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一種gc-ms靶向性煙草樣品甾醇提取方法
【專利摘要】一種GC-MS靶向性煙草樣品甾醇提取方法，包括以下工藝步驟：1）煙草樣品冷凍凍干，粉碎機打碎；2）粉碎好樣品50mg加入正己烷1.5ml，超聲提?。?）提取完樣品室溫高速離心，上清轉移到色譜瓶，氮氣吹干，為一；4）沉淀加80%甲醇、20%KOH溶液1.2ml；5）高速離心，取上清轉移至色譜瓶，加正己烷1.0ml，震蕩、靜置；6）取上清，加飽和NaCl1.0ml，取上清為溶液二，一二合并，氮氣吹干，加氯仿0.5ml溶解后，即為專一適于GC-MS測定的煙草樣品甾醇上樣分析溶液。本發明的優點在于：提供了一種最適合煙草葉片甾醇的提取方法；樣品用量少，僅為50mg；有機試劑使用種類少，使用量少，相對便宜，毒性較小；提取時間更短，樣品重現性較好。
【專利說明】—種GC-MS靶向性煙草樣品留醇提取方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明涉及煙草代謝組學新鮮煙葉樣品留醇提取方法，具體是一種GC-MS靶向性煙草樣品留醇提取方法，本發明以GC-MS為分析平臺，采用了 SIM離子模式，分析出適合煙草葉片留醇的最佳提取方法。
【背景技術】
[0003]植物留醇是一類廣泛存在于自然界中的留體化合物，屬于飽和或不飽和的仲醇，以往人們針對動物留醇類物質的研究較多，而對植物留醇有所忽視。煙草中含有多種甾醇類化合物，主要為膽留醇、豆留醇、菜油留醇和β -谷留醇等，是構成煙葉油分的主要成分之一。但當煙葉在燃吸時，留醇的母體多環結構也可形成稠環芳烴，如豆留醇在750°C下熱解生成苯并[α ]]^(Stedman R L, 1968),因此分析煙草中的植物留醇對卷煙減害降焦研究十分必要。盡可能多的一次檢測到鮮煙葉樣品中的留醇化合物，并準確定性定量，為煙草代謝組學研究提供技術支撐。煙草中常見留醇的分析方法有衍生化氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、超臨界流體色譜法和氣質聯用法等。
[0004]代謝組學研究中最容易引入系統誤差的是樣品制備過程，其它植物留醇通常用有機溶劑(如甲醇和氯仿等)提取。目前還沒有新鮮煙葉留醇通用的抽提方法，只能根據其它植物及烤后煙葉的提取方法，結合使用的檢測方法(GC-MS)，建立新鮮煙葉留醇通用提取方法。
[0005]因此建立一種簡單、重現性好的新鮮煙葉留醇提取方法很有必要，可為后期甾醇的定性定量提供保障，也為煙草代謝組學研究提供技術支持。

【發明內容】

[0006]本發明的目的正是基于上述現有技術狀況而專門提供的一種GC-MS靶向性煙草樣品甾醇提取方法，利用該方法可實現鮮煙葉樣品甾醇的快速、有效提取，且具有提取簡單、重現性好的特點。
[0007]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的: 一種GC-MS靶向性煙草樣品留醇提取方法，包括以下工藝步驟:
1)煙草樣品冷凍凍干(凍干機凍干溫度為_40°C)，粉碎機打碎；
2)粉碎好樣品50mg加入正己烷1.5ml，25°C下超聲提取20 min ；
3)提取完樣品室溫(20°C)高速離心，上清轉移到色譜瓶，氮氣吹干，為一；
4)沉淀加80% 甲醇、20%K0H 溶液 1.2ml, 700C 30min ；
5)高速離心，取上清轉移至色譜瓶，加正己烷1.0ml，震蕩、靜置；
6)取上清，加飽和NaCl1.0ml，取上清為溶液二，一二合并，氮氣吹干，加氯仿0.5 ml溶解后，即為專一適于GC-MS測定的煙草樣品留醇上樣分析溶液。
[0008]在本發明中我，所述煙草樣品為新鮮煙草葉片。[0009]步驟3)、5)中的高速離心時離心速率為12000rpm，時間lOmin，所用的色譜瓶為尖
底色譜瓶(以便于溶液混合和氮氣吹干)。
[0010]本發明提取時所用抽提溶液為正己烷，相對其他溶劑(氯仿等)，因正己烷密度小(0.6594g/ml)、揮發性小、毒性小，便于煙葉樣品沉淀離心，也利于提高樣品檢測重復性，減少對操作人員的毒害。
[0011]本發明具有以下優點:
1.提供了一種最適合煙草葉片留醇的提取方法。
[0012]2.樣品用量少，僅為50mg。
[0013]3.有機試劑使用種類少，使用量少，相對便宜，毒性較小。
[0014]4.提取時間短，樣品重現性好。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為本發明工藝流程圖。
[0016]圖2為本提取方法的實驗樣本植物甾醇的色譜峰圖。
[0017]圖3為采用本發明方法對中煙100成熟期新鮮煙葉進行6次重復的植物留醇色譜峰圖。
【具體實施方式】
[0018]本發明以下結合實施例作進一步描述 實施案例
I)本提取方法的實驗樣本留醇的色譜峰圖
采用該方法對2012年河南中煙100新鮮煙葉樣品進行提取，通過GC-MS (SIM)法分析，色譜峰如圖2所示，可明確定性7種留醇(依據已有標樣，1、2為內標)，已經為所見文獻中最多。本發明所確立的提取方法:以正己烷作為提取溶劑(便于煙葉樣品沉淀離心，利于提高樣品檢測重復性，減少對操作人員的毒害)，超聲提取20min，80%甲醇、20%K0H溶液作為皂化劑，飽和氯化鈉溶液洗滌。
[0019]2)方法重復性考查
采用該方法對中煙100成熟期新鮮煙葉進行了 6次重復的進樣分析，分析結果見圖3，隨機序列分析中，單獨提取的6次重復實驗，重現性好。
【權利要求】
1.一種GC-MS靶向性煙草樣品留醇提取方法，其特征在于:包括以下工藝步驟:1)煙草樣品冷凍凍干，粉碎機打碎； 2)粉碎好樣品50mg加入正己烷1.5ml，25°C下超聲提取20 min ； 3)提取完樣品室溫(20°C)高速離心，上清轉移到色譜瓶，氮氣吹干，為一； 4)沉淀加80% 甲醇、20%K0H 溶液 1.2ml, 700C 30min ； 5)高速離心，取上清轉移至色譜瓶，加正己烷1.0ml，震蕩、靜置； 6)取上清，加飽和NaCl1.0ml，取上清為溶液二，一二合并，氮氣吹干，加氯仿0.5 ml溶解后，即為專一適于GC-MS測定的煙草樣品留醇上樣分析溶液。
2.根據權利要求1所述的GC-MS靶向性煙草樣品留醇提取方法，其特征在于:所述煙草樣品為新鮮煙草葉片。
3.根據權利要求1所述的GC-MS靶向性煙草樣品留醇提取方法，其特征在于:步驟3)、5)中的高速離心時離心速率為12000rpm,時間lOmin。
4.根據權利要求1所述的GC-MS靶向性煙草樣品留醇提取方法，其特征在于:步驟3)、5)中所用的色譜瓶為尖底色譜瓶(以便于溶液混合和氮氣吹干)。
5.根據權利要求1所述的GC-MS靶向性煙草樣品留醇提取方法，其特征在于:冷凍凍干時的凍干機凍干溫度為_40°`C。
【文檔編號】G01N30/06GK103713072SQ201410004090
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月6日 優先權日:2014年1月6日
【發明者】翟妞, 陳千思, 劉萍萍, 金立鋒, 周會娜, 陳霞, 趙閣, 張麗, 王曉瑜, 孫世豪 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院