4)中待檢樣本在發射波長為520nm的檢測熒光值小于CUT-OFFl值且PCXl/NCXl ^ 2.1，則判斷為人待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgM抗體為陰性； 若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長為600nm的檢測熒光值大于CUT-0FF2值且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陽性； 若步驟4)中待檢血清樣本在發射波長為600nm的檢測熒光值小于CUT-0FF2值且PCX2/NCX2 ^ 2.1，則判斷為待檢血清樣本中抗人肺炎鏈球菌IgG抗體為陰性； 若PCX1/NCX1 < 2.1或PCX2/NCX2 < 2.1，均表明試劑盒失效。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于:所述步驟2)中，向步驟I)中的離心管中依次加入基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的抗人肺炎鏈球菌抗體捕獲納米磁珠20 μ I及基于磁性分離和多色量子點標記的抗人肺炎鏈球菌IgM、IgG抗體快速共檢試劑盒中的多色量子點分別標記的抗人IgM、IgG納米探針50 μ 1，室溫下以10rpm/min于旋轉混合儀上反應15min后取下，將離心管插入納米磁分離器磁分離3min，用移液器吸出上清。
【文檔編號】G01N33/577GK104181302SQ201410404733
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月18日 優先權日:2014年8月18日
【發明者】胡征, 楊波 申請人:湖北工業大學
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