一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統及其成像方法
【專利摘要】一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統及其成像方法，本發明涉及飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統及其成像方法。本發明的目的是為了解決目前雙光子熒光顯微鏡成本昂貴、成像速度無法滿足需求。外界環境的影響容易導致飛秒激光器失鎖，而激光器失鎖后無法激勵樣品產生雙光子熒光信號。雙光子熒光顯微成像是對樣品特定成分進行成像，不能對樣品進行完整成像。一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統，其特征在于：所述系統包括：可調諧飛秒激光源Tsunami(1)、生物顯微鏡(2)、光譜儀(3)、光電倍增管(4)、光電二極管(5)、數據采集卡(6)、電動平移臺(7)、電動平移臺控制器(8)、計算機(9)和分束片(10)；所述生物顯微鏡(2)包括反射鏡M1(11)、反射鏡M2(12)、二向色鏡(13)、發射濾波片(14)、物鏡(15)和聚光器(16)。本發明應用于熒光顯微成像領域。
【專利說明】一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統及其成像方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統及其成像方法。
【背景技術】
[0002]熒光是某些物質受一定波長的光激發后在極短時間內發射出波長大于激發波長的一種發光現象。十九世紀中期，英國科學家G.Stokes利用紫外光照射螢石礦物第一次觀察到了熒光現象，但是直到二十世紀三十年代，奧地利科學家M.Haitinger等人才將熒光標記技術引入到生命科學領域，他們使用熒光染料對細菌病毒等特定成分進行標記，推動了熒光顯微鏡的發展。
[0003]熒光顯微鏡的基本工作原理就是利用光照射有熒光物質標記的樣品，產生的熒光信號通過濾波片與激勵信號分開后被探測器采集，染料標記區域就會被分辨出來。由于普通熒光顯微鏡使用的汞燈光源發射的主要是短波長的紫外光，使得成像的分辨率大大提高。但是當我們觀察較厚樣品時，樣品的不同層次深度上均有被標記的結構，而且相互堆疊起來，普通熒光顯微鏡的光源會同時激發樣品在焦點附近的較大一片區域，導致焦點上下的散射光也會被收集，降低了分辨率。除此之外，熒光顯微鏡受到衍射極限的限制，其分辨率很難達到Ium以下。
[0004]20世紀80年代后期,作為目前世界上非常先進的生物學熒光成像技術,共聚焦熒光顯微成像技術在生物材料的熒光顯微成像領域得到了廣泛應用。相比于傳統的熒光顯微鏡，它的技術有以下改進:首先，采用方向性和單色性良好的激光作為光源消除了色差的影響；其次，共聚焦技術中小孔的存在擋住了焦點以外的雜散光，提高了信噪比；最后，逐點逐行掃描只會激發焦平面內極小區域的熒光，避免了標本上相鄰點的衍射光和散射光的干擾，大大提高了圖像的清晰度和精密度。
[0005]共聚焦熒光顯微成像技術如圖1所示，裝置包括激光光源(I)、樣品(2)、探測器
(3)、物鏡(4)、焦點(5)、二向色鏡(6)和共焦小孔(7)，以光學系統的共焦成像為基礎，激光光源(I)、樣品(2)和探測器(3)處于彼此共軛的位置。光源經物鏡(4)在樣品(2)內聚焦成衍射極限的光點，樣品發射的熒光被物鏡(4)匯聚到達共焦小孔(7)內，被靠近共焦小孔(7)的探測器(3)接收。激光通過對樣品進行的掃描而對物體進行成像。然而共焦小孔(5)不僅擋住了焦點(5)以外產生的熒光，還擋住了焦點(5)產生的被生物組織散射的熒光，導致熒光的收集效率下降。
[0006]雙光子熒光顯微成像技術如圖2所示，裝置包括激光光源(I)、樣品(2)、探測器
(3)、物鏡(4)、焦點(5)和二向色鏡￠)，與共聚焦熒光顯微成像技術不同的是，雙光子熒光顯微成像技術利用近紅外的飛秒激光作為光源而非利用紫外光源。而且雙光子吸收的非線性本質使得雙光子熒光顯微成像技術無需共焦小孔的加入，與傳統的單光子激光共聚焦顯微鏡相比，雙光子熒光顯微成像技術具有以下幾個優點:①熒光收集率高:雙光子顯微成像無需共焦小孔的加入，因此熒光收集效率大大提高；②光損傷小:雙光子熒光顯微鏡的激勵源使用可見光或者近紅外光，它們對生物活體組織的光損傷小，因此可以對樣品進行長時間的科學研究；③空間分辨率和對比度高:由于在雙光子顯微成像中，熒光只有在焦平面很小的區域內產生，焦點外無熒光產生，背景熒光影響小光漂白區很小:焦點外不發生漂白現象。⑤成像深度大:可見光或近紅外光比紫外光的穿透性強，一般情況下，共聚焦熒光顯微成像技術的成像深度只能達到50 μ m左右，而雙光子顯微成像技術的成像深度可達1600 μ m 對探測光路的要求低:對于雙光子顯微成像而言，發射突光的波長值與激發光相差很大，因此對探測收集系統的要求比單光子共焦顯微鏡低；⑦適合多標記復合成像:由于很多染料熒光探針的雙光子激發光譜比較寬，多種探針可以同時被單一波長的激發光激發，進而得到同一樣品的不同信息。
[0007]雖然商業化的雙光子熒光顯微鏡已經問世，但是其成本昂貴、成像速度無法滿足需求。外界環境的影響很容易導致飛秒激光器失鎖，而激光器失鎖后無法激勵樣品產生雙光子熒光信號。雙光子熒光顯微成像是對樣品特定成分進行成像，不能對樣品進行完整成像。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是為了解決目前雙光子熒光顯微鏡成本昂貴、成像速度無法滿足需求。外界環境的影響容易導致飛秒激光器失鎖，而激光器失鎖后無法激勵樣品產生雙光子熒光信號。雙光子熒光顯微成像是對樣品特定成分進行成像，不能對樣品進行完整成像。而提出了一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統及其成像方法。
[0009]上述的發明目的是通過以下技術方案實現的:
[0010]一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統，其特征在于:所述系統包括:可調諧飛秒激光源Tsunami (I)、生物顯微鏡(2)、光譜儀(3)、光電倍增管(4)、光電二極管(5)、數據采集卡￠)、電動平移臺(7)、電動平移臺控制器(8)、計算機(9)和分束片(10);所述生物顯微鏡⑵包括反射鏡Ml (11)、反射鏡M2(12)、二向色鏡(13)、發射濾波片(14)、物鏡
(15)和聚光器(16)；
[0011]所述可調諧飛秒激光源Tsunami (I)產生的激光經過分束片(10)對激光進行分束，分別進入生物顯微鏡(2)和光譜儀(3)，光譜儀(3)用于監控可調諧飛秒激光源Tsunami (I)的工作狀態，激光進入生物顯微鏡(2)經反射鏡Ml (11)反射進入二向色鏡
(13)，通過物鏡(15)打到電動平移臺(7)上的樣品，然后一部分激光穿過樣品，經聚光器
(16)聚焦，反射鏡M2(12)反射，進入光電二極管(5)采集透射信號，把透射信號轉換為電信號；另一部分激光返回物鏡(15)，通過二向色鏡(13)，經發射慮波片(14)濾除雜波，進入光電倍增管(4)采集熒光信號，把熒光信號轉換為電信號；光電倍增管(4)和光電二極管(5)的數據傳入數據采集卡￠)，數據采集卡￠)的數據傳入計算機(9)，計算機(9)通過電動平移臺控制器⑶控制電動平移臺(7)移動，電動平移臺(7)位于聚光器(16)和物鏡(15)間，由兩個表面平坦且相互正交垂直的X軸平移臺和Y軸平移臺組成；計算機控制電動平移臺以完成成像。
[0012]一種權利要求1所述飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統的成像方法，其特征在于:一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統的成像方法包括如下步驟:
[0013]步驟一、將可調諧飛秒激光源Tsunami發出的激光進行分束:一束激光通過多模光纖與光譜儀連接，從而監控可調諧飛秒激光源Tsunami的工作狀態；另一束激光與生物顯微鏡連接，用來激勵樣品；
[0014]步驟二、光束經過生物顯微鏡的物鏡后，光束分為前向透射光和后向出射光；
[0015]步驟三、前向透射光經過聚光器的收集后進入光電二極管，光電二極管輸出的信號由數據采集卡進行采集；
[0016]步驟四、后向出射光被物鏡收集后，通過二向色鏡將激光與熒光分開，經發射濾波片后，進入光電倍增管進行探測采集熒光，光電倍增管輸出的信號由數據采集卡進行采集;
[0017]步驟五、將數據采集卡采集的信息傳輸到計算機進行雙光子熒光顯微成像；
[0018]步驟六、計算機控制電動平移臺以完成成像。
[0019]發明效果
[0020]采用本發明的雙光子熒光顯微成像系統的成像方法，可以充分利用已有的儀器設備，而且許多實驗器材均為自行組裝制作而成，而非購買昂貴的商業化產品，因此自行搭建的雙光子熒光顯微成像系統的成本相對低廉，而且還可以根據自己需求搭建系統。例如，力口入多個二向色鏡實現了多通道復合成像，還可以通過選擇不同的掃描振鏡獲得不同的成像速度。
[0021]一般情況下，我們很容易通過輸出光譜的信息判斷激光器的工作狀態。圖4為激光器在鎖模和失鎖狀態下的輸出脈沖的光譜信息，從中可以看出，失鎖時輸出為一個尖峰信號，與鎖模狀態下的光譜形狀相差較大。因此在實驗過程中利用光譜儀監測激光器的輸出光譜信息就可以判斷激光器的鎖模狀態。
[0022]同時，本發明采用透射成像的原理進行顯微成像，透射顯微成像就是利用樣品的不同位置對通過物鏡的光的透過率不同而進行的顯微成像。通常入射光被聚焦到樣品上從而使得入射光強最大，然后光通過物鏡并被目鏡收集，眼睛透過目鏡便可以看到樣品被放大的透射像。透射成像可以對樣品進行完整成像，因此，透射顯微成像不僅可以檢驗雙光子熒光顯微成像的正確性，還對雙光子熒光顯微成像信息進行了補充。
[0023]在進行雙光子熒光顯微成像時，實驗采用UPLSAP040X2萬能平場復消色差物鏡，其放大倍數為X 40，數值孔徑為0.95，濾波片為帶通濾波片BP580-70k和紅外截止濾波片，將掃描間隔設置為ΙΟμπι，掃描范圍為lXlmm2，得到像素為100X100圖像，如圖5，激光進入顯微鏡前功率為45mW，從圖中可以明顯看出Rhodamine B染料的痕跡。
[0024]對于透射顯微成像技術，由于光電二極管的增益較大，而數據采集卡的輸入范圍是+-5v，激光進入顯微鏡前功率為40 μ W，其它參數與雙光子熒光顯微成像設置一致，成像大小lXlmm2，像素為100X 100，如圖6雙光子熒光顯微成像和透射成像位置相對應，證明了本發明搭建的雙光子熒光顯微成像系統的正確性；如圖7和圖8所示，雙光子熒光顯微成像和透射成像位置相對應，證明了本發明搭建的雙光子熒光生物顯微成像系統的正確性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1是共聚焦顯微成像技術原理圖；
[0026]圖2是雙光子突光顯微成像技術原理圖；
[0027]圖3是本發明成像系統裝置示意圖；
[0028]圖4是可調諧飛秒激光源Tsunami在失鎖和鎖模狀態下的輸出光譜，失鎖狀態用細線表示，鎖模狀態用粗線表示；
[0029]圖5是本發明實施例一 Rhodamine B樣品的雙光子突光顯微成像；
[0030]圖6是本發明實施例一 Rhodamine B樣品的透射成像；
[0031]圖7是本發明實施例二雙光子熒光顯微成像；
[0032]圖8是本發明實施例二透射成像。
【具體實施方式】
[0033]【具體實施方式】一:結合圖3說明本實施方式,一種飛秒激光雙光子突光生物顯微成像系統，其特征在于:所述系統包括:可調諧飛秒激光源Tsunami (I)、生物顯微鏡(2)、光譜儀(3)、光電倍增管(4)、光電二極管(5)、數據采集卡￠)、電動平移臺(7)、電動平移臺控制器(8)、計算機(9)和分束片(10);所述生物顯微鏡(2)包括反射鏡Ml (11)、反射鏡M2 (12)、二向色鏡(13)、發射濾波片(14)、物鏡(15)和聚光器(16)；
[0034]所述可調諧飛秒激光源Tsunami (I)產生的激光經過分束片(10)對激光進行分束，分別進入生物顯微鏡(2)和光譜儀(3)，光譜儀(3)用于監控可調諧飛秒激光源Tsunami (I)的工作狀態，激光進入生物顯微鏡(2)經反射鏡Ml (11)反射進入二向色鏡
(13)，通過物鏡(15)打到電動平移臺(7)上的樣品，然后一部分激光穿過樣品，經聚光器
(16)聚焦，反射鏡M2(12)反射，進入光電二極管(5)采集透射信號，把透射信號轉換為電信號；另一部分激光返回物鏡(15)，通過二向色鏡(13)，經發射慮波片(14)濾除雜波，進入光電倍增管(4)采集熒光信號，把熒光信號轉換為電信號；光電倍增管(4)和光電二極管(5)的數據傳入數據采集卡￠)，數據采集卡￠)的數據傳入計算機(9)，計算機(9)通過電動平移臺控制器⑶控制電動平移臺(7)移動，電動平移臺(7)位于聚光器(16)和物鏡(15)間，由兩個表面平坦且相互正交垂直的X軸平移臺和Y軸平移臺組成；計算機控制電動平移臺以完成成像。
[0035]所述可調諧飛秒激光源Tsunami為美國光譜物理公司(Spectra-Physics)所生產的摻鈦藍寶石固體激光器系統Tsunami，為中心波長800nm，重頻82MHz，脈寬約50fs的超短脈沖鎖模激光；
[0036]所述二向色鏡用于反射激光，透射熒光；由美國Chroma公司生產，型號為680dcspxr ；
[0037]所述發射濾波片由紅外截止濾波和帶通濾波片構成；帶通濾波片是兆九光電公司的產品BP580/70K和BP450/100k。紅外截止濾波片為Chroma公司的NC212066_ET670sp型女口廣叩；
[0038]所述光譜儀是美國海洋光學公司(Ocean Optics)的HR400光纖光譜儀；
[0039]所述光電倍增管是日本濱松公司(Hamamatsu)生產的R3896型；
[0040]所述光電二極管為PIN型光電二極管；
[0041]所述數據采集卡為研華公司生產的PC1-1714型數據采集卡。
[0042]所述電動平移臺為英國pr1r公司的H117P2IX型電動平移臺。
[0043]所述電動平移臺控制器用于電動平移臺的手動和外部驅動控制；為H31XYZE型控制器。用于Hl 17P2IX型電動平移臺的手動和外部驅動控制。
[0044]所述計算機利用電動平移臺控制器控制電動平移臺移動；同時接收數據采集卡傳來的數據，進行成像。
[0045]【具體實施方式】二:本實施方式與【具體實施方式】一不同的是:所述發射濾波片(14)由帶通濾波片和紅外截止濾波片構成，帶通濾波片位于靠近二向色鏡(13)的一側，紅外截止濾波片位于靠近光電倍增管(4)的一側。
[0046]【具體實施方式】三:本實施方式與【具體實施方式】一或二不同的是:所述可調諧飛秒激光源Tsunami產生的激光是中心波長為800nm、重頻為82MHz、脈寬為50fs的超短脈沖鎖模激光。
[0047]【具體實施方式】四:本實施方式與【具體實施方式】一、二或三不同的是:所述可調諧飛秒激光源Tsunami (I)水平射出，分束片(10)軸向豎直放置，與可調諧飛秒激光源Tsunami (I)同軸設置，表面與光線成45° ;反射鏡Ml (11)、反射鏡M2 (12)、電動平移臺(7)、物鏡(15)和聚光器(16)同軸設置，與可調諧飛秒激光源Tsunami (I)水平射出和分束片
(10)垂直設置，反射鏡Ml(ll)、反射鏡M2(12)軸向與地面成45°放置，表面與光線成45° ;二向色鏡(13)軸向與地面成45°放置,表面與光線成45° ;物鏡(15)和聚光器(16)同軸豎直放置；電動平移臺(7)與地面成水平放置；發射濾波片(14)軸向豎直放置，表面與光線成90° ;光線水平射入光電倍增管(4)、光電二極管(5)。
[0048]【具體實施方式】五:一種權利要求1所述飛秒激光雙光子突光生物顯微成像系統的成像方法，其特征在于:一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統的成像方法包括如下步驟:
[0049]步驟一、將可調諧飛秒激光源Tsunami發出的激光進行分束:一束激光通過多模光纖與光譜儀連接，從而監控可調諧飛秒激光源Tsunami的工作狀態；另一束激光與生物顯微鏡連接，用來激勵樣品；
[0050]步驟二、光束經過生物顯微鏡的物鏡后，光束分為前向透射光和后向出射光；
[0051]步驟三、前向透射光經過聚光器的收集后進入光電二極管，光電二極管輸出的信號由數據采集卡進行采集；
[0052]步驟四、后向出射光被物鏡收集后，通過二向色鏡將激光與熒光分開，經發射濾波片后，進入光電倍增管進行探測采集熒光，光電倍增管輸出的信號由數據采集卡進行采集;
[0053]步驟五、將數據采集卡采集的信息傳輸到計算機進行雙光子熒光顯微成像；
[0054]步驟六、計算機控制電動平移臺以完成成像。
[0055]所述生物顯微鏡為奧林巴斯研究級倒置顯微鏡1X71。
[0056]光電二極管是一種PIN硅光電二極管，由于可調諧飛秒激光器輸出激光的中心波長在800nm，而DETlOA在800nm有很好的響應靈敏度，因此DETlOA可以用于對透射光進行探測。
[0057]二向色鏡將入射激光透射至物鏡，同時確保產生的熒光信號能夠通過反射到達探測器，因此二向色鏡的透過率對雙光子熒光的收集效率影響很大；該二向色鏡對小于700nm波長的光透過率極低，但是對高于720nm波長的光透過率高于90 %，可以使大部分激光透過到達待測樣品。使用的二向色鏡為美國Semrock公司生產的FF705-Di01-25x36型女口廣叩；
[0058]發射濾波片由帶通濾波片和紅外截止濾波片構成,帶通濾波片用于對RhodamineB和DAPI染料的研究，紅外截止濾波片可以濾除400nm-660nm外的雜散光。光電倍增管(Photomultiplier Tube,PMT)是一種基于光電子發射效應、二次電子發射和電子光學理論把微弱入射光轉換成電子同時獲得倍增效果的重要真空發射器件，使用的光電探測儀器是由日本濱松公司生產的R3896型光電倍增管，其具有較高的量子效率和陽極靈敏度。
[0059]數據采集卡是研華公司生產的PC1-1714型數據采集卡，它是一款基于32位PCI總線架構的高性能數據采集卡，采樣速度可達30MHz/秒，到主機內存的A/D采樣具有連續不間斷、高速和流式數據的特點；將包含前向后向出射光的信息送入計算機，進行處理后得到成像息;
[0060]計算機通過電動平移臺控制器對電動平移臺進行外部驅動操作，電動平移臺通過控制電動平移臺沿X、Y軸的平移，改變激光照射電動平移臺上樣品的位置以完成圖像采集。
[0061]【具體實施方式】六:本實施方式與【具體實施方式】五不同的是:所述步驟一中將實驗樣品放于顯微鏡的電動平移臺上，光束經過顯微鏡的物鏡照射在電動平移臺上，從而完成對樣品的激勵操作。
[0062]采用以下實施例驗證本發明的有益效果:
[0063]實施例一:
[0064]采用本發明構建的實驗系統對Rhodamine B樣品進行雙光子突光顯微成像。Rhodamine B樣品制備步驟如下:首先,稱取4mg的Rhodamine B粉末置于試管中；其次，用移液器移取5ml的蒸餾水至裝有粉末樣品的試管中；最后，用磁力攪拌機攪拌均勻，得Rhodamine B溶液。將Rhodamine B溶液隨意滴在載玻片上,等待風干后,制備成待測樣品，利用已搭建好的顯微成像系統進行雙光子熒光顯微成像和透射成像研究。在進行雙光子熒光顯微成像時，實驗采用UPLSAP040X2萬能平場復消色差物鏡，其放大倍數為X 40，數值孔徑為0.95，濾波片為帶通濾波片BP580-70k和紅外截止濾波片，將掃描間隔設置為10 μ m，掃描范圍為lXlmm2，得到像素為100X100圖像，其結果如圖5所示。為了避免漂白現象，激光進入顯微鏡前功率為45mW，從圖中可以明顯看出RhodamineB染料的痕跡。
[0065]對于透射顯微成像技術，由于光電二極管的增益較大，而數據采集卡的輸入范圍是+-5v，激光進入顯微鏡前功率為40 μ W，其它參數與雙光子熒光顯微成像設置一致，成像大小lXlmm2，像素為100 X 100，其成像結果如圖6所示，由對比可知，雙光子熒光顯微成像和透射成像位置相對應，證明了本發明搭建的雙光子熒光生物顯微成像系統的正確性。
[0066]實施例二:
[0067]Rhodamine B也常常用于細胞和生物組織的染色，實驗中我們對染有Rhodamine B的Hela細胞進行雙光子熒光顯微成像，其樣品制備過程如下:
[0068](a)制備 Rhodamine B 儲存液:將 0.5mg Rhodamine B 溶解到 ImL PBS 緩沖液中，充分攪勻后，制備成Rhodamine B儲存液。并置于4°C的溫度下保存；
[0069](b)染色:將DAPI儲存液稀釋1000倍后加入培養基中，與Hela細胞在37°C共同孵育過夜；
[0070](c)漂洗:用PBS緩沖液對細胞進行漂洗，至少漂洗6次從而將未結合的RhodamineB 洗掉；
[0071](d)制備細胞懸液:用酶消化后離心得到細胞，將其加入培養基制成細胞懸液；
[0072](e)封片:取少量細胞懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片后封片。
[0073]在對染有Rhodamine B染料的細胞進行成像時，采用UPLSAP040X2萬能平場復消色差物鏡，其放大倍數為X 40，數值孔徑為0.95，飛秒激光中心波長800nm，帶寬50nm，入射到顯微鏡之前的激光功率為60mw，利用BP580-70K型帶通濾波片。其成像結果如圖7和圖8所示。由對比可知，雙光子熒光顯微成像和透射成像位置相對應，證明了本發明搭建的雙光子熒光生物顯微成像系統的正確性。
【權利要求】
1.一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統，其特征在于:所述系統包括:可調諧飛秒激光源Tsunami (I)、生物顯微鏡(2)、光譜儀(3)、光電倍增管(4)、光電二極管(5)、數據采集卡￠)、電動平移臺(7)、電動平移臺控制器(8)、計算機(9)和分束片(10);所述生物顯微鏡⑵包括反射鏡Ml (I I)、反射鏡M2 (12)、二向色鏡(13)、發射濾波片(14)、物鏡(15)和聚光器(16)； 所述可調諧飛秒激光源Tsunami (I)產生的激光經過分束片(10)對激光進行分束，分別進入生物顯微鏡(2)和光譜儀(3)，光譜儀(3)用于監控可調諧飛秒激光源Tsunami (I)的工作狀態，激光進入生物顯微鏡(2)經反射鏡Ml (11)反射進入二向色鏡(13)，通過物鏡(15)打到電動平移臺(7)上的樣品，然后一部分激光穿過樣品，經聚光器(16)聚焦，反射鏡M2 (12)反射，進入光電二極管(5)采集透射信號，把透射信號轉換為電信號；另一部分激光返回物鏡(15)，通過二向色鏡(13)，經發射慮波片(14)濾除雜波，進入光電倍增管(4)采集熒光信號，把熒光信號轉換為電信號；光電倍增管(4)和光電二極管(5)的數據傳入數據采集卡￠)，數據采集卡(6)的數據傳入計算機(9)，計算機(9)通過電動平移臺控制器(8)控制電動平移臺⑵移動，電動平移臺(7)位于聚光器(16)和物鏡(15)間，由兩個表面平坦且相互正交垂直的X軸平移臺和Y軸平移臺組成；計算機控制電動平移臺以完成成像。
2.根據權利要求1所述一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統，其特征在于:所述發射濾波片(14)由帶通濾波片和紅外截止濾波片構成，帶通濾波片位于靠近二向色鏡(13)的一側，紅外截止濾波片位于靠近光電倍增管(4)的一側。
3.根據權利要求1或2所述一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統，其特征在于:所述可調諧飛秒激光源Tsunami產生的激光是中心波長為800nm、重頻為82MHz、脈寬為50fs的超短脈沖鎖模激光。
4.根據權利要求1、2或3所述一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統，其特征在于:所述可調諧飛秒激光源Tsunami (I)水平射出，分束片(10)軸向豎直放置，與可調諧飛秒激光源Tsunami (I)同軸設置，表面與光線成45° ;反射鏡Ml (11)、反射鏡M2 (12)、電動平移臺(7)、物鏡(15)和聚光器(16)同軸設置，與可調諧飛秒激光源Tsunami (I)水平射出和分束片(10)垂直設置，反射鏡Ml (11)、反射鏡M2 (12)軸向與地面成45°放置，表面與光線成45° ;二向色鏡(13)軸向與地面成45°放置,表面與光線成45° ;物鏡(15)和聚光器(16)同軸豎直放置；電動平移臺(7)與地面成水平放置；發射濾波片(14)軸向豎直放置，表面與光線成90° ;光線水平射入光電倍增管(4)、光電二極管(5)。
5.一種權利要求1所述飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統的成像方法，其特征在于:一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統的成像方法包括如下步驟: 步驟一、將可調諧飛秒激光源Tsunami發出的激光進行分束:一束激光通過多模光纖與光譜儀連接，從而監控可調諧飛秒激光源Tsunami的工作狀態；另一束激光與生物顯微鏡連接，用來激勵樣品； 步驟二、光束經過生物顯微鏡的物鏡后，光束分為前向透射光和后向出射光； 步驟三、前向透射光經過聚光器的收集后進入光電二極管，光電二極管輸出的信號由數據采集卡進行采集； 步驟四、后向出射光被物鏡收集后，通過二向色鏡將激光與熒光分開，經發射濾波片后，進入光電倍增管進行探測采集熒光，光電倍增管輸出的信號由數據采集卡進行采集； 步驟五、將數據采集卡采集的信息傳輸到計算機進行雙光子熒光顯微成像； 步驟六、計算機控制電動平移臺以完成成像。
6.根據權利要求5所述一種飛秒激光雙光子熒光生物顯微成像系統的成像方法，其特征在于:所述步驟一中將實驗樣品放于顯微鏡的電動平移臺上，光束經過顯微鏡的物鏡照射在電動平移臺上，從而完成對樣品的激勵操作。
【文檔編號】G01N21/01GK104198458SQ201410503142
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月26日 優先權日:2014年9月26日
【發明者】夏元欽, 秦一凡, 楊兆輝, 李茜, 張盛, 劉斌, 趙陽 申請人:哈爾濱工業大學
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