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弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響研究方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌A549細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響研究方法，具體包括以下步驟：(1)MTT法檢測細胞的增殖；(2)A549細胞克隆形成能力檢測；(3)Hochest33342／PI雙染法檢測細胞凋亡；(4)單層細胞遷移實驗(wound?healing)；(5)Transwell侵襲實驗；(6)Western?blot檢測細胞遷移相關(guān)蛋白表達水平；(7)酶聯(lián)免疫吸附試驗；(8)統(tǒng)計分析。本發(fā)明通過研究弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌A549細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響，可以更好地利用Furin抑制劑a1-PDX抑制Furin在肺腺癌A549細胞中表達，從而有效地為癌癥治療提供依據(jù)。
【專利說明】弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響研究方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌A549細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響研究方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是當(dāng)今世界上嚴重威脅人類健康與生命的惡性腫瘤，且發(fā)病率也正逐年上升，肺癌發(fā)病率和死亡率在許多國家均居惡性腫瘤之首。據(jù)估計，一年中死于肺癌的患者人數(shù)超過前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌總?cè)藬?shù)。大約85%肺癌患者為非小細胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)，其按病理組織學(xué)分為腺癌、鱗癌、大細胞癌等。大多數(shù)患者在診斷時已局部進展或遠處轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是肺癌患者死亡的主要原因，大約90%的肺癌患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移。因而進行深入研肺腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移的分子機制很有必要。
[0003]Furin是蛋白前體加工酶家族中的重要成員，許多重要的生理過程需要Furin的參與，如多肽與蛋白質(zhì)激素的合成與分泌、膜受體的成熟、血漿蛋白前體的激活等；同時多種疾病的發(fā)生也與Furin密切相關(guān)，如病毒外殼蛋白和細菌外毒素的加工活化以及腫瘤的轉(zhuǎn)移等。這些蛋白質(zhì)在發(fā)揮活性之前需要經(jīng)過蛋白轉(zhuǎn)化酶對蛋白前體切割，然后才能成為有功能的蛋白質(zhì)。包括Notch、Wnt、MTl-MMP、VEGF等在內(nèi)的許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的蛋白質(zhì)在體內(nèi)成熟過程中，必須經(jīng)過Furin等蛋白轉(zhuǎn)化酶對其前體進行剪切，才能發(fā)揮生物學(xué)活性。而這些蛋白質(zhì)中部分成員與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，F(xiàn)urin在多種腫瘤中高表達，可以作為腫瘤進展過程中的Marker，在某種程度上可以作為腫瘤預(yù)后的指標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌A549細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響研究方法，以便更好地利用Furin抑制劑al-PDX抑制Furin在肺腺癌A549細胞中表達，從而有效地為癌癥治療提供依據(jù)。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
[0006]一種弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌A549細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響研究方法，具體包括以下步驟:
[0007](I)MTT法檢測細胞的增殖:
[0008]對數(shù)生長期A549細胞接種到96孔板中(每孔5 X 103)，24h后開始加入不同濃度的al-PDX (200nM、400nM)繼續(xù)培養(yǎng)24h_96h ;每孔加入20 μ I MTT試劑(5毫克/毫升)溶液，并于37°C溫育4小時。每孔加入150 μ L的DMSO溶解甲臜晶體，震蕩溶解后檢測490nm處的光密度。
[0009](2) A549細胞克隆形成能力檢測:
[0010]取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25%胰蛋白酶消化吹打成單個細胞，把細胞懸浮在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，以1X103 / ml的細胞密度接種于培養(yǎng)皿中；力口入不同濃度的al-PDX(200nM、400nM)置37°C、5% C02的飽和濕度環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2周。棄去上清液，PBS小心浸洗2次；甲醇固定15min。去除固定液，吉姆薩染液染色lOmin，流水緩慢沖洗后空氣干燥后，肉眼直接計數(shù)克隆并統(tǒng)計分析。
[0011](3)Hochest33342 / PI雙染法檢測細胞凋亡:
[0012]對數(shù)生長期細胞4549按1父104個/ ml濃度接種于提前用多聚賴氨酸處理的蓋片上。不同濃度的al-PDX處理48h后，傾去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷PBS洗滌細胞2次；調(diào)整Hocchst33342 / PI染液濃度至終濃度5 μ g / ml，37°C避光染色15min ;棄去染液，加入4%多聚甲醒4°C固定5min。在突光顯微鏡下觀察拍攝。
[0013](4)單層細胞遷移實驗(wound healing):
[0014]A549細胞接種在6孔板，待生長至匯合度達100%時，用無菌的200 μ I的Tip頭尖制成劃痕(wound)，并用PBS洗滌細胞碎片。細胞處理同前。在指定的時間用倒置顯微鏡配備的數(shù)碼相機拍攝受傷區(qū)域的細胞遷移情況。
[0015](5) Transwell 侵襲實驗:
[0016]不同濃度al-PDX處理的A549細胞(1X105)接種于Transwell小室的上部腔室，含有200 μ I的RPMI1640培養(yǎng)基，但不含10% FBS0 Transwell小室下部腔室被填充有500 μ I的完整的RPMI1640培養(yǎng)基，含10% FBS0使細胞遷移48小時，然后用4%甲醛將細胞固定，室溫下孵育15分鐘。去離子水洗滌后，0.1%結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下拍攝遷移的克隆。
[0017](6) Western blot檢測細胞遷移相關(guān)蛋白表達水平:
[0018]收集細胞加入RIPA緩沖液(50mM的Tris ρΗ7.4，150mM氯化鈉，I %的Tri tonX-100,0.1%SDS, I %脫氧膽酸鈉，5mMEDTA，IOOmM的氟化鈉)及蛋白酶抑制劑，冰上孵育30分鐘，13200rpm離心30min。收集上清并BCA法(Pierce，USA)測定蛋白濃度。細胞總蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉lh。在4°C下孵育MT 1-MMP, VEGF-C, VEGF-D和GAPDH(1:1000)的抗體過夜。PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫下孵育lh，PBST洗滌后，超敏發(fā)光液(Pierce公司，美國)孵育后，LAS3000成像儀(富士，日本)拍照。
[0019](7)酶聯(lián)免疫吸附試驗:
[0020]A549細胞處理同前所述，收集細胞培養(yǎng)上清并根據(jù)MMP-9、MMP-2、VEGF-c ELISA檢測試劑盒說明書進行后續(xù)的檢測。每個樣品重復(fù)5次。
[0021](8)統(tǒng)計分析:
[0022]應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用配對t檢驗及單因素方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P < 0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0023]該發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明通過研究弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌A549細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響，可以更好地利用Furin抑制劑al-PDX抑制Furin在肺腺癌A549細胞中表達，從而有效地為癌癥治療提供依據(jù)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞的增殖影響圖。
[0025]圖2是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞的集落形成影響圖。[0026]圖3是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞凋亡的影響圖(對照組)。
[0027]圖4是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞凋亡的影響圖(200nM al_PDX處理組)。
[0028]圖5是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞凋亡的影響圖(400nM al-PDX處理組)。
[0029]圖6是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞凋亡的影響圖(三次獨立實驗細胞凋亡率統(tǒng)計分析)。
[0030]圖7是本發(fā)明實施例中單層細胞劃痕檢測al-PDX對細胞遷移的影響圖。
[0031]圖8是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞遷移的影響的三次獨立實驗統(tǒng)計分析圖。
[0032]圖9是本發(fā)明實施例中a 1-PDX對A549浸潤能力的影響圖(對照組)。
[0033]圖10是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549浸潤能力的影響圖(200nM al-PDX處理組)。
[0034]圖11是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549浸潤能力的影響圖(400nM al-PDX處理組)。
[0035]圖12是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549三次獨立實驗細胞浸潤能力統(tǒng)計分析圖。
[0036]圖13是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞遷移相關(guān)蛋白表達的影響圖。
[0037]圖14是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞MMP-9表達的影響圖。
[0038]圖15是本發(fā)明實施例中al-PDX對A549細胞MMP-2表達的影響圖。
【具體實施方式】
[0039]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行描述，以便更好的理解本發(fā)明。
[0040]實施例
[0041]一種弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌A549細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響研究方法，具體包括如下方面:
[0042](I)細胞培養(yǎng)過程:人肺腺癌細胞系A(chǔ)549購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和細胞庫。生長在含有10%胎牛血清(FBS)和100單位/ mL青霉素，100 μ g / mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco，USA)中，于37°C、5% C02、飽和濕度下培養(yǎng)。
[0043](2)所用主要試劑包括:Furin抑制劑a 1-PDX (Merck貨號:126850-2.5MG)溶于DMSO 中，制成 5mM 母液。鼠抗人 VEGF-C，VEGF-D，MTl-MMP 和 GAPDH 抗體均購自 Santa Cruz公司(Santa Cruz,美國)。抗鼠IgG抗體-HRP和抗兔Ig6_HRP,購自西格瑪公司(Siama,USA) ;MTT、Hochest33342、Transwell 購自美國 Promega 公司；MMP2、MMP9ELISA 檢測試劑盒購自南京建成生物試劑公司。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0044](3)具體實施過程及方法實驗方法:
[0045](3a)MTT法檢測細胞的增殖:
[0046]對數(shù)生長期A549細胞接種到96孔板中(每孔5 X 103)，24h后開始加入不同濃度的al-PDX (200nM、400nM)繼續(xù)培養(yǎng)24h_96h。每孔加入20 μ I MTT試劑(5毫克/毫升)溶液，并于37°C溫育4小時。每孔加入150 μ L的DMSO溶解甲臌晶體，震蕩溶解后檢測490nm處的光密度。[0047](3b) A549細胞克隆形成能力檢測:
[0048]取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25%胰蛋白酶消化吹打成單個細胞，把細胞懸浮在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，以1X103 / ml的細胞密度接種于培養(yǎng)皿中。加入不同濃度的al-PDX(200nM、400nM)置37°C、5% C02的飽和濕度環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2周。棄去上清液，PBS小心浸洗2次。甲醇固定15min。去除固定液，吉姆薩染液染色lOmin，流水緩慢沖洗后空氣干燥后，肉眼直接計數(shù)克隆并統(tǒng)計分析。
[0049](3c)Hochest33342 / PI雙染法檢測細胞凋亡:
[0050]對數(shù)生長期細胞4549按1父104個/ ml濃度接種于提前用多聚賴氨酸處理的蓋片上。不同濃度的al-PDX處理48h后，傾去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷PBS洗滌細胞2次；調(diào)整Hoechst33342 / PI染液濃度至終濃度5 μ g / ml，37°C避光染色15min ;棄去染液，加入4%多聚甲醒4°C固定5min。在突光顯微鏡下觀察拍攝。
[0051](3d)單層細胞遷移實驗(wound healing):
[0052]A549細胞接種在6孔板，待生長至匯合度達100%時，用無菌的200 μ I的Tip頭尖制成劃痕(wound)，并用PBS洗滌細胞碎片。細胞處理同前。在指定的時間用倒置顯微鏡配備的數(shù)碼相機拍攝受傷區(qū)域的細胞遷移情況。
[0053](3e) Transwell 侵襲實驗:
[0054]不同濃度al-PDX處理的A549細胞(1X105)接種于Transwell小室的上部腔室，含有200 μ I的RPMI1640培養(yǎng)基，但不含10% FBS0 Transwell小室下部腔室被填充有500 μ I的完整的RPMI1640培養(yǎng)基，含10% FBS0使細胞遷移48小時，然后用4%甲醛將細胞固定，室溫下孵育15分鐘。去離子水洗滌后，0.1%結(jié)晶紫染色。在光學(xué)顯微鏡下拍攝遷移的克隆。
[0055](3f) Western blot檢測細胞遷移相關(guān)蛋白表達水平:
[0056]A549細胞培養(yǎng)及處理同前。收集細胞加入RIPA緩沖液(50mM的Tris pH7.4,150mM氯化鈉，1%的Triton X-100,0.1% SDS，I %脫氧膽酸鈉，5mM EDTA, IOOmM的氟化鈉)及蛋白酶抑制劑，冰上孵育30分鐘，13200rpm離心30min。收集上清并BCA法(Pierce，USA)測定蛋白濃度。細胞總蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉 lh。在 4°C下孵育 MT1-MMP、VEGF-C、VEGF-D 和 GAPDH(1:1000)的抗體過夜。PBST 洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫下孵育lh，PBST洗滌后，超敏發(fā)光液(Pierce公司，美國)孵育后，LAS3000成像儀(富士，日本)拍照。
[0057](3g)酶聯(lián)免疫吸附試驗:
[0058]A549細胞處理同前所述，收集細胞培養(yǎng)上清并根據(jù)MMP-9、MMP-2、VEGF_cELISA檢測試劑盒說明書進行后續(xù)的檢測。每個樣品重復(fù)5次。
[0059](4)統(tǒng)計分析:
[0060]應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用配對t檢驗及單因素方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P < 0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0061](5)實施結(jié)果:
[0062](5a) al-PDX對A549細胞的增殖和集落形成的影響:
[0063]不同濃度的al-PDX作用A549不同時間后，MTT法檢測細胞的存活，如圖1所示。結(jié)果顯示，al-PDX作用A549細胞48h以上時，細胞的生長受到顯著抑制。集落形成法檢測A549細胞的克隆形成。結(jié)果表明，與對照組相比，al-PDX處理的A549細胞的集落形成能力顯著降低，如圖2所示。
[0064](5b) al-PDX對A549細胞凋亡的影響:
[0065]為探討al-PDX對A549細胞生長抑制的機制，首先使用Hochest33342 / PI雙染檢測A549細胞凋亡。結(jié)果表明，al-PDX能誘導(dǎo)A549細胞凋亡的發(fā)生，如圖3、圖4、圖5、圖6所示。
[0066](5c) al-PDX對A549細胞遷移和侵襲的影響:
[0067]為檢測al-PDX是否對A549細胞的遷移和侵襲有調(diào)節(jié)作用，用wound Heal ing和Transwell實驗進一步檢測了 A549細胞遷移的情況。兩種實驗結(jié)果均表明al-PDX顯著降低了 A549細胞遷移和侵襲能力，如圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12所示。
[0068](5d) al-PDX對細胞遷移相關(guān)蛋白的表達的影響:
[0069]許多蛋白質(zhì)在體內(nèi)參與腫瘤細胞遷移的調(diào)節(jié)。為充分了解al-PDX調(diào)節(jié)A549細胞遷移的分子機制，通過Western Blot和ELISA法檢測了細胞MTl-MMP、MMP2、MMP9、VEGF_c、VEGF-d蛋白表達水平。如圖13所示，al-PDX顯著降低了細胞內(nèi)MT-MMP、VEGF-c、VEGF_d的表達。同時細胞培養(yǎng)液上清中MMP2和MMP9濃度也明顯低于對照組，如圖14、圖15所示。這些結(jié)果表明，al-PDX抑制A549細胞遷移可能與降低MT1-MMP，MMP2 / 9，VEGF-C / D的表達有關(guān)。
[0070]在本發(fā)明實施例中，F(xiàn)urin抑制劑al-PDX可誘導(dǎo)A549細胞增殖抑制和凋亡。此外，A549細胞經(jīng)al-PDX孵育后，遷移能力顯著降低。這些基質(zhì)金屬蛋白酶的表達水平，有效地反映腫瘤細胞的浸潤能力。al-PDX不僅能抑制MMP2和MMP9的表達，而且能降低MTl-MMP的表達。al-PDX降低了 Furin酶活性，進而降低了 MTl-MMP成熟及激活，進一步抑制了 MMP2、MMP9的成熟。al-PDX處理的細胞VEGF-C和VEGF-D蛋白表達顯著減少。下調(diào)Furin酶活性，從而抑制A549細胞的MMPs和VEGFs蛋白的表達可能是其抑制A549生長和遷移、浸潤的機制。
[0071]以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種弗林蛋白酶抑制劑對肺腺癌A549細胞生長和轉(zhuǎn)移的影響研究方法，其特征在于:具體包括以下步驟: (1)MTT法檢測細胞的增殖:對數(shù)生長期A549細胞接種到96孔板中(每孔5X103)，24h后開始加入不同濃度的al-PDX(200nM、400nM)繼續(xù)培養(yǎng)24h_96h ;每孔加入20 μ I MTT試劑(5毫克/毫升)溶液，并于37°C溫育4小時；每孔加入150 μ L的DMSO溶解甲臜晶體，震蕩溶解后檢測490nm處的光密度； (2)A549細胞克隆形成能力檢測:取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)細胞，用0.25%胰蛋白酶消化吹打成單個細胞，把細胞懸浮在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，以1X103 / ml的細胞密度接種于培養(yǎng)皿中；加入不同濃度的al-PDX(200nM、400nM)置37°C、5% C02的飽和濕度環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2周；棄去上清液，PBS小心浸洗2次；甲醇固定15min ;去除固定液，吉姆薩染液染色lOmin，流水緩慢沖洗后空氣干燥后，肉眼直接計數(shù)克隆并統(tǒng)計分析； (3)Hochest33342/ PI雙染法檢測細胞凋亡:對數(shù)生長期細胞A549按I X 104個/ ml濃度接種于提前用多聚賴氨酸處理的蓋片上；不同濃度的al-PDX處理48h后，傾去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷PBS洗滌細胞2次；調(diào)整H0echst33342 / PI染液濃度至終濃度5 μ g / ml, 37°C避光染色15min ;棄去染液,加入4%多聚甲醒4°C固定5min ;在突光顯微鏡下觀察拍攝； (4)單層細胞遷移實驗(woundhealing):A549細胞接種在6孔板,待生長至匯合度達100%時，用無菌的200 μ I的Tip頭尖制成劃痕(wound)，并用PBS洗滌細胞碎片；在指定的時間用倒置顯微鏡配備的數(shù)碼相機拍攝受傷區(qū)域的細胞遷移情況； (5)Transwell侵襲實驗:不同濃度al_PDX處理的A549細胞(I X 105)接種于Transwell小室的上部腔室，含有200 μ I的RPMI1640培養(yǎng)基，但不含10% FBS ；TranswelI小室下部腔室被填充有500 μ I的完整的RPMI1640培養(yǎng)基，含10% FBS ;使細胞遷移48小時，然后用4%甲醛將細胞固定，室溫下孵育15分鐘；去離子水洗滌后，0.1 %結(jié)晶紫染色；在光學(xué)顯微鏡下拍攝遷移的克隆； (6)Western blot檢測細胞遷移相關(guān)蛋白表達水平:收集細胞加入RIPA緩沖液(50mM的 Tris pH7.4，150mM 氯化鈉，1% 的 Triten X-100,0.1% SDS，I % 脫氧膽酸鈉，5mMEDTA，IOOmM的氟化鈉)及蛋白酶抑制劑，冰上孵育30分鐘，13200rpm離心30min ;收集上清并BCA法(Pierce，USA)測定蛋白濃度；細胞總蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉Ih ;在4°C下孵育MT1-MMP、VEGF-C、VEGF-D和GAPDH(1:1000)的抗體過夜；PBST洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗，室溫下孵育lh，PBST洗滌后，超敏發(fā)光液孵育后采用LAS3000成像儀拍照； (7)酶聯(lián)免疫吸附試驗:A549細胞處理同前所述，收集細胞培養(yǎng)上清并根據(jù)MMP-9、MMP-2、VEGF-c ELISA檢測試劑盒說明書進行后續(xù)的檢測；每個樣品重復(fù)5次； (8)統(tǒng)計分析:應(yīng)用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料采用配對t檢驗及單因素方差分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，P < 0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
【文檔編號】G01N33/53GK103743909SQ201310653721
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】徐松濤, 馬永超, 劉曉東, 范文娟, 郭小慧, 吳華, 李飛 申請人:漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校