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一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用高效離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法，包括樣品預處理、樣品測定和含量分析三個步驟，其特征在于：所述樣品測定步驟中流動相的選擇為A泵：0.02mol/LpH8.2的Tris-HCl；B泵：0.02mol/LpH8.2的Tris-HCl+0.5mol/LNaCl。本發明采用高效液相離子交換色譜法對乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分分析測定，方法重現性良好，且可以很好的反映出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分。
【專利說明】一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α -乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法。
【背景技術】
[0002]牛乳制品是現代日常飲食中不可或缺的組成部分，也是攝取蛋白質的重要來源。牛奶中的乳清蛋白被稱為蛋白之王，具有營養價值高、易消化吸收、含有多種活性成分等特點，是公認的人體優質蛋白質補充劑之一，其主要成分包括β -乳球蛋白、α -乳白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白等。
[0003]然而,對嬰幼兒而言,牛乳蛋白過敏癥(cow' milk allergy,CMA)是一種常見的蛋白過敏癥狀，發生率高達2%_6%，嚴重地影響嬰幼兒的身體健康。研究表明，牛乳制品中導致嬰幼兒過敏的蛋白成分主要是天然未變性的β_乳球蛋白和α-乳白蛋白。因此，建立牛乳β_乳球蛋白和α-乳白蛋白高特異性、高靈敏度、快速、準確的檢測方法，將對維護CMA患兒的健康起到積極的作用。目前，針對β_乳球蛋白和α-乳白蛋白檢測方法的研究多有報道，如常用的反相高效液相色譜法，但是，由于檢測過程使用有機溶劑如乙腈、甲醇等，會對導致天然蛋白成分發生變性，不能很好地反映出未變性的α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分。

【發明內容】

[0004]本發明為解決上述問題，提供了一種新的技術方案來滿足需求。
[0005]本發明的目的是提供了一種利用高效離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，包括樣品預處理、樣品測定和含量分析三個步驟，其特征在于:所述樣品測定步驟采用高效液相離子交換色譜法；所述采用高效液相離子交換色譜法中流動相的選擇為A泵:0.02mol/L pH8.2的Tris- HCl ；B泵:0.02mol/LρΗ8.2 的 Tris- HC1+0.5 mol/L NaCl。
[0006]所述的樣品預處理分為液態樣品預處理和固體或粉末狀樣品預處理；所述液態樣品預處理為將樣品于4°C下采用轉速4000rpm離心IOmin ;所述固體或粉末狀樣品預處理為將樣品溶于適量去離子水后離心，離心后將液態部分調節PH至4.6，靜置lOmin，于4°C下采用轉速IOOOOrpm離心15min,棄去沉淀,上清液調節pH至6-7,用3倍體積0.02mol/LpH8.2的Tris-HCl進行稀釋。
[0007]所述的高效液相離子交換色譜法的色譜條件為色譜柱:4.6 mmX 3.5 cm的TSKgel DEAE-NPR ;柱溫:25°C ;進樣體積:10μ L ;流速:lmL/min ;洗脫方式:0_5min等度洗脫100%A ；5-15min梯度洗脫0-100% B ;檢測波長280nm。
[0008]所述的含量分析為根據標準曲線法進行計算α -乳白蛋白和β -乳球蛋白含量。
[0009]所述的標準曲線為分別準確稱取α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準品，溶解于0.02mol/L pH8.2的TriS- HCl配制成一定濃度的標準溶液，分別稀釋成一定濃度梯度的標準稀釋液，0.45 μ m濾膜過濾，分別進樣進行測定，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標制作標準曲線。
[0010]有益效果:本發明采用高效液相離子交換色譜法對牛乳制品中未變性α -乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法進行分析測定時，在檢測過程中使用的流動相為緩沖溶液，不會使乳品中的天然蛋白成分發生變性；而且本發明的方法重現性良好，所以可以很好的反映出α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細描述。
[0012]圖1a-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準圖譜。
[0013]圖2原料乳色譜圖。
【具體實施方式】
[0014]下面的實施列可以使本專業技術人員更全面的理解本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。
[0015]實施例1 標準曲線的制作
分別準確稱取α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準品，溶解于0.02mol/L Tris- HCl(ρΗ8.2)配制成濃度為2mg/mL的標準溶液，分別稀釋成濃度分別為0.05,0.1,0.2,0.4、
0.8、1.0mg/mL標準稀釋液，0.45 μ m濾膜過濾分別進樣進行測定。以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標做標準曲線。α-乳白蛋白、β-乳球蛋白標準曲線分別為Y = 625741.3Χ -68252.8 (相關系數 R2=0.9923)和 Y = 510211.7Χ - 378208.3 相關系數 R2=0.9869)，線性范圍均在50-1000 μ g/mL。以信噪比S/N=3測定α-乳白蛋白和β-乳球蛋白最小檢出限分別為4 μ g/mL和12 μ g/mL。6次重復測定混合標準也中的α -乳白蛋白和β -乳球蛋白的含量，RSD分別為4.3 %和3.6%，表明本方法重現性良好。
[0016]實施例2
原料乳中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分測定
原料乳于4°C下以4000rpm離心10分鐘,棄去脂肪,調節pH至4.6,靜置lOmin, 4°C下以IOOOOrpm的轉速離心15min,0.45 μ m濾膜過濾。選用陰離子交換色譜柱TSKgel DEAE-NPR(4.6mmX3.5 cm),設置柱溫:25°C ;進樣體積:10 μ L ;流速:lmL/min ；流動相:A 泵:0.02mol/LTris- HCl (ρΗ8.2);Β 泵:0.02mol/L Tris- HCl (ρΗ8.2)+0.5 mol/L NaCl ;洗脫方式:0-5min等度洗脫100%A ;5-15min梯度洗脫0-100% B ;檢測波長280nm。根據標準曲線，計算出原料乳中Ct-乳白蛋白和β -乳球蛋白含量分別為0.9mg/g和4.7mg/g。
【權利要求】
1.一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法，包括樣品預處理、樣品測定和含量分析三個步驟，其特征在于:所述樣品測定步驟中采用高效液相離子交換色譜法；所述高效液相離子交換色譜法中流動相的選擇為A泵:0.02mol/L ρΗ8.2 的Tris- HC1，B泵:0.02mol/L ρΗ8.2 的Tris- HC1+0.5 mol/L NaCl。
2.根據權利要求1所述的一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的樣品預處理分為液態樣品預處理和固體或粉末狀樣品預處理；所述液態樣品預處理為將樣品于4°C下采用轉速4000rpm離心IOmin ;所述固體或粉末狀樣品預處理為將樣品溶于適量去離子水后離心，離心后將液態部分調節pH至4.6,靜置IOmin,于4°C下采用轉速IOOOOrpm離心15min,棄去沉淀,上清液調節pH至6-7，用3倍體積0.02mol/L ρΗ8.2的Tris-HCl進行稀釋。
3.根據權利要求1所述的一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的高效液相離子交換色譜法的色譜條件為色譜柱:4.6 mmX 3.5 cm的TSKgel DEAE-NPR ;柱溫:25°C ;進樣體積:10 μ L ;流速:lmL/min ;洗脫方式:0_5min等度洗脫100%A ；5-15min梯度洗脫0-100% B ;檢測波長280nm。
4.根據權利要求1所述的一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β_乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的含量分析為根據標準曲線法進行計算α-乳白蛋白和β_乳球蛋白含量。
5.根據權利要求1?4任一項所述的一種高效液相離子交換色譜法分析牛乳制品中未變性α-乳白蛋白和β-乳球蛋白成分的方法，其特征在于:所述的標準曲線為分別準確稱取α-乳白蛋白和β-乳球蛋白標準品，溶解于0.02mol/L pH8.2的Tris- HCl配制成一定濃度的標準溶液，分別稀釋成一定濃度梯度的標準稀釋液，0.45 μ m濾膜過濾，分別進樣進行測定，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標制作標準曲線。
【文檔編號】G01N30/88GK103792316SQ201410032986
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2014年1月24日
【發明者】邵彪, 陳剛, 許蓓蓓, 施炎炎 申請人:南通市產品質量監督檢驗所