專利名稱：一種蛋白酶譜的活性電泳檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種新型蛋白酶譜的電泳檢測方法，屬于生物技術技術領域。
背景技術：
蛋白酶(proteases, proteinases)也稱為肽酶(peptidases),是一類能水解蛋白質和多肽水解的酶類，廣泛存在于動物、植物和微生物中，執行許多不同的生理功能。根據不同的標準可以將蛋白酶分成很多種。根據水解肽鍵的方式，可細分為內肽酶、外肽酶、轉肽酶等。根據最適pH，可以將蛋白酶分為酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶。MEROPS數據庫記錄了蛋白酶及蛋白酶的肽類抑制劑的相關信息，根據催化中心參與催化的氨基酸的不同，在該數據庫中蛋白酶可分成6大類:天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶和未知催化類型的蛋白酶。蛋白酶是用途最廣泛的酶制劑之一，占了世界酶類銷售總額的60%，在食品、醫藥、紡織、制革、洗滌劑、化妝品、動植物蛋白以及廢物處理等行業都有著很好的應用前景。酶譜分析是一種電泳技術，是在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的基礎上發展而來的，它在聚丙烯酰胺凝膠中添加了底物分子，從而可以檢測酶活性。雖然存在許多不同類型的酶譜分析(根據酶的類型)，其中使用最頻繁的檢測蛋白酶活性的是明膠酶譜分析。上樣緩沖液配方與標準的SDS-PAGE上樣緩沖液基本相同，但是不含還原劑[2-mercaptoetanol, 二硫蘇糖醇(DTT)],也不加熱。電泳結束后，將SDS凝膠在Triton X-100中洗3次，然后將其孵育于一個適當的反應緩沖液中，使酶和底物發生反應，隨后SDS凝膠進行考馬斯亮藍染色，被酶降解的區域會有明顯的條帶顯示。經過五十多年的發展，酶譜法也衍生出很多新的技術，具體有:(I)常規方法，一維酶譜電泳膠中添加蛋白酶底物與膠共聚合。電泳結束后，酶進行膠內復性，降解膠中的底物，此時在膠的藍色背景下會出現白色透明水解條帶。(2) 二維酶譜電泳的原理同一維酶譜電泳，但樣品事先要經過等電聚焦(IEF)初步分離，酶降解底物后膠上會有白色水解圈。(3) 二維電泳結束后得到的水解圈，可通過MALD1-T0F/MS鑒定蛋白酶。(4)組織樣品可直接進行膠內酶解(In-situ zymography, ISZ),這樣就可根據酶活對細胞定位。(5)實時定量酶譜法(Real-time zymography,RTZ)可對酶活的變化定時監測。(6)多層次底物酶譜法(Multiplelayer substrate zymography, MLSZ)可以利用一塊膠來檢測不同的酶。具體方法是樣品經電泳分離后再用電轉的方法將膠里的蛋白轉移到含不同底物的膠上。這就實現了一次電泳，多次檢測的效果。(7)反向酶譜法(Reverse zymography),與其他酶譜法的膠內添加底物不同，這種方法是將酶加入膠中，然后檢測酶的抑制劑。有抑制作用的會在亮的背景里出現黑色條帶。其中底物膠方法雖然常被用來檢測蛋白水解酶類的活性酶譜，但有些蛋白酶在含有底物的膠中的遷移率會受到嚴重影響，所以導致蛋白酶條帶很難分開或是難以確定其分子量。為了解決這一問題，有些研究者就將此方法進行了改良，首先將蛋白酶樣品首先進行不含底物的非變性的SDS-PAGE電泳，在通過電轉將跑好的條帶轉移到事先準備好的含有底物蛋白的另一張凝膠上，反應一段時間后，第二張含有底物的授予膠去染色，脫色，會在相應的位置產生透明的條帶。雖然該方法在一定程度上解決了底物對蛋白酶遷移率受到阻礙的問題，但是要求必須有電轉裝置，而且增加了操作步驟，在電轉過程中還可能造成蛋白酶的失活。本發明針對上述問題進行了改良，通過底物浸泡方法解決了上述傳統方法可能的造成的誤差，可有效應用于蛋白酶譜分析。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種更為快速準確地檢測蛋白酶譜的新方法，應用該方法，可以減少傳統底物膠方法蛋白條帶堆積，分子量偏差，以及使用昂貴儀器的缺點，實現對多種蛋白酶譜進行高通量快速檢測。一種蛋白酶譜的活性電泳檢測方法，包括以下步驟:a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝膠；b.樣品與不含巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時樣品不在沸水浴中加熱；c.電泳；d.洗膠；e.將膠在底物溶液中浸泡；f.反應顯色；步驟b中使用的不含巰基乙醇的加樣緩沖液配方為:60mM Tris-HCl pH6.8、SDS 2%、溴酚蘭0.1%、甘油25%組成，加樣時樣品和加樣緩沖液的體積比為4:1。步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有質量濃度為1%底物的溶液中，37° C溫浴2h。上述方法具體包括以下步驟:I).配制質量濃度為12.5%的分離膠:30%凝膠貯備液1.6ml, pH8.8的1.5mol/L Tris-HCl1.0ml，蒸餾水1.4ml, 10%過硫酸胺25 μ 1，TEMED2.5 μ I ;混勻后立即將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入Iml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5%的上層濃縮膠:30%凝膠貯備液 0.15ml, ρΗ6.8 的 0.5mol/L Tris-HCl0.35ml，蒸餾水 0.5ml, 10% 過硫酸胺 20 μ I,TEMED2.0 μ I ;插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下；2).將樣品與加樣緩沖液混勻后加樣；3).電泳緩沖液為ρΗ8.8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進行；采用垂直板式不連續系統電泳方法，5mA穩流進樣后，IOmA穩流分離樣品直至溴酚蘭指示劑到達膠的最前沿；4).電泳結束后，用預冷的2.5%Triton X-100將膠洗三次，每次15min ;然后用預冷的蒸餾水漂洗數次去除殘留的Triton X-100 ；5).將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有質量濃度為1%底物的溶液中，37° C溫浴2h后用蒸餾水將膠上殘留的底物沖洗干凈，用0.1% (w/v)的考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，然后用脫色液脫色直至透明條帶清晰，其中染色液配方為:lg考馬斯亮藍R-250, 350ml乙醇，IOOml乙酸,加水至IOOOml ;脫色液配方為:250ml乙醇，IOOml乙酸，加水至1000ml。本發明優點和有益效果:1、運用底物浸泡方法測定蛋白酶譜，避免了底物在膠中對蛋白遷移率的影響，本發明所用的蛋白底物反浸的方法同底物膠的方法在耗時上基本相同，但是在活性條帶的分子量的確定上卻有著明顯的優勢，且活性條帶更加清晰，如圖2所示，非常有利于后續的蛋白酶鑒定工作；2、重復性好，靈敏度高，活性條帶測定準確，如圖3所示；3、本發明所用的蛋白底物反浸的方法同電轉方法相比在耗時上明顯縮短，省去了電轉步驟，而且不需要電轉裝置，且在條帶清晰度及分子量準確度上基本相同；4、底物浸泡蛋白酶譜法可以用于各種蛋白酶譜的檢測，有廣闊的應用空間。
圖1、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)胞外蛋白酶底物浸泡法活性酶譜檢測；圖2、海洋弧菌(Vibrio sp.CSH1301)胞外蛋白酶底物浸泡法活性酶譜檢測；1.為本發明的酪蛋白底物浸泡方法；2為酪蛋白底物膠方法；當SDS-PAGE膠中加入酪蛋白底物時，嚴重阻礙了胰蛋白酶的遷移率，酶解條帶彌散，而本發明是將酪蛋白底物反浸入凝膠，所以不會對蛋白遷移率有任何影響，活性條帶清晰；圖3、胰蛋白酶活性電泳；1.為本發明的酪蛋白底物浸泡方法；2為酪蛋白底物膠方法；胰蛋白酶分子量約為23.3kDa，當SDS-PAGE膠中加入酪蛋白底物時，嚴重阻礙了胰蛋白酶的遷移率，造成了胰蛋白酶分子量的偏差，而本發明由于是將底物反浸入凝膠，所以不會對蛋白遷移率有任何影響，而且活性條帶清晰。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的技術方案作進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。本發明使用的試劑:丙稀酰胺、N，N’ -甲叉雙丙稀酰胺、SDS、過硫酸氨(Sigma)，Tris (Sigma進口分裝)，甘氨酸(國產)，酪蛋白(Sigma進口分裝)，其他試劑均為普通市
售產品。實施例1:短小芽孢桿菌蛋白酶底物浸泡法活性酶譜檢測所述短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)菌株購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址:中國科學院微生物研究所，菌種編號CGMCC NO: 1.1625。步驟如下:(I)將購買的短小芽孢桿菌劃線接種于固體培養基，在28°C條件下活化培養3天，然后接種于5ml液體LB培養基中，在28°C、200rpm的條件下震蕩培養I天，然后按5%(v/v)的接種量接種于IOOml的發酵培養基中，在28°C、200rpm的條件下震蕩培養36h，IOOOOrpm離心，制得發酵液；上述固體培養基組分如下，均為重量份:蛋白胨I份，酵母粉0.5份、1.5份瓊脂，蒸餾水100份，pH為7.5 8.0 ;LB培養基組分如下，均為重量份:
蛋白胨I份，酵母粉0.5份，蒸餾水100份，pH為7.5 8.0 ;發酵培養基組分如下，均為重量份:玉米粉I 分，麩皮 0.5 份，豆柏 I 份，Na2HPO40.4 份，KH2PO40.03 份，CaCl20.1 份，蒸餾水 100 份，pH7.5。(2)將步驟(I)制得發酵液在4°C條件下，IOOOOrpm離心lOmin，取上清，制得胞外酶液；4°C冰箱保存待用。(3)配制 12.5%分離膠:30%凝膠貯備液 1.6ml, 1.5mol/L Tris-HCl (ρΗ8.8) 1.0ml,蒸餾水1.4ml, 10%過硫酸胺25 μ 1，TEMED2.5 μ I。混勻后立即小心地將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入Iml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用。聚合完成之后，倒掉覆蓋液體。配制5%上層濃縮膠:30%凝膠貯備液0.15ml，ρΗ6.8 的 0.5mol/L Tris-HCl 0.35ml，蒸餾水 0.5ml, 10% 過硫酸胺 20 μ I, TEMED 2.0 μ I ；插入梳子，小心避免混入氣泡，放置室溫下。(4)將步驟(2)制得的胞外酶液20 μ I與5 μ I加樣緩沖液(使用的加樣緩沖液配方為:60mMTris-HCl pH6.8、SDS 2%、溴酚蘭0.1%、甘油25%組成)混勻，樣品不在沸水浴中加熱。電泳采用垂直板式不連續系統電泳方法，在Mini PR0TAIN3小型垂直電泳槽和蛋白質電泳儀電泳儀上進行。在冰浴中穩壓120V電泳，分離樣品直至溴酚蘭指示劑到達膠的最前沿。(5)電泳結束后，將步驟(4)得到的電泳凝膠用預冷的Triton X-100 (2.5%)洗三次，每次15min。然后用預冷的蒸餾水漂洗數次去除殘留的Triton X-100。(6)將步驟(5)清洗好的膠浸泡在用ρΗ8.0的Tris-HCl緩沖液配制的含有1%酪蛋白溶液中，37° C溫浴2h，然后用蒸餾水將膠上殘留的酪蛋白沖洗干凈，用0.l%(w/v)的考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，然后用脫色液脫色直至透明條帶清晰。其中染色液配方為:lg考馬斯亮藍R_250，350ml乙醇，IOOml乙酸，加水至IOOOml ;脫色液配方為:250ml乙醇，IOOml乙酸，加水至1000ml。酶譜條帶如圖1所示。實施例2:海洋弧菌(Vibrio sp.CSH1301)胞外蛋白酶譜的測定及同底物膠方法比較各操作步驟同實施例1，所不同的是培養基中的蒸餾水換做海水，發酵培養時間為72小時。海洋弧菌(Vibrio sp.CSH1301)為本實驗室分離自海口紅樹林海水的菌株。對照試驗配制12.5%分離膠:30%凝膠忙備液1.6ml, 1.5mol/L Tris-HCl (pH8.8) 1.0ml，蒸懼水
1.0ml，1%的酪蛋白0.4ml，10%過硫酸胺25 μ 1，TEMED 2.5 μ I。混勻后立即小心地將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入Iml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用，聚合完成之后，倒掉覆蓋液體。配制5%上層濃縮膠，插入梳子，小心避免混入氣泡，放置室溫下。對照試驗與本發明的不同在于配膠時加入終濃度0.1%的酪蛋白，其它的試驗步驟及電泳儀器均相同。凝膠經漂洗后，底物膠浸泡在Tris-HCl(pH8.0)緩沖液中37° C溫浴2h，而非底物膠浸泡在Tris-HCl (pH8.0)緩沖液配制的含有1%酪蛋白的溶液中，37° C溫浴2h，然后用考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，最后用脫色液脫色直至透明條帶清晰。蛋白酶譜條帶如圖2所示。實施例3:胰蛋白酶Trypsin蛋白酶譜的測定及同底物膠方法比較各操作步驟同實施例，所不同的是采用購買的上海生工的商品酶制劑，胰蛋白酶Trypsin，本發明的底物浸泡方法同底物膠方法進行對比。對照試驗電泳膠配制同實施例2，37° C溫浴2h，然后用考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，最后用脫色液脫色直至透明條帶清晰。胰蛋白酶譜條帶如圖3所示。
權利要求
1.一種蛋白酶譜的活性電泳檢測方法，其特征在于，包括以下步驟: a.制備不含蛋白酶底物的SDS聚丙烯酸胺凝膠； b.樣品與不含巰基乙醇的加樣緩沖液混勻后加樣，且加樣時樣品不在沸水浴中加執.c.電泳； d.洗膠； e.將膠在底物溶液中浸泡； f.反應顯色。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟b中使用的不含β-巰基乙醇的加樣緩沖液配方為:60mM Tris-HCl pH6.8、SDS2%、溴酚蘭0.1%、甘油25%組成，加樣時樣品和加樣緩沖液的體積比為4:1。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于， 步驟e中將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有質量濃度為0.25-2%底物的溶液中，30-40 ° C 溫浴 l-3h。
4.根據權利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，具體包括以下步驟:制質量濃度為12.5%的分離膠:30%凝膠貯備液1.6ml, pH8.8的1.5mol/LTris-HCl1.0ml，蒸餾水1.4ml, 10%過硫酸胺25 μ 1，TEMED 2.5 μ I ;混勻后立即將分離膠注入準備好的玻璃板間隙中，用滴管輕輕在其頂層加入Iml蒸餾水，以阻止空氣中的氧氣對凝膠聚合的抑制作用；聚合完成之后，倒掉覆蓋液體；配制5%的上層濃縮膠:30%凝膠貯備液 0.15ml，pH6.8 的 0.5mol/L Tris-HCl 0.35ml，蒸餾水 0.5ml, 10% 過硫酸胺 20 μ I，TEMEDμ I ;插入梳子，避免混入氣泡，放置室溫下； 2).將樣品與加樣緩沖液混勻后加樣； 3).電泳緩沖液為ρΗ8.8的Tris-甘氨酸緩沖液；電泳在冰浴中進行；采用垂直板式不連續系統電泳方法，5mA穩流進樣后，IOmA穩流分離樣品直至溴酚蘭指示劑到達膠的最前沿； 4).電泳結束后，用預冷的2.5%Triton X-100將膠洗三次，每次15min ;然后用預冷的蒸餾水漂洗數次去除殘留的Triton X-100 ； 5).將膠浸泡在用Tris-HCl緩沖液配制的含有質量濃度為1%底物的溶液中，37°C溫浴2h后用蒸餾水將膠上殘留的底物沖洗干凈，用0.1% (w/v)的考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，然后用脫色液脫色直至透明條帶清晰，其中染色液配方為:lg考馬斯亮藍R-250，350ml乙醇，IOOml乙酸，加水至IOOOml ;脫色液配方為:250ml乙醇，IOOml乙酸，加水至IOOOml0
全文摘要
本發明提供了一種蛋白酶譜電泳檢測方法，屬于生物技術技術領域。該方法包括制膠、加樣、電泳、洗膠、反應顯色步驟，其中制膠時沒有向凝膠里加入蛋白酶底物，而在顯色之前將膠在1%的底物溶液中浸泡。避免了底物在膠中對蛋白遷移率的影響,不需要價格昂貴的電轉設備,可以用于各種蛋白酶譜的檢測，應用廣泛。
文檔編號G01N27/447GK103105427SQ20131001849
公開日2013年5月15日 申請日期2013年1月18日 優先權日2013年1月18日
發明者何海倫, 陳淑華, 劉丹, 楊興昊, 黃嘉豐 申請人:中南大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
