基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選方法，本發明設計了1對引物用于擴增MYOD1基因5′調控區的啟動子區片段，將膠回收產物用T-載體PCR產物克隆試劑盒構建含有目的片段的重組質粒，然后利用Promoter-BindingTFProfilingAssayI和NuclearExtractionKit（CatalogNumberSK-0001）進行MYOD1基因啟動子區轉錄因子結合位點的篩選，便于對牛MYOD1基因啟動子的調控方式及調控元件進行研究。本發明的方法具有靈敏度高、檢測速度快、操作簡單、同時篩選多種轉錄因子、不需使用放射性同位素等優點。
【專利說明】基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及分子遺傳學、蛋白質組學領域，尤其是一種基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選方法。
【背景技術】
[0002]真核生物基因表達的時間和水平嚴格按照發育順序進行。某些特定基因表達的調節由轉錄因子特異性結合于調控區相關元件，成為轉錄起始的關鍵步驟，并最終導致基因的時間和空間表達。編碼組織特異蛋白的基因嚴格按照組織特異性和發育階段性表達，為基因表達調控機制提供了很好的研究|吳式。在特異聞效表達的轉基因動物中，獲得能廣泛應用的特異性啟動子非常重要。但啟動子的特異性由多個元件控制，在不同種類和不同發育時期起關鍵作用的調控元件并不相同，調控元件和反式作用因子之間的相互作用也十分復雜。
[0003]/的全稱為myogenic differentiation I，其中文名稱為生肌決定因子，是骨骼肌生長發育過程中重要的正調控基因，在肌肉特異基因轉錄調控中，MyoD /起著總開關的作用，可以結合到肌細胞生成素(myogenin)、肌酸激酶CK、肌球蛋白、結蛋白等基因啟動子區發揮重要調控作用，促進它們的轉錄激活。生肌決定因子/的主要功能包括:促使靜止期的肌衛星細胞向成肌細胞轉化；能把許多種類型細胞轉化為成肌細胞，并可促進成肌細胞進一步融合、分化為成熟的肌纖維。
[0004]MyoD I介導的肌分化機制作為研究細胞分化的最佳模型，已成為當前眾多學者研究的焦點。目前，國內外對該基因的表達調控在小鼠、雞和豬的肌細胞生成機理等方面的相關研究較多，在牛上已有一些研究，包括遺傳變異及功能研究等，但主要集中在轉錄后和翻譯水平，/基因轉錄調控的分子機制尚不清楚。因此，篩選/基因啟動子的轉錄因子結合位點為探究/基因的轉錄調控有一定的意義，為轉基因牛的培育和牛肉品質的提聞提供理論依據。MyoD /基因啟動子的研究具有廣闊的研究如景。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是:提供一種基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選方法，它具有靈敏度高、檢測速度快、檢測種類多、操作簡單等優點，克服了凝膠遷移試驗和構建一系列啟動子缺失或突變的報告體的復雜性。
[0006]本發明是這樣實現的:基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選方法，包括以下步驟:
步驟I)進行目的片段的克隆，構建含有目的片段的T載體:根據NCBI上牛MYODl基因的序列進行啟動子的生物信息學分析，找到該基因的轉錄起始位點，并預測其啟動子區；然后根據5，調控區序列設計I對兩端引物，以基因組DNA為模板，利用PCR反應進行擴增，獲得目的片段；對目的片段進行膠回收純化；再將純化的目的片段與PUCm-T載體連接過夜；過夜后將連接體系轉化DH5 α感受態細胞，然后進行鋪板培養過夜；步驟2)重組質粒的鑒定:挑取上述平板上的白斑單菌落進行搖菌培養過夜，然后提取質粒進行per，將per產物送出測序；將測序結果與NCBI上的序列進行比對，利用測序正確的質粒為模版進行目的片段的大量擴增，然后進行膠回收并純化；將測序正確的質粒菌液加甘油后_80°C保存；
步驟3:目的片段的濃縮:將上述回收純化的目的片段混到一起，然后加2倍目的片段總體積的無水乙醇、與目的片段總體積相等的異丙醇，以及濃度為3mol/l的目的片段總體積的1/10的醋酸鈉，然后混勻沉淀30分鐘之后，在轉速為12000-15000rpm/min的條件下，離心3-5min，去除上清液；加質量百分比為75%的乙醇Iml，用這些乙醇沖洗管壁直至混勻，然后在轉速為12000-15000rpm/min的條件下,離心3-5min,去除上清液；重復一次,然后將管子倒扣在紙上晾干，直至無乙醇味；用ddH20溶解，并沖洗管壁振蕩混勻，測其濃度；
步驟4)細胞核提取物的提取:利用Nuclear Extraction Kit試劑盒提取牛肌肉組織的細胞核提取物，并利用BCA蛋白定量試劑盒對所提的細胞核提取物進行濃度測定；
步驟5)牛#76497基因啟動子區轉錄因子結合位點的預測:利用Promoter-Binding TFProfiling Assay I所提的細胞核提取物和回收純化后濃縮的目的片段進行牛基因啟動子區的轉錄因子結合位點的篩選實驗，實驗結束后，對實驗結果進行分析處理，即完成了基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選。
[0007]單--次試驗可明確48種TF與特定啟動子的結合，
由于采用了上述技術方案，本發明設計了 I對引物用于擴增基因5'調控區的啟動子區片段，將膠回收產物用T-載體PCR產物克隆試劑盒構建含有目的片段的重組質粒，然后利用Promoter-Binding TF Profiling Assay I和Nuclear Extraction Kit (CatalogNumber SK-0001)進行MY0D1基因啟動子區轉錄因子結合位點的篩選，便于對牛MY0D1基因啟動子的調控方式 及調控元件進行研究。本發明的方法具有靈敏度高、檢測速度快、操作簡單、同時篩選多種轉錄因子、不需使用放射性同位素等優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1為從牛肌肉組織中提取的DNA的電泳示意圖；
圖2為本發明中的以圖1中的DNA為模板進行的/基因5'調控區啟動子區片段的per擴增的電泳示意圖；
圖3為本發明中的圖2中的per產物的膠回收產物的電泳示意圖；
圖4為構建的重組T載體質粒的電泳示意圖；
圖5為以重組T載體質粒為模板進行的/基因5'調控區啟動子區片段的per擴增的電泳示意圖；
圖6為圖5中的per產物的膠回收產物的電泳示意圖。
【具體實施方式】
[0009]本發明的實施例:基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選方法，具體如下:
一、菌株、質粒以及試劑的準備
菌株:大腸桿菌感受態細胞DH5 α購自大連Takara公司；Promoter-Binding TF Profiling Assay I 和 Nuclear Extraction Kit (CatalogNumber SK-0001 )試劑盒購自 Signosis 公司；
試劑來源:2XEs Taq MasterMix和BCA蛋白定量試劑盒購自康為世紀公司；質粒小量抽提試劑盒、動物組織DNA提取試劑盒、T-載體PCR產物克隆試劑盒、、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工；其他試劑均為國產分析純。
[0010]試劑配制:
Amp (100 mg/ml):稱取Ampicillin 5g,加50ml超純水溶解,0.22 μ m過濾除菌后,按I ml/份分裝，-20 °C保存。
[0011]IPTG貯存液(0.1 M):稱取IPTG 0.6g，用超純水溶解定容至25 ml, -20°C冷凍保存。
[0012]X-gal (20mg/ml):稱取 0.4gX_gal (5_ 溴 ~4~ 氯 _3_ 口引哚-β -D-半乳糖苷)粉末，溶于二甲基甲酰胺，定容至20ml。0.22 μ m過濾除菌后，按I ml/份分裝于1.5ml離心管，用鋁箔封裹避光保存于_20°C。
[0013]LB液體培養基:稱取胰蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCl lg，置于100ml三角瓶中，加入95ml超純水溶解，調pH值至7.0，加超純水至總體積為100ml，121 1:高壓滅菌30min,冷卻至室溫,臨用時加入抗生素,氨節青霉素工作濃度為100 μ g/ml。
[0014]LB固體培養基:稱取胰蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCl lg，細菌用瓊脂1.5g置于100mL三角瓶中，加入95ml超純水溶解，調pH值至7.0，加超純水至總體積為100ml，高壓滅菌后冷卻至45°C左右,加入抗生素(100 μ g/ml),搖勻后倒入培養皿。
SOC培養基:稱取胰蛋白胨2g，酵母提取物0.5g，加0.05%的NaCl，2.5 mM KCl，10 mMMgC12, 20 mM葡萄糖配制成100 ml。
[0015]PBS 緩沖液:KC1 0.29，KH2P040.2g, NaCl 8.0g, Na2HP04.12H20 2.88g,溶于900ml超純水中，調pH值至7.0-7.2，定容至1000ml，121 °C高壓滅菌30 min后4°C保存。
[0016]二、重組質粒的構建
步驟1、牛/基因啟動子T載體重組質粒的構建
1.根據牛/基因5'調控區序列設計一組兩端引物，上游引物的序列是5'-ACCTCCCGACATCATACATT-3'，下游引物的序列為:5' - GGTTTGGGTTGCTAGACG-3'。
[0017]2.以基因組DNA為模板，利用常規PCR反應進行擴增。
[0018]反應條件為:在94°C變性2min，再在94°C循環30s，然后在59°C退火30s，再在72°C延伸80s，進行35個循環，最后在72°C最終延伸2min。
[0019]3.反應結束后，取5 μ I反應產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0020](I)加入I g的瓊脂糖至100ml I X TAE電泳緩沖液中。
[0021](2)微波爐中加熱使瓊脂糖完全溶解，溶液冷卻至60°C (手背接觸三角瓶壁不燙手),加入Goldview染料5微升,輕輕搖勻。
[0022](3)倒膠,厚度為0.3-0.5cm,然后放置好梳子。
[0023](4)待膠冷卻后，輕輕拔掉梳子，置于電泳槽中，加電泳緩沖液至完全覆蓋膠面。
[0024](5)上樣，電泳，穩壓 100V，30_40min。
[0025](6)取出凝膠，在紫外燈下檢查凝膠，并用凝膠成像系統記錄結果。
[0026]4.瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產物。[0027](I) PCR產物目的條帶的切割和稱重，并按每IOOmg瓊脂糖中加入300-600 μ I的溶膠液Buffer B2,充分混勻。
[0028](2) 50°C水浴5-10min，間或混勻，直至膠完全熔化，將所得溶液轉移至吸附柱中，8000 Xg室溫離心30秒，棄上清。
[0029](3)將吸附柱中加入500μ I漂洗液，9000Xg室溫離心30妙，棄上清。
[0030](4)重復步驟(3) —次。
[0031](5)將吸附柱于9000Xg室溫離心I分鐘，除去殘留的漂洗液，將吸附柱室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的漂洗液。
[0032](6)取出吸附柱，放入一個新的1.5ml離心管中，向吸附柱中間部分滴加15-40 μ lddH20,室溫靜置1-2分鐘。9000Xg室溫離心I分鐘洗脫DNA，收集管中溶液，將所得到的DNA溶液置于-20度保存或用于后續試驗。
[0033]5.牛MyoD /基因啟動子T載體重組質粒的構建
利用T-載體PCR產物克隆試劑盒進行牛基因啟動子T載體重組質粒的構建，反應體系如下:
膠回收的PCR產物3μ1
pUCm-T 載體I μ I
IOXLigation BufferI μ I
50%PEG 4000I μ I
Sterilized ddH203 μ I
T4 DNA LigationI μ I
混勻，16 °C連接過夜
6.連接產物轉化DH5a菌株 轉化的步驟如下:
(I)取100 μ I感受態細胞，置于冰上，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。
[0034](2)將上述的連接液全部加入感受態細胞中，輕輕混勻，冰上放置30分鐘。
[0035](3) 42°C水浴熱激90秒，冰上放置15-20分鐘。
[0036](4)加 400 μ ISOC 培養基，37°C 200_250rpm 振蕩培養 I 小時。
[0037](5)室溫下4000rpm離心5分鐘，用槍頭吸掉400 μ I上清液，用剩余的培養基將細胞懸浮。
[0038](6)將細菌涂布在預先用20 μ IlOOMm IPTG和100 μ I 20mg/ml X-gal涂布的氨芐青霉素平板上。
[0039](7)平板在37°C下正向放置I小時以吸收過多的液體，然后倒置培養過夜。
[0040]步驟2、重組質粒的篩選、鑒定
(I)藍白斑的篩選培養:挑取上述固體培養基上的白色單菌落于裝有5ml含有終濃度為20mg/ml氨芐青霉素的LB液體培養基中，于37°C 200rpm/h的培養箱中搖菌培養過夜。
[0041](2)利用質粒DNA小量抽提試劑盒提取重組質粒，并進行電泳檢測。
[0042](3)以重組質粒為模板進行關嶺牛MYODl基因啟動子得PCR克隆，并將PCR產物進行電泳檢測。
[0043](4)將有目的條帶的PCR產物送到英維捷基(上海)貿易有限公司測序，并將測序結果與NCBI上的序列進行比對。
[0044](5)利用測序正確的質粒為模板進行目的片段的大量擴增，并將PCR產物進行膠回收。
[0045]步驟3、目的片段的濃縮
將上述回收純化的目的片段混到一起，然后加2倍體積的無水乙醇、等體積的異丙醇和十分之一體積的3mol/l醋酸鈉，然后混勻沉淀30分鐘之后12000-15000rpm/min離心3-5min，去除上清液；加75%的乙醇1ml，不斷用75%的乙醇沖洗管壁混勻，然后同上離心3-5min，去除上清液；重復一次，然后管子倒扣在紙上晾干，直至無乙醇味；用ddH20溶解，并沖洗管壁振蕩混勻，并測其濃度。
[0046]步驟4、利用 Nuclear Extraction Kit (Catalog Number SK-0001 )試劑盒提取關嶺牛肌肉組織的細胞核提取物，并利用BCA蛋白定量試劑盒對所提的細胞核提取物進行濃度測定。
[0047]步驟5、利用Promoter-Binding TF Profiling Assay 1、所提的細胞核提取物和大量回收純化的目的片段進行牛基因啟動子區轉錄因子結合位點的篩選實驗。
[0048]步驟6、數據分析 將實驗結果按以下方式處理:
對照組處理結果=對照組結果的平均值-空白組的平均值；
實驗組處理結果=實驗組結果的平均值-空白組的平均值；
判斷值=對照組處理結果/實驗組處理結果
如果判斷值大于3就說明啟動子區含有相應的轉錄因子結合位點。利用Promoter-Binding TF Profiling Assay I試劑盒和前面純化濃縮的目的片段以及細胞核提取物進行牛/基因啟動子區的轉錄因子結合位點的篩選，數據處理結果如表1所示。從結果中我們可以初步判定/基因啟動子區有以下的轉錄因子結合位點。
【權利要求】
1.一種基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選方法，其特征在于:包括以下步驟: 步驟I)進行目的片段的克隆，構建含有目的片段的T載體:根據NCBI上牛MYODl基因的序列進行啟動子的生物信息學分析，找到該基因的轉錄起始位點，并預測其啟動子區；然后根據5，調控區序列設計I對兩端引物，以基因組DNA為模板，利用PCR反應進行擴增，獲得目的片段；對目的片段進行膠回收純化；再將純化的目的片段與PUCm-T載體連接過夜；過夜后將連接體系轉化DH5 α感受態細胞，然后進行鋪板培養過夜； 步驟2)重組質粒的鑒定:挑取上述平板上的白斑單菌落進行搖菌培養過夜，然后提取質粒進行per，將per產物送出測序；將測序結果與NCBI上的序列進行比對，利用測序正確的質粒為模版進行目的片段的大量擴增，然后進行膠回收并純化；將測序正確的質粒菌液加甘油后_80°C保存； 步驟3:目的片段的濃縮:將上述回收純化的目的片段混到一起，然后加2倍目的片段總體積的無水乙醇、與目的片段總體積相等的異丙醇，以及濃度為3mol/l的目的片段總體積的1/10的醋酸鈉，然后混勻沉淀30分鐘之后，在轉速為12000-15000rpm/min的條件下，離心3-5min，去除上清液；加質量百分比為75%的乙醇1ml，用這些乙醇沖洗管壁直至混勻，然后在轉速為12000-15000rpm/min的條件下,離心3-5min,去除上清液；重復一次,然后將管子倒扣在紙上晾干，直至無乙醇味；用ddH20溶解，并沖洗管壁振蕩混勻，測其濃度； 步驟4)細胞核提取物的提取:利用Nuclear Extraction Kit試劑盒提取牛肌肉組織的細胞核提取物，并利用BCA蛋白定量試劑盒對所提的細胞核提取物進行濃度測定； 步驟5)牛#76497基因啟動子區轉錄因子結合位點的預測:利用Promoter-Binding TFProfiling Assay I所提的細胞核提取物和回收純化后濃縮的目的片段進行牛基因啟動子區的轉錄因子結合位點的篩選實驗，實驗結束后，對實驗結果進行分析處理，即完成了基因啟動子區轉錄因子結合位點的多通量篩選。
【文檔編號】G01N33/68GK103869081SQ201410094856
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月16日 優先權日:2014年3月16日
【發明者】許厚強, 張雯, 陳偉, 陳祥, 趙佳福, 桓聰聰 申請人:貴州大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
