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HtrA3免疫組化試劑在制備預測肺癌術后復發轉移試劑中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及HtrA3免疫組化試劑在制備預測肺癌術后復發轉移試劑中的應用。具體地，提供了HtrA3免疫組化試劑、包含HtrA3免疫組化試劑的試劑盒在制備預測肺癌術后復發轉移率、術后復發轉移時間和/或術后生存時間的試劑或試劑盒中的應用。本發明證實了肺癌組織中HtrA3表達顯著下降，HtrA3表達強陽性的肺癌患者術后復發轉移率顯著降低，HtrA3表達越低，術后復發轉移時間越早、術后生存時間越短，表明HtrA3可作為肺癌術后復發的生物標記物，為預測NSCLC患者術后復發轉移率、術后復發轉移時間以及術后生存時間提供了一種切實可行的方法。
【專利說明】HtrA3免疫組化試劑在制備預測肺癌術后復發轉移試劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及臨床診斷【技術領域】，具體地說，涉及HtrA3免疫組化試劑在制備預測肺癌術后復發轉移試劑中的應用。
【背景技術】
[0002]肺癌是惡性腫瘤中發病率最高的腫瘤之一，并且其病死率在所有腫瘤中位居第一，流行病學研究表明肺癌的5年生存率不足15%。非小細胞肺癌(non-small cell lungcancer，NSCLC)占所有新發肺癌的80%?85%。手術切除是早中期可切除肺癌(即I?IIIA期)治療效果最好的方法，也是早中期NSCLC的主要治療手段。然而，I期NSCLC患者術后5年生存率不到70%，而IIIA期患者術后5年生存率不到20%，其原因主要是手術后的復發和轉移。預測NSCLC患者術后復發轉移的發生，并對高危人群加強隨訪密度和術后輔助化、放療強度將有助于早期可切除NSCLC患者的術后個體化管理、降低術后復發轉移率以及延長無疾病生存期和總生存期。
[0003]目前在該領域的生物標記物研究仍處于新興階段，尚無成熟的可用于NSCLC術后復發轉移預測的指標。
[0004]HtrA3 是肺癌組織中高溫條件因子A3(high temperature requirement factor A3,HtrA3)，又稱妊娠相關絲氨酸蛋白酶，共有2種異構體，即HtrA3長異構體和短異構體，由位于染色體4pl6.1的基因編碼而成，2種異構體均有蛋白酶活性。
[0005]目前還未見HtrA3可作為預測肺癌術后復發的生物標記物的相關報道。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供HtrA3免疫組化試劑的新用途。
[0007]本發明另一的目的是，提供包含HtrA3免疫組化試劑的試劑盒的新用途。
[0008]為實現上述第一個目的，本發明采取的技術方案是:
HtrA3免疫組化試劑在制備預測肺癌術后復發轉移率、術后復發轉移時間和/或術后生存時間的試劑中的應用。
[0009]所述的HtrA3免疫組化試劑包括抗原修復液、封閉液、HtrA3 一抗、HtrA3 二抗、抗體稀釋液(用于稀釋抗體或洗片子)和顯色劑。
[0010]所述的抗原修復液是pH 6.0的枸櫞酸緩沖液，所述的封閉液是10%胎牛血清，所述的HtrA3 —抗是鼠抗人HtrA3單克隆抗體，所述的抗體稀釋液是磷酸緩沖鹽_20%吐溫溶液，所述的顯色劑是DAB顯色劑。
[0011]為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是:
包含HtrA3免疫組化試劑的試劑盒在制備預測肺癌術后復發轉移率、術后復發轉移時間和/或術后生存時間的試劑或試劑盒中的應用。
[0012]所述的試劑盒還包含石蠟包埋的正常肺組織標本切片，用于作為陽性對照。[0013]需要說明的是，所述的HtrA3免疫組化試劑或包含HtrA3免疫組化試劑的試劑盒還可以進一步包括用于包埋組織和制作切片的試劑，例如載玻片清潔液、多聚賴氨酸(用于處理載玻片，防止脫片)、固定液、蔗糖溶液(組織脫水用)、酒精(用于梯度脫水)、二甲苯(用于透明)、石蠟(作為包埋劑)、活化劑、H2O2 (用于滅活內源性過氧化物酶)和/或封片液。所述的固定液可以是4%多聚甲醛或冷丙酮，所述的活化劑可以是EDTA或Triton X-100，所述的封片液可以是50%緩沖甘油。
[0014]本發明優點在于:
本發明對手術治療后的廣IIIA期NSCLC患者肺癌手術標本中HtrA3做免疫組化檢測，然后分析陽性細胞百分比和細胞染色強度并進行打分，再以二者分數的乘積作為總分數，將肺癌組織樣本歸為陰性(_)、弱陽性(+ )或強陽性(++)，最終研究了 HtrA3表達量與術后復發轉移率、術后復發轉移時間以及術后生存時間的關系。結果提示肺癌組織HtrA3表達顯著下降，HtrA3表達強陽性的肺癌患者術后復發轉移率顯著降低，HtrA3表達越低，術后復發轉移時間越早、術后生存時間越短。本發明提供了證實了 HtrA3可作為肺癌術后復發的生物標記物，為預測NSCLC患者術后復發轉移率、術后復發轉移時間以及術后生存時間提供了一種切實可行的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]附圖1是正常肺組織(Normal)和肺癌組織(Cancer)的HtrA3表達。該圖從Normal組選取了 12例，Cancer組選取了 78例作為示范。
[0016]附圖2是HtrA3的表達和肺癌術后復發轉移時間。DFS:無疾病生存；*p〈0.001。
[0017]附圖3是HtrA3的表達和肺癌術后生存曲線分析。
【具體實施方式】
[0018]下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0019]實施例1
本發明的技術路線是:(I)獲取肺癌患者手術標本，石蠟包埋，切片；(2)免疫組化方法檢測肺癌組織HtrA3表達；(3)顯微鏡下半定量分析；(4)判定肺癌組織HtrA3表達的臨床意義。
[0020]一、方法
對1018例接受手術治療的ΙΙΙΑ期NSCLC患者進行分析，根據肺癌治療指南術后無需放療和化療的患者共546例，對546例手術標本按照下述方法進行HtrA3檢測。按照指南推薦的方案隨訪5年，記錄復發轉移及生存情況，分析手術切除的肺癌組織HtrA3的表達和臨床轉歸之間的關系。
[0021]1、采用免疫組化的方法檢測肺癌手術標本中HtrA3的表達水平
HtrA3共有2種異構體，即HtrA3長異構體和短異構體，由位于染色體4pl6.1的基因編碼而成。由于2種異構體均有生物學功能，因此用于本方法的HtrA3抗體可以同時檢出長異構體和短異構體。
[0022]操作步驟:
(O按照常規方法制備手術切除肺癌組織的標本切片:手術切除肺癌組織經常規處理后透蠟2~3次，每次15~30min。之后放入紙盒，將熔蠟倒入盒內，用冷水使熔蠟迅速冷卻凝固，30min后取出制成石蠟包埋的肺癌組織塊備測。用加熱的蠟鏟將石蠟包埋的肺癌組織塊固著在旋轉式切片機上的金屬小盤上，并使組織塊朝外，用加熱刀片將固著的石蠟包埋組織塊四周修平，使上下兩面修成平行面。搖動切片機轉輪，進行切片，將切片投入到48°C的溫水浴中，使切片自然展平，然后用涂有5%明膠水溶液的載玻片撈取切片，于室溫下放置一晝夜后使其徹底干燥；
(2)枸櫞酸緩沖液(pH6.0)處理15分鐘；
(3)10%胎牛血清處理20分鐘去除非特異性抗體結合；
(4)加上1:200的單克隆鼠抗人HtrA3抗體，室溫作用I小時。以不加抗體的空白溶液作為陰性對照；
(5)磷酸緩沖鹽-20%吐溫溶液洗去抗體溶液；
(6)二抗(Poly-HRP anti mouse IgG (Polink-2 plus Kit,購于 Golden BridenInternational, Inc USA)作用 15 分鐘；
(7)加上DAB顯色劑染色染色15分鐘，并以蘇木為對比色；
(8)顯微鏡下閱片:在400倍放大情況下，每個標本隨機抽取15個視野，計算HtrA3陽性的細胞百分比。應用Image J軟件，每張切片按照橫軸和縱軸分為25個區域，每個區域截取左上角的5個細胞，讀取染色灰度，取25個區域的平均讀數為該樣本的染色強度數值。由兩位病理學醫生 獨立讀片判定分數，取平均分為最終結果。
[0023]2、免疫組化結果的判定
(O定性:無HtrA3染色為陰性，有染色為陽性。
[0024](2)半定量:
①陽性細胞百分比的記分如下:無陽性細胞為O分，1%~10%陽性為I分，11%~50%為2分，51%~80%為3分，81%~100%為4分。
[0025]②細胞染色強度的記分如下:假設陰性對照的讀數為0，正常滋養細胞(高表達HtrA3的細胞，為本方法的陽性對照)的讀數為100，如染色強度讀數在0_10記為“無染色O分”，在11-40記為“弱染色陽性I分”，在41-70記為“中等染色陽性2分”，在71-100記為“強染色陽性3分”。
[0026]③再以陽性細胞百分比分數與細胞染色強度分數的乘積進行評分，共0-12分。經上述步驟計算得到為O分的定為陰性，記為(_);1-5分的定為弱陽性，表達為(+ );6分及以上的為強陽性，記為(++)。
[0027]二、結果
對546例接受手術治療且無需再放療和化療的I~ΙΙΙΑ期NSCLC患者的肺癌手術標本中HtrA3做免疫組化檢測，統計了 HtrA3表達量與術后5年期間復發轉移率、術后復發轉移時間、術后生存時間的關系。若隨訪滿5年未出現復發轉移者，術后復發轉移時間記為60個月；仍存活者，術后生存時間記為60個月。結果如下:
(I)和癌旁正常肺組織相比，肺癌組織HtrA3表達顯著降低，HtrA3表達強陽性的肺癌患者術后復發轉移率顯著降低。
[0028]正常肺組織100%陽性，且均為(++)。546例肺癌手術標本中，(_) 280例，(+ )224例，(++) 42例，表明肺癌組織HtrA3表達顯著降低(13分半定量法1.436±0.238 vs8.25±1.36，ρ〈0.0001，圖1)。
[0029]HtrA3表達為(++)的患者術后5年復發轉移率為0，( + )為31.25%，(-)為30.43%，表明HtrA3為高表達的肺癌患者術后復發轉移率顯著低于無表達和低表達患者(p=0.0313)。
[0030](2 ) HtrA3表達越低,術后復發轉移時間越早。
[0031]對術后復發轉移時間統計發現，HtrA3表達越低，復發轉移時間越早,其半定量表達值和術后復發轉移的時間呈正相關(P=0.0139 )。
[0032]HtrA3 (++)患者平均術后復發轉移時間為60.00個月(即在5年隨訪期內未見復發)，(+ )患者平均為44.66 ±17.75個月，(_)患者則更早，平均為40.43 ±17.36個月，三組間比較p〈0.001 (圖2)。
[0033](3 ) HtrA3表達越低,術后生存時間越短。
[0034]對術后生存時間統計發現，HtrA3的半定量表達值和術后生存時間呈正相關(ρ=0.0014)。
[0035]HtrA3(++)的肺癌患者術后生存期平均為60.00個月(即在5年隨訪期內均存活)，(+ )的患者平均為48.44± 15.50個月，而(-)患者平均為44.40± 13.56個月，三組間比較p〈0.001。圖3為不同HtrA3表達水平患者的生存曲線。
[0036]實施例2
采集臨床接受手術治療后，且切緣陰性，根據肺癌治療指南術后無需放療和化療的患者10例，根據實施例1的方法制備肺癌組織切片，進行HtrA3免疫組化檢測，最終判定(_)患者6例，(+ )患者3例，(++)患者I例。統計各患者的術后復發轉移情況:(++)患者未見復發轉移，(+ )患者有I例復發轉移，(-)患者有2例復發轉移。統計各患者術后復發轉移時間以及術后生存時間，結果均在實施例1統計的對應的時間象限內。以上結果表明本發明的方法可準確有效地用于臨床診斷。
[0037]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員，在不脫離本發明方法的前提下，還可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.HtrA3免疫組化試劑在制備預測肺癌術后復發轉移率、術后復發轉移時間和/或術后生存時間的試劑中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述的HtrA3免疫組化試劑包括抗原修復液、封閉液、HtrA3 一抗、HtrA3 二抗、抗體稀釋液和顯色劑。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述的抗原修復液是pH6.0的枸櫞酸緩沖液，所述的封閉液是10%胎牛血清，所述的HtrA3 —抗是鼠抗人HtrA3單克隆抗體，所述的抗體稀釋液是磷酸緩沖鹽-20%吐溫溶液，所述的顯色劑是DAB顯色劑。
4.包含HtrA3免疫組化試劑的試劑盒在制備預測肺癌術后復發轉移率、術后復發轉移時間和/或術后生存時間的試劑或試劑盒中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述的試劑盒還包含石蠟包埋的正常肺組織標本切片。
【文檔編號】G01N33/577GK104007263SQ201410216210
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月22日 優先權日:2014年5月22日
【發明者】張靜, 馮明祥, 瞿介明, 譚黎杰, 王群, 張新 申請人:復旦大學附屬中山醫院