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基于m13噬菌體檢測赭曲霉毒素a的免疫層析試紙及制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種基于M13噬菌體快速檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙及制備方法，試紙吸附層包括吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層和吸水材料層，纖維素膜層上設(shè)有用展示OTA模擬表位的M13噬菌體印制的檢測印跡以及用羊抗小鼠IgG抗體溶液的對照印跡；金標(biāo)抗體為膠體金標(biāo)記的OTA單克隆抗體或多克隆抗體。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了基于M13噬菌體的免疫層析技術(shù)在快速檢測OTA殘留中的應(yīng)用，用展示有OTA模擬表位的M13噬菌體取代了傳統(tǒng)試紙條檢測印記上印制的OTA偶聯(lián)物，避免了OTA偶聯(lián)物對于試紙生產(chǎn)者、實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境的危害；該試紙檢測的特異性強(qiáng)、靈敏度高，檢測簡便、直觀、準(zhǔn)確，成本低，適用范圍廣。
【專利說明】基于M13噬菌體檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種免疫層析試紙，特別是涉及一種以展示有OTA模擬表位的M13噬菌體作為檢測印記，用于快速檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙及其制備方法。
[0002]【背景技術(shù)】
赭曲霉毒素(Ochratoxin)是曲霉屬和青霉屬的某些菌株產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，它包含七種結(jié)構(gòu)類似的化合物，其中毒性最大、分布最廣、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)作物污染最重、與人類健康關(guān)系最密切的是赭曲霉毒素A (Ochratoxin Α，0ΤΑ)，其作用的靶器官主要是腎臟和肝臟，是一種強(qiáng)烈的腎、肝毒素，并具有較強(qiáng)的致癌、致畸和致突變作用。由于OTA廣泛存在于農(nóng)產(chǎn)品及畜產(chǎn)品，且能經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體，對人類生命健康造成危害，因此，如何實(shí)現(xiàn)對OTA的快速、準(zhǔn)確檢測意義重大。
[0003]目前，對OTA檢測方法有化學(xué)分析法、儀器分析法和免疫學(xué)分析法等。其中免疫學(xué)分析法以敏感度高、檢出限低的優(yōu)勢在OTA定性、定量檢測中廣泛應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了 OTA快速、簡便、高靈敏檢測，對保障我國農(nóng)產(chǎn)品安全有著積極意義。但是，免疫學(xué)檢測方法是建立在以標(biāo)記毒素或偶聯(lián)毒素為競爭抗原基礎(chǔ)上的有毒檢測體系，存在毒素標(biāo)品昂貴，對生產(chǎn)及操作人員的健康有害，以及偶聯(lián)反應(yīng)重復(fù)性差等缺陷，制約了它的應(yīng)用和推廣。
[0004]近年來，利用噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)得到的模擬表位肽替代毒素作為競爭抗原，建立的無毒檢測體系，推動了 OTA免疫學(xué)檢測的快速發(fā)展。噬菌體隨機(jī)肽庫技術(shù)是以大量隨機(jī)編碼的多肽序列插入噬菌體展示載體，形成噬菌體展示文庫。每個噬菌體粒子或者噬菌體只展示一種序列的外源肽鏈，不同的噬菌體粒子或者噬菌體展示不同序列的外源肽鏈。
[0005]免疫試紙法具有半定量和一定的定量能力，可以提供待測物的初步信息，該法靈敏度高，分析過程簡單，用作OTA的檢測有獨(dú)特優(yōu)勢，是需要優(yōu)先發(fā)展的檢測技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題:針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種安全、特異、靈敏、簡便、快速檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙及其制備方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:
一種基于M13噬菌體檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙，包括底層的支撐層、中間層的吸附層和固定在吸附層上的保護(hù)層，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，在纖維素膜層上設(shè)有用展示OTA模擬表位的M13噬菌體印制的隱形檢測印跡，還設(shè)有用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層采用吸附金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體采用膠體金納米顆粒標(biāo)記的OTA的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0008]所述OTA模擬表位的多肽序列為MPLWXDL，X為任意氨基酸。
[0009]所述Ml3噬菌體由以下方法篩選，具體步驟為:
(I)親和篩選M13噬菌體隨機(jī)七肽庫 取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，每孔加入稀釋后的噬菌體肽庫100 μ L，其中含噬菌體IX IO11?2 X IO11Pfu,室溫下輕搖震蕩lh，棄去液體；沉淀用TBST溶液洗滌10次，洗去未結(jié)合的噬菌體后，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脫液Gly-HCl，室溫下輕搖震蕩8min，吸出洗脫液，加入中和緩沖液至中性；中和后的洗脫液除留一部分作滴度測定外，其余的洗脫液接種處于對數(shù)生長前期的E.coli ER2738的LB培養(yǎng)液中，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；于37°C震蕩培養(yǎng)4-5h，4°C、12000rpm離心lOmin，向上清液中加入占上清液1/6體積的PEG/NaCl溶液，4°C沉淀過夜；沉淀后，4°C、12000rpm離心15min，棄上清，再用TBST溶液懸浮噬菌體，加入占TBST溶液1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C離心15min，去上清，沉淀用TBST溶液懸浮；
測定滴度后，進(jìn)行第2次、第3次和第4次親和篩選；每次加入噬菌體的量為I X IO11?2 X 10npfu，包被的抗體量分別為75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量從第2次篩選起增至0.5%，其余步驟與第I輪篩選相同，第4次篩選后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)滴度測定后，從總量不到100個噬菌斑的平板上挑選若干藍(lán)色噬菌斑，分別接種處于對數(shù)生長期前期的疋coli ER2738的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，純化并測定滴度；
(2)鑒定噬菌體克隆
取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，加入要鑒定的噬菌體克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13的單克隆抗體，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加入2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；
然后采取競爭ELISA方法鑒定陽性噬菌體克隆的敏感性，加入不同濃度的OTA稀釋液和陽性噬菌體，于37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；計(jì)算各濃度下噬菌體的結(jié)合率，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷噬菌體克隆的敏感性；
(3)DNA測序及多肽序列分析
將擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行測序，根據(jù)插入的DNA序列翻譯出氨基酸序列，采用的-96 g III測序引物為Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模擬表位的氨基酸序列為MPLWXDL，X為任意氨基酸。
[0010]所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。
[0011]所述隱形檢測印跡和隱形對照印跡為平行排列的“ I I ”直線式印跡、“十十”字型排列印跡、
“丁 丁”字型排列印跡、“丄丄”字型排列印跡、“ h P，字型排列印跡或“~1 H，，字型排列印跡。
[0012]所述保護(hù)層為覆蓋在吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上的保護(hù)膜，在吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向吸附纖維層一側(cè)0.3-0.7cm。[0013]所述PEG/NaCl 溶液中 PEG-8000 的濃度為 20% (w/v)，NaCl 的濃度為 2.5mol/L。
[0014]一種免疫層析試紙的制備方法，包括以下步驟:
(1)OTA單克隆抗體或多克隆抗體的制備；
(2)M13噬菌體的篩選；
(3)金標(biāo)抗體的制備:在沸騰的0.01~0.02% (w/v)氯金酸水溶液中加入1% (w/v)新配制的檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)后獲得直徑15~20nm的膠體金溶液，用0.lmol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值至8.5^9.5，置于2~8°C保存?zhèn)溆茫?br> 以1:2000的標(biāo)記比將待標(biāo)記的OTA單克隆抗體或多克隆抗體加入pH 8.5、.5的膠體金溶液中，標(biāo)記IOmin后加入20% (w/v)的PEG10000至終濃度為0.05%,于4°C、1500~3000rpm離 心20min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒,4°C、15000rpm離心lh,棄上清,獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析，經(jīng)分離純化后獲得膠體金標(biāo)記的OTA抗體；
(4)吸附纖維層的制備:吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；
(5)纖維素膜層的制備:纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜上不同位置分別噴點(diǎn)檢測印跡和對照印跡，然后烘干；
(6)試紙的組裝:將吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從左至右依次貼在涂有粘合劑的支撐層上，依次將支撐層、吸附層和保護(hù)層組裝成試紙。
[0015]所述M13噬菌體的篩選是按以下方法進(jìn)行的:
(1)親和篩選M13噬菌體隨機(jī)七肽庫
取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，每孔加入稀釋后的噬菌體肽庫100 μ L，其中含噬菌體IX IO11~2 X IO11Pfu,室溫下輕搖震蕩lh，棄去液體；沉淀用TBST溶液洗滌10次，洗去未結(jié)合的噬菌體后，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脫液Gly-HCl，室溫下輕搖震蕩8min，吸出洗脫液，加入中和緩沖液至中性；中和后的洗脫液除留一部分作滴度測定外，其余的洗脫液接種處于對數(shù)生長前期的E.coli ER2738的LB培養(yǎng)液中，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；于37°C震蕩培養(yǎng)4-5h，4°C、12000rpm離心10min，向上清液中加入占上清液1/6體積的PEG/NaCl溶液，4°C沉淀過夜；沉淀后，4°C、12000rpm離心15min，棄上清，再用TBST溶液懸浮噬菌體，加入占TBST溶液1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C離心15min，去上清，沉淀用TBST溶液懸浮；
測定滴度后，進(jìn)行第2次、第3次和第4次親和篩選；每次加入噬菌體的量為I X IO11~2 X 10npfu，包被的抗體量分別為75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量從第2次篩選起增至0.5%，其余步驟與第I輪篩選相同，第4次篩選后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)滴度測定后，從總量不到100個噬菌斑的平板上挑選若干藍(lán)色噬菌斑，分別接種處于對數(shù)生長期前期的疋coli ER2738的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，純化并測定滴度；
(2)鑒定噬菌體克隆
取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，加入要鑒定的噬菌體克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13的單克隆抗體，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加入2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；
然后采取競爭ELISA方法鑒定陽性噬菌體克隆的敏感性，加入不同濃度的OTA稀釋液和陽性噬菌體，于37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；計(jì)算各濃度下噬菌體的結(jié)合率，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷噬菌體克隆的敏感性；
(3)DNA測序及多肽序列分析
將擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行測序，根據(jù)插入的DNA序列翻譯出氨基酸序列，采用的-96 g III測序引物為Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模擬表位的氨基酸序列為MPLWXDL，X為任意氨基酸。
[0016]本發(fā)明的積極有益效果:
(I)本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了基于M13噬菌體的免疫層析技術(shù)在快速檢測OTA殘留中的應(yīng)用，該試紙最大特點(diǎn)在于其用展示有OTA模擬表位的M13噬菌體取代了傳統(tǒng)試紙檢測印記上印制的OTA偶聯(lián)物，避免了 OTA偶聯(lián)物對于試紙生產(chǎn)者、實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境的危害。
[0017]本發(fā)明中M13噬菌體的篩選以抗OTA的單克隆抗體為配基，從噬菌體隨機(jī)七肽庫中親和篩選OTA的模擬表位，并利用展示有OTA模擬表位的M13噬菌體替代人工合成抗原。
[0018](2)特異性強(qiáng)，靈敏度高。本發(fā)明試紙以膠體金標(biāo)記高親和力的單克隆抗體或多克隆抗體為基礎(chǔ)制備而成，金標(biāo)抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結(jié)合，膠體金標(biāo)記對抗體的特異性及親和力影響很小，且具有較高的標(biāo)記率。因此，該試紙具有較強(qiáng)的特異性和較高的靈敏度，可檢測到5ng/ml的微量赭曲霉毒素A0
[0019](3)安全性好。該試紙中展示有OTA模擬表位的M13噬菌體具有無毒無害的特點(diǎn)，使得基于M13噬菌體組裝的試紙對于試紙生產(chǎn)者、檢測者和環(huán)境均無任何危害，安全。
[0020](4)簡便、快速。使用本發(fā)明試紙，無需其他任何試劑和儀器，可現(xiàn)場操作。只需將試紙插入被檢樣品中10-20秒，取出后5分鐘內(nèi)即可判定檢測結(jié)果。
[0021](5)結(jié)果顯示形象、直觀、準(zhǔn)確。本發(fā)明試紙以顯示紅色“ I ”和“ I I ”(或“十”、“丁”、“_L”、“”)印跡作為檢測的陽性和陰性標(biāo)記，即在纖維素膜上顯示一條紅色“ I ”印跡，表示被檢樣品中含有0ΤΑ;顯示兩條紅色“ I I ”印跡，表示被檢樣品中不含0ΤΑ。此結(jié)果可用肉眼直接觀測，判定形象、直觀、準(zhǔn)確，簡單明了，不易出現(xiàn)假陽性和假陰性等人為誤判。
[0022](6)節(jié)省費(fèi)用。使用該試紙無需另配儀器和其他試劑，可隨時隨地進(jìn)行檢測，費(fèi)用低廉，能節(jié)省大量貴重儀器及設(shè)備費(fèi)用。
[0023](7)適用范圍廣，便于推廣應(yīng)用。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了基于M13噬菌體的免疫層析技術(shù)在快速檢測OTA中的應(yīng)用，使OTA的檢測無本底干擾；操作簡便，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗(yàn)、海關(guān)檢疫、衛(wèi)生檢疫、質(zhì)量監(jiān)測、畜產(chǎn)品加工、養(yǎng)殖戶以及消費(fèi)者個人等。本發(fā)明在保障食品安全、保護(hù)消費(fèi)者健康方面具有極其重要的意義，將具有明顯的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。
【專利附圖】

【附圖說明】[0024]圖1為本發(fā)明的免疫層析試紙的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0025]圖2為圖1中免疫層析試紙的俯視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0026]圖中，I為支撐層，2為吸附纖維層，3為金標(biāo)抗體纖維層，4為纖維素膜層，5為吸水材料層，6為隱形檢測印記，7為隱形對照印記，8-1為測試端保護(hù)膜，8-2為手柄端保護(hù)膜，9為樣品標(biāo)記線。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明試紙的制備過程包括:0ΤΑ單克隆或多克隆抗體的制備、展示有OTA模擬表位的M13曬菌體的篩選、金標(biāo)抗體纖 維層的制備、吸附纖維層的制備、纖維素膜層的制備和試紙的組裝等步驟。
[0028]1、OTA單克隆抗體或多克隆抗體的制備
單克隆抗體的制備:包括OTA人工抗原的制備、免疫動物(小鼠)、細(xì)胞融合、單克隆抗體的篩選、單克隆抗體的制備；多克隆抗體的制備:包括OTA人工抗原的制備、免疫動物(白兔)、多克隆抗體的篩選和多克隆抗體的制備。
[0029]( I) OTA人工抗原的制備
取Img OTA溶解于乙醇中，加入3mg DCC和2mg NHS，4°C避光攪拌反應(yīng)12h，1000Orpm離心15min，棄沉淀，干燥上清液，將干燥產(chǎn)物溶解于二甲基亞砜中，得到活化產(chǎn)物；稱取IOmg BSA,充分溶解于0.13mol/L的NaHCO3溶液中，于4°C預(yù)冷；將活化產(chǎn)物逐滴緩慢加入預(yù)冷到4°C的BSA溶液中，4°C避光劇烈震蕩4h，產(chǎn)物在PBS中透析72h，5000rpm離心10min，取上清為免疫抗原OTA-BSA，分裝，_20°C保存?zhèn)溆谩Ｍㄖ苽浒辉?br> [0030](2) OTA單克隆抗體的制備
用制得的OTA人工抗原以5(^g /只的用量免疫6~8周齡BALB/c小鼠3~4次，每次免疫間隔3~4周，確定抗體效價符合要求后超強(qiáng)免疫，之后3~4天將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽性血清；脫頸致死，用75%的酒精浸泡小鼠5~IOmin消毒體表，無菌取其脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經(jīng)120目尼龍紗布過濾，1000rpm離心10min，收集脾細(xì)胞。將IX IO8的脾細(xì)胞與NSO骨髓瘤細(xì)胞按10:1的比例混合，1000rpm離心10min，棄上清，細(xì)胞沉淀物于37°C水浴中，緩緩加入0.7~1.0mL 50%的PEG4000作用lmin，然后緩緩加入無血清1640培養(yǎng)基15mL，以終止PEG的作用；37°C水浴5~10 min，1000rpm離心10min，棄上清，將細(xì)胞沉淀物重懸于HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板孔(100μL~200μL7孔)，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~14天，用間接ELISA法進(jìn)行陽性孔篩選，選擇強(qiáng)陽性、抑制率高、細(xì)胞生長旺盛的孔進(jìn)行3次有限稀釋克隆化，而后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞株。所制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體可特異地與OTA反應(yīng)，親和力常數(shù)達(dá)到101°~1012，亞型為IgG1,用于制備金標(biāo)抗體玻璃纖維棉。
[0031](3) OTA多克隆抗體的制備
用制得的OTA人工抗原免疫新西蘭白兔，免疫劑量為200μ8~500μ8/次，背部皮下分
4~6點(diǎn)注射。免疫4~5次，每次免疫間隔2~3周，最后一次免疫后10~15天以ELISA法測定效價，并鑒定其敏感性和特異性，采血并分離收集血清。以飽和硫酸銨鹽析法提取IgG抗體，即取1份血清加2份PBS (ρΗ7.2)混勻，加等體積飽和硫酸銨溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清，再以適量PBS (pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度為33%，置4°C冰箱2h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清，以適量PBS (pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)用PBS (pH7.2)透析48~72h，中間換液數(shù)次，4°C、12000rpm離心15min,收集上清，得純化的抗OTA多克隆抗體，_20°C凍存，用于制備金標(biāo)抗體玻璃纖維棉。
[0032]2、展示有OTA模擬表位的M13噬菌體的篩選
(1)親和篩選M13噬菌體隨機(jī)七肽庫
取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，每孔加入稀釋后的噬菌體肽庫100 μ L，其中約含噬菌體IX IO11~2 X IO11Pfu,室溫下輕搖震蕩lh，棄去液體；沉淀用TBST溶液洗滌10次，洗去未結(jié)合的噬菌體后，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脫液Gly-HCl，室溫下輕搖震蕩8min，吸出洗脫液，加入中和緩沖液至中性；中和后的洗脫液除留一部分作滴度測定外，其余的洗脫液接種處于對數(shù)生長前期的E.coli ER2738的LB培養(yǎng)液中，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；于37°C震蕩培養(yǎng)4-5h，4°C、12000rpm離心10min，向上清液中加入占上清液1/6體積的PEG/NaCl溶液，4°C沉淀過夜；沉淀后，4°C、12000rpm離心15min，棄上清，再用TBST溶液懸浮噬菌體，加入占TBST溶液1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C離心15min，去上清，沉淀用TBST溶液懸浮；
測定滴度后，進(jìn)行第2次、第3次和第4次親和篩選；每次加入噬菌體的量為
1X IO11~2 X 10npfu，包被的抗體量分別為75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量從第2次篩選起增至0.5%，其余步驟與第I輪篩選相同，第4次篩選后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)滴度測定后，從總量不到100個噬菌斑的平板上挑選若干藍(lán)色噬菌斑，分別接種處于對數(shù)生長期前期的疋coli ER2738的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，純化并測定滴度；
(2)鑒定噬菌體克隆
取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，加入要鑒定的噬菌體克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13的單克隆抗體，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加入2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；
然后采取競爭ELISA方法鑒定陽性噬菌體克隆的敏感性，加入不同濃度的OTA稀釋液和陽性噬菌體，于37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；計(jì)算各濃度下噬菌體的結(jié)合率，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷噬菌體克隆的敏感性；
(3)DNA測序及多肽序列分析
將擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行測序，根據(jù)插入的DNA序列翻譯出氨基酸序列，采用的-96 g III測序引物為Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模擬表位的氨基酸序列為MPLWXDL，X為任意氨基酸。
[0033]3、金標(biāo)抗體纖維層的制備
采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金溶液。即在沸騰的0.01-0.02%(w/v)氯金酸水溶液中加入l%(w/v)新配制的檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)后獲得直徑15~20nm的膠體金溶液，用0.1mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值至8.5^9.5，置于2~8°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034]以1:2000的標(biāo)記比將待標(biāo)記的OTA單克隆抗體或多克隆抗體加入pH 8.5^9.5的膠體金溶液中，標(biāo)記IOmin后，加入20% (w/v)的PEG10000至終濃度為0.05%，4°C、1500~3000rpm離心20min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒,4°C、15000rpm離心lh,棄上清,獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分離純化后獲得膠體金標(biāo)記的OTA抗體。將l:10(Tl:500稀釋的膠體金標(biāo)記抗體吸附于精制玻璃纖維綿中，4°C低溫真空干燥，制備金標(biāo)抗體玻璃纖維棉。
[0035]4、吸附纖維層的制備
測試端吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯PVDF膜或聚酯膜制備，將纖維材料剪成寬1.5cm規(guī)格的條帶，將其放入樣品墊封閉液中浸泡30min，于37°C烘干，備用。
5、纖維素膜層的制備
纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成，剪切成寬1.5cm規(guī)格的條帶，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜上不同位置分別噴點(diǎn)展示有OTA模擬表位的M13噬菌體和羊抗小鼠IgG抗體(或兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG抗體)，制作隱形的檢測印跡帶和對照印跡帶，于37 °C烘干備用。
[0036]其中羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體的制備方法如下:
以飽和硫酸銨提取OTA陰性小鼠血清IgG (或陰性兔血清IgG)，取1份小鼠血清(或兔血清)，加2份PBS (pH7.2)混勻，加等體積的飽和硫酸銨溶液混勻，置4°C冰箱12h，4°C、2500rpm離心15min，棄上清；再以適量PBS (pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨溶液至終濃度為33%，置41:冰箱211，41:、2500印111離心15min，棄上清；以適量PBS(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱內(nèi)，用PBS (ρΗ7.2)透析48h，中間換液3次，4°C、12000rpm離心15min，收集上清，以紫外分光光度計(jì)測定其蛋白濃度；以5(^g~lOOPg/kg體重的小鼠血清(或兔血清)IgG經(jīng)皮下和肌肉注射健康山羊或家兔3~4次，末次注射10天后，以ELISA測定其血清效價達(dá)到1:2000以上時，心臟或動脈采血，分離收集高免血清，以飽和硫酸銨提取羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于OTA檢測試紙對照印跡的制備。
[0037]6、免疫層析試紙的組裝
將吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從左至右依次貼在帶有粘合劑的支撐層上，并切成3-4cm寬的試紙。
[0038]7、免疫層析試紙的檢測反應(yīng)原理
當(dāng)試紙測試端插入待測樣品溶液后，待測溶液通過虹吸作用帶動待測OTA及金標(biāo)抗體纖維層中的金標(biāo)抗體一起向纖維素膜層擴(kuò)散，并最終滲入手柄端的吸水材料層。在擴(kuò)散過程中，待測OTA可與金標(biāo)抗體相結(jié)合，進(jìn)而封閉金標(biāo)抗體上OTA的抗原結(jié)合點(diǎn)，阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上展示有OTA模擬表位的M13噬菌體的檢測印跡結(jié)合，不能顯示檢測印跡，而羊或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體則可與金標(biāo)抗體結(jié)合，形成紅色對照印跡帶“ I ”，即一條紅色帶印跡為陽性表示；反之樣品溶液中無OTA時，則不能阻止金標(biāo)抗體與纖維素膜上的展示有OTA模擬表位的M13噬菌體的檢測印跡結(jié)合，顯示紅色檢測印跡帶，同樣羊抗或兔抗小鼠IgG (或羊抗兔IgG)抗體也與金標(biāo)抗體結(jié)合，顯示紅色對照印跡帶“ I ”，形成兩條紅色帶“ I I”為陰性表示。如果纖維素膜上沒有任何紅色印跡帶顯示，則表明試紙已失效。
[0039]以下通過實(shí)施例具體說明本發(fā)明試紙的結(jié)構(gòu)。[0040]實(shí)施例一:基于M13噬菌體快速檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙，參見圖1、圖
2。圖中I為支撐層，用塑膠薄片條制成，2為吸附纖維層，用玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體纖維層3上吸附有抗OTA單克隆抗體的金標(biāo)抗體玻璃纖維棉，纖維素膜層4采用硝酸纖維素膜，手柄端的吸水材料層5用吸水濾紙制成，將吸附纖維層2、金標(biāo)抗體纖維層3、纖維素膜層4、吸水材料層5各層從左至右依次粘貼固定在支撐層I上，彼此之間交界處纖維互相交叉滲透。在纖維素膜層4上設(shè)有隱形檢測印跡6，隱形檢測印跡用展示有OTA模擬表位的M13噬菌體制成；隱形對照印跡7用羊抗小鼠IgG抗體溶液在纖維素膜上印跡制成，兩條印跡帶平行排列，形成組合印跡帶“ I I”。
[0041]8-1為覆蓋在吸附纖維層2和金標(biāo)抗體纖維層3上面的樣品端保護(hù)膜(白色)，8_2為手柄端保護(hù)膜，覆蓋在吸水材料層5上面，為其它顏色(如黃色)，9為樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線位于吸附纖維層2與金標(biāo)抗體纖維層3交界處對應(yīng)的白色保護(hù)膜偏向吸附纖維層2 —側(cè)約0.5cm處,在標(biāo)記線右側(cè)保護(hù)膜上印有箭頭及Max字樣。
[0042]待測樣品的制備及檢測步驟:
檢測玉米:將樣品碾碎、磨細(xì)，稱取5g樣品，用12.5ml 70%的甲醇-PBS溶液溶解，劇烈震蕩5分鐘，將提取液用whatman I號濾紙進(jìn)行過濾后，取Iml濾液加入Iml PBS中，待用。
[0043]操作方法:將OTA試紙樣品端插入待測樣品中，插入深度不超過標(biāo)記線，約10?20秒取出試紙，水平放置，5min內(nèi)觀察判定檢測結(jié)果。
[0044]結(jié)果判定:(a)陽性如果在纖維素膜上顯示有一條紅色印跡帶“ I ”，表示檢測結(jié)果為陽性，說明在待測樣品中含有OTA; (b)陰性如果在纖維素膜上顯示有兩條紅色印跡帶“ I I ”，表示檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中不含OTA; (C)失效如果在纖維素膜上沒有紅色帶顯示，則表明試紙已失效。
[0045]實(shí)施例二:試紙結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于:金標(biāo)抗體纖維層3吸附有抗OTA的多克隆抗體，吸附纖維層2用尼龍膜制成，纖維素膜層4采用純纖維素膜，隱形檢測印跡帶和隱形對照印跡帶均為“十”，手柄端保護(hù)膜8-2為蘭色。
檢測面粉:樣品制備方法同實(shí)施例一。
[0046]結(jié)果判定:(a)陽性如果在纖維素膜上顯示有一條紅色印跡帶“十”，表示檢測結(jié)果為陽性，說明在待測樣品中含有OTA; (b)陰性如果在纖維素膜上顯示有兩條紅色印跡帶“十”，表示檢測結(jié)果為陰性，說明在待測樣品中不含OTA; (c)失效如果在纖維素膜上沒有紅色帶顯示，則表明試紙已失效。操作方法同實(shí)施例一。
[0047]實(shí)施例三:試紙結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于:吸附纖維層2用聚偏二氟乙烯PVDF膜制成，隱形對照印跡7用兔抗小鼠IgG抗體溶液在纖維素膜上制成，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，手柄端保護(hù)膜8-2為綠色，隱形檢測印跡帶和隱形對照印跡帶均為“丁'
[0048]檢測飼料:樣品制備方法、結(jié)果判定和操作方法均同實(shí)施例一。
[0049]實(shí)施例四:試紙結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于:吸附纖維層2用聚酯膜制成，纖維素膜層4采用羧化纖維素膜，檢測印跡帶和對照印跡帶均為“I”。操作方法和結(jié)果判定方法同例一。
[0050]實(shí)施例五:試紙結(jié)構(gòu)和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于:吸附纖維層2用尼龍膜制成，隱形對照印跡7用羊抗兔IgG抗體溶液在纖維素膜上制成。檢測印跡帶和對照印跡帶均為“ P’。檢測樣品、結(jié)果判定和操作方法同例一。
[0051]實(shí)施例六:和實(shí)施例一基本相同，不同之處在于:金標(biāo)抗體纖維層3吸附有抗OTA的多克隆抗體，檢測印跡帶和對照印跡帶均為”。
【權(quán)利要求】
1.一種基于M13噬菌體檢測赭曲霉毒素A的免疫層析試紙，包括底層的支撐層、中間層的吸附層和固定在吸附層上的保護(hù)層，吸附層從測試端依次為吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其特征在于:在纖維素膜層上設(shè)有用展示OTA模擬表位的M13噬菌體印制的隱形檢測印跡，還設(shè)有用羊抗或兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗體溶液印制的隱形對照印跡；所述金標(biāo)抗體纖維層采用吸附金標(biāo)抗體的玻璃纖維棉制成，金標(biāo)抗體采用膠體金納米顆粒標(biāo)記的OTA的單克隆抗體或多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙，其特征在于:所述OTA模擬表位的多肽序列為MPLWXDL，X為任意氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫層析試紙，其特征在于:所述M13噬菌體由以下方法篩選，具體步驟為: (1)親和篩選M13噬菌體隨機(jī)七肽庫 取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，每孔加入稀釋后的噬菌體肽庫100 μ L，其中含噬菌體1X 1O11~2 X IO11Pfu,室溫下輕搖震蕩lh，棄去液體；沉淀用TBST溶液洗滌10次，洗去未結(jié)合的噬菌體后 ，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脫液Gly-HCl，室溫下輕搖震蕩8min，吸出洗脫液，加入中和緩沖液至中性；中和后的洗脫液除留一部分作滴度測定外，其余的洗脫液接種處于對數(shù)生長前期的E.coli ER2738的LB培養(yǎng)液中，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；于37°C震蕩培養(yǎng)4-5h，4°C、12000rpm離心10min，向上清液中加入占上清液1/6體積的PEG/NaCl溶液，.4°C沉淀過夜；沉淀后，4°C、12000rpm離心15min，棄上清，再用TBST溶液懸浮噬菌體，加入占TBST溶液1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C離心15min，去上清，沉淀用TBST溶液懸浮； 測定滴度后，進(jìn)行第2次、第3次和第4次親和篩選；每次加入噬菌體的量為.1 X 1O11~2 X 10npfu，包被的抗體量分別為75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量從第2次篩選起增至0.5%，其余步驟與第I輪篩選相同，第4次篩選后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)滴度測定后，從總量不到100個噬菌斑的平板上挑選若干藍(lán)色噬菌斑，分別接種處于對數(shù)生長期前期的疋coli ER2738的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，純化并測定滴度； (2)鑒定噬菌體克隆 取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，加入要鑒定的噬菌體克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13的單克隆抗體，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加入2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度.OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性； 然后采取競爭ELISA方法鑒定陽性噬菌體克隆的敏感性，加入不同濃度的OTA稀釋液和陽性噬菌體，于37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；計(jì)算各濃度下噬菌體的結(jié)合率，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷噬菌體克隆的敏感性； (3)DNA測序及多肽序列分析 將擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行測序，根據(jù)插入的DNA序列翻譯出氨基酸序列，采用的-.96 g III測序引物為Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模擬表位的氨基酸序列為MPLWXDL, X為任意氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙，其特征是:所述吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料層用吸水濾紙制成，支撐層用不吸水的韌性材料制成；纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙，其特征是:所述隱形檢測印跡和隱形對照印跡為平行排列的“ I I ”直線式印跡、“十十”字型排列印跡、 “丁丁”字型排列印跡、“丄I”字型排列印跡、“ h P’字型排列印跡或“~1 H ”字型排列印跡。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙，其特征是:所述保護(hù)層為覆蓋在吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層及吸水材料層上的保護(hù)膜，在吸附纖維層與金標(biāo)抗體纖維層交界處對應(yīng)的保護(hù)膜上印制有樣品標(biāo)記線，該標(biāo)記線偏向吸附纖維層一側(cè)0.3-0.7cm。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的免疫層析試紙，其特征是:所述PEG/NaCl溶液中PEG-8000的濃度為20%(w/v)，NaCl的濃度為2.5mol/L。
8.—種權(quán)利要求1所述免疫層析試紙的制備方法，其特征是:該方法包括以下步驟: (1)OTA單克隆抗體或多克隆抗體的制備； (2)M13噬菌體的篩選； (3)金標(biāo)抗體的制備:在沸騰的0.01~0.02% (w/v)氯金酸水溶液中加入1% (w/v)新配制的檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)后獲得直徑15~20nm的膠體金溶液，用0.lmol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH值至8.5^9.5，置于2~8°C保存?zhèn)溆茫? 以1:2000的標(biāo)記比將待標(biāo)記的OTA單克隆抗體或多克隆抗體加入pH 8.5、.5的膠體金溶液中，標(biāo)記IOmin后加入20% (w/v)的PEG10000至終濃度為0.05%,于4°C、1500~3000rpm離心20min,除去未結(jié)合的膠體金顆粒,4°C、15000rpm離心lh,棄上清,獲得初步純化的金標(biāo)抗體蛋白混合物，再用丙烯葡聚糖S-400柱層析，經(jīng)分離純化后獲得膠體金標(biāo)記的OTA抗體； (4)吸附纖維層的制備:吸附纖維層用玻璃纖維棉、尼龍膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成； (5)纖維素膜層的制備:纖維素膜層用硝酸纖維素膜、純纖維素膜或羧化纖維素膜制成，用點(diǎn)樣儀在纖維素膜上不同位置分別噴點(diǎn)檢測印跡和對照印跡，然后烘干； (6)試紙的組裝:將吸附纖維層、金標(biāo)抗體纖維層、纖維素膜層、吸水材料層從左至右依次貼在涂有粘合劑的支撐層上，依次將支撐層、吸附層和保護(hù)層組裝成試紙。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征是:所述M13噬菌體的篩選是按以下方法進(jìn)行的: (I)親和篩選M13噬菌體隨機(jī)七肽庫 取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，每孔加入稀釋后的噬菌體肽庫100 μ L，其中含噬菌體IX IO11~2 X IO11Pfu,室溫下輕搖震蕩lh，棄去液體；沉淀用TBST溶液洗滌10次，洗去未結(jié)合的噬菌體后，每孔加入100 μ L ρΗ2.2的洗脫液Gly-HCl，室溫下輕搖震蕩8min，吸出洗脫液，加入中和緩沖液至中性；中和后的洗脫液除留一部分作滴度測定外，其余的洗脫液接種處于對數(shù)生長前期的E.coli ER2738的LB培養(yǎng)液中，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；于37°C震蕩培養(yǎng)4-5h，4°C、12000rpm離心10min，向上清液中加入占上清液1/6體積的PEG/NaCl溶液，.4°C沉淀過夜；沉淀后，4°C、12000rpm離心15min，棄上清，再用TBST溶液懸浮噬菌體，加入占TBST溶液1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育60min ;再4°C離心15min，去上清，沉淀用TBST溶液懸浮； 測定滴度后，進(jìn)行第2次、第3次和第4次親和篩選；每次加入噬菌體的量為I X IO11~2 X 10npfu，包被的抗體量分別為75,50和25 μ g/ml ;TBST溶液中Tween-20的含量從第2次篩選起增至0.5%，其余步驟與第I輪篩選相同，第4次篩選后的洗脫產(chǎn)物經(jīng)滴度測定后，從總量不到100個噬菌斑的平板上挑選若干藍(lán)色噬菌斑，分別接種處于對數(shù)生長期前期的疋coli ER2738的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，純化并測定滴度； (2)鑒定噬菌體克隆 取包被有OTA單克隆抗體的ELISA板，加入要鑒定的噬菌體克隆，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13的單克隆抗體，37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加入2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度.OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性； 然后采取競爭ELISA方法鑒定陽性噬菌體克隆的敏感性，加入不同濃度的OTA稀釋液和陽性噬菌體，于37°C作用lh，用PBST溶液洗滌6次；加TMB顯色液，加2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)，測定在450nm波長下的吸光度OD值，不加噬菌體克隆的孔作空白對照，以待測孔的吸光度OD值>空白對照中OD值的2.1倍，判斷為陽性；計(jì)算各濃度下噬菌體的結(jié)合率，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線判斷噬菌體克隆的敏感性； (3)DNA測序及多肽序列分析 將擴(kuò)增后的噬菌體進(jìn)行測序，根據(jù)插入的DNA序列翻譯出氨基酸序列，采用的-.96 g III測序引物為Y - hoCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3、模擬表位的氨基酸序列為MPLWXDL，X為任意氨基酸。
【文檔編號】G01N33/68GK103969444SQ201410174931
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月29日
【發(fā)明者】胡驍飛, 張改平, 邢廣旭, 王耀, 王方雨, 趙東, 鄧瑞廣 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院