快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法
【專利摘要】本發明涉及毒物檢測【技術領域】，是一種快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法；按下述方法進行：第一步，在污染水源地取污染水6mL 作污染樣，將污染樣分成3 份每份2mL 分別移入3 支具塞磨口比色管中并分別標記為試樣A 、試樣B 和試樣C 。本發明快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法較傳統的化學毒物檢測方法大大縮短了檢測周期、簡化了操作，說明本發明快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法檢測周期短、操作過程簡單，大大提高了檢測效率，降低了檢測成本，適宜于當前反恐應急化學毒物的現場快速檢測和對化學毒物進行進一步危害性評估。
【專利說明】快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及毒物檢測【技術領域】，是一種快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒 性大小的方法。
【背景技術】
[0002]近年來，國家分裂與反分裂、恐怖與反恐怖的斗爭進入一個比較尖銳的時期。隨 著國際形勢發生的深刻變化，在民族分裂主義、宗教極端主義、暴力恐怖主義三股勢力的影 響、慫恿和支持下，新疆境內外的民族分裂破壞活動處于升級態勢，我國面臨恐怖襲擊的直 接威脅，做好重大恐怖襲擊時化學毒物的應急監測具有重要的民用及軍事意義。
[0003]恐怖主義已成為嚴重危害國家安全的重要因素。盡管恐怖份子采用的方法各不相 同，但投放化學毒物是目前最常采用的手段之一，恐怖份子通常選擇水源、人群密集場所等 投毒，以極小的成本造成大面積的傷亡和危害，引發嚴重的社會恐慌。面對日益頻繁的恐怖 活動，毒物檢測、識別和排除技術是反恐應急處理的關鍵之一。
[0004]全身中毒性毒劑（systemic agents)主要為氫氰酸（hydrogen cyanide，HCN)，其 化合物分子中含CN-，故屬氰類毒劑（cyanide agents)。施放后呈蒸氣態，經呼吸道吸入， 作用于細胞呼吸鏈末端細胞色素氧化酶，使細胞能量代謝受阻，供能失調，迅速導致機體功 能障礙，是一類速殺性毒劑。氫氰酸可經人體皮膚、眼睛或胃腸道迅速吸收，口服少量即可 引起猝死。它阻滯人體的三羧酸循環，使組織細胞的生物氧化作用不能正常進行，造成"細 胞內窒息"，中樞神經系統首先受累，呼吸中樞麻痹常為氰化物中毒的致死原因。
[0005] 傳統的化學毒物檢測方法的核心技術主要來源于國外發達國家，以氣相、液相色 譜-質譜以及分光光度計等儀器分析方法為主要手段，這些方法可檢出樣品中的痕量級物 質，檢測限低、靈敏度高，但也存在著檢測周期長、操作煩瑣、成本較高等問題，尤其不適宜 反恐應急化學毒物的現場快速檢測，也無法對化學毒物進行進一步的危害性評估。以往化 學毒物的應急監測多基于理化的方法，罕有以發光菌為研究對象，采用生物毒理學實驗對 化學毒物進行監測的相關報道。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法，克服 了上述現有技術之不足，其能有效解決傳統的氰類毒劑化學毒物檢測方法存在檢測周期 長、操作煩瑣和成本高，已不適宜反恐應急化學毒物的現場快速檢測和對化學毒物進行進 一步危害性評估的問題。
[0007] 本發明的技術方案是通過以下措施來實現的：一種快速判定化學恐怖襲擊毒物中 化學戰劑毒性大小的方法，按下述方法進行：第一步，在污染水源地取污染水6mL作污染 樣，將污染樣分成3份每份2mL分別移入3支具塞磨口比色管中并分別標記為試樣A、試樣 B和試樣C，在裝有試樣A、試樣B和試樣C的3支具塞磨口比色管中分別加入10 μ 1菌液， 加塞上下振蕩5次，去塞計時，精確到秒，15 min后將裝有試樣Α、試樣β和試樣C的3支具 塞磨口比色管分別插入生物毒性測試儀中進行樣品發光強度測試，測試后得到試樣A發光 強度、試樣B發光強度和試樣C發光強度；第二步，取6mL質量百分比濃度為3%的NaCl超 純水溶液作空白對照，將空白對照分成3份每份2mL分別移入3支具塞磨口比色管中并分 別標記為空白樣A、空白樣B和空白樣C，在裝有空白樣A、空白樣B和空白樣C的3支具塞 磨口比色管中分別加入10 μ 1菌液,加塞上下振蕩5次，去塞計時，精確到秒，15 min后將 裝有空白樣A、空白樣B和空白樣C的3支具塞磨口比色管分別插入生物毒性測試儀中進 行空白樣發光強度測試，測試后得到空白樣A發光強度、空白樣B發光強度和空白樣C發光 強度；第三步，將試樣A發光強度與空白樣A發光強度的比值、試樣B發光強度與空白樣B 發光強度的比值、試樣C發光強度與空白樣C發光強度的比值平均后得到相對發光率；第四 步，把相對發光率代入濃度與毒性效應回歸方程Y=96. 73-205. 12X，其中：Y為相對發光率， X為氫氰酸濃度，計算得到X值即為污染樣的氫氰酸濃度。
[0008] 下面是對上述發明技術方案的進一步優化或/和改進： 上述菌液按下述方法得到：在裝有〇. 5g明亮發光桿菌的安瓿瓶中加入lmL質量百分比 濃度為2%的NaCl超純水溶液混勻后，得到菌液。
[0009] 上述超純水為18. 2 ΜΩ · cm的超純水。
[0010] 上述試樣A和空白樣A在生物毒性測試儀的檢測溫度不超過± 1 °C、試樣B和空白 樣B在生物毒性測試儀的檢測溫度不超過± 1 °C、試樣C和空白樣C在生物毒性測試儀的檢 測溫度不超過土 1°C。
[0011] 上述生物毒性測試儀為發光菌毒性測定儀DXY-3型。
[0012] 上述具塞磨口比色管的規格為直徑1. 2cm、高5cm。
[0013] 本發明快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法較傳統的化學毒 物檢測方法大大縮短了檢測周期、簡化了操作，說明本發明快速判定化學恐怖襲擊毒物中 化學戰劑毒性大小的方法檢測周期短、操作過程簡單，大大提高了檢測效率，降低了檢測成 本，適宜于當前反恐應急化學毒物的現場快速檢測和對化學毒物進行進一步危害性評估。
【具體實施方式】
[0014] 本發明不受下述實施例的限制，可根據本發明的技術方案與實際情況來確定具體 的實施方式。
[0015] 實施例1，一種快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法，按下述方 法進行：第一步，在污染水源地取污染水6mL作污染樣，將污染樣分成3份每份2mL分別移 入3支具塞磨口比色管中并分別標記為試樣A、試樣B和試樣C，在裝有試樣A、試樣B和 試樣C的3支具塞磨口比色管中分別加入10 μ 1菌液，加塞上下振蕩5次，去塞計時，精確 到秒，15 min后將裝有試樣Α、試樣Β和試樣C的3支具塞磨口比色管分別插入生物毒性測 試儀中進行樣品發光強度測試，測試后得到試樣A發光強度、試樣B發光強度和試樣C發光 強度；第二步，取6mL質量百分比濃度為3%的NaCl超純水溶液作空白對照，將空白對照分 成3份每份2mL分別移入3支具塞磨口比色管中并分別標記為空白樣A、空白樣B和空白樣 C，在裝有空白樣A、空白樣B和空白樣C的3支具塞磨口比色管中分別加入10 μ 1菌液，力口 塞上下振蕩5次，去塞計時，精確到秒，15 min后將裝有空白樣Α、空白樣Β和空白樣C的3 支具塞磨口比色管分別插入生物毒性測試儀中進行空白樣發光強度測試，測試后得到空白 樣A發光強度、空白樣B發光強度和空白樣C發光強度；第三步，將試樣A發光強度與空白 樣A發光強度的比值、試樣B發光強度與空白樣B發光強度的比值、試樣C發光強度與空白 樣C發光強度的比值平均后得到相對發光率；第四步，把相對發光率代入濃度與毒性效應 回歸方程Y=96. 73-205. 12X，其中：Y為相對發光率，X為氫氰酸濃度，計算得到)(值即為污 染樣的氫氰酸濃度。
[0016] 實施例2,作為上述實施例的優化，實施例2中菌液按下述方法得到：在裝有 〇· 5g明亮發光桿菌的安瓿瓶中加入lmL質量百分比濃度為2%的NaCl超純水溶液混勻后， 得到菌液。這樣，當明亮發光桿菌活性高，處于積極分裂狀態時，細胞ATP含量高，發光強； 休眠細胞ATP含量明顯下降，發光弱；當細胞死亡，ATP立即消失，發光停止；處于活性期的 明亮發光桿菌，當加入毒性物質，菌體就會受抑甚至死亡，體內ATP含量也會隨之降低甚至 消失，發光度便下降甚至到零。
[0017] 實施例3,作為上述實施例的優化，實施例3中超純水為18. 2 ΜΩ . cm的超純水。 超純水可由Mili-Q超純水機制備。
[0018] 實施例4,作為上述實施例的優化，實施例4中試樣A和空白樣A在生物毒性 測試儀的檢測溫度不超過土 l°c、試樣B和空白樣B在生物毒性測試儀的檢測溫度不超過 土 1°C、試樣C和空白樣C在生物毒性測試儀的檢測溫度不超過土 rc。
[0019] 實施例5,作為上述實施例的優化，實施例5中生物毒性測試儀為發光菌毒性測 定儀DXY-3型。
[0020] 實施例6,作為上述實施例的優化，實施例6中具塞磨口比色管的規格為直徑 1. 2cnu高 5cm〇
[0021] 本發明上述實施例中濃度與毒性效應回歸方程按下述方法得到： 1材料與方法 1. 1供試發光細菌明亮發光桿菌（photobacterium phosphoreum)T3變種由中國科 學院南京土壤研究所提供。T3小種凍干粉，安瓿瓶包裝，每瓶0. 5g，在2°C至5°C冰箱內保 存，有效期為6個月，有效期內使用。
[0022] . 2供試化學戰劑選擇毒性強烈的全身中毒性毒劑氫氰酸（hydrogen cyanide， HCN)做為待測化學戰劑。
[0023] · 3化學毒物模型建立待測化學戰劑HCN與對照均采用Mili-Q超純水機制備 的1S. 2 ΜΩ . cm超純水進行溶液制備，保存于4Γ冰箱待用，保存期不超過24h ;實驗對照 組用質量百分比為3%的NaCl超純水溶液，同一批樣品在測定過程中要求溫度波動不超過 ±1°C。實驗儀器為南京土壤研究所生產的發光菌毒性測定儀dxy-3型。所有測試器皿及 試劑、溶液測前lh均置于控溫的測試室內。根據預實驗的結果將HCN標準貯備液分別配制 成0.01，0.05,0· 10,0.2〇,0.30和0.50 mg / L的6個濃度系列，每個濃度設3份平行樣 品。
[0024] . 4毒性測試各吸取2mL氫氰酸溶液于比色管中，用2ml質量百分比濃度為3% 的NaCl超純水溶液作空白對照，迅速吸1〇 μ丨菌液于具塞磨口比色管（直徑L 2 cm，高 5 cm)中，加塞上下振蕩5次，去塞計時，精確到秒，15 min后將比色管插入生物毒性測試儀 中，進行發光強度的檢測（以儀器中光電倍增管受光量子感應后產生的微電流mV為信號， 計量發光量），計算相對發光率（相對發光率=樣品發光強度/對照發光強度X 100%)，取 3次重復測定的平均值。
[0025] . 5統計學處理采用SPSS 17. 0統計軟件對數據進行分析，用EC5(I-15 min值（15 min時發光細菌半數發光抑制濃度）表達樣品毒性，將己知毒物濃度與其相對發光度均 值進行回歸分析，建立相關方程，繪制關系曲線，求各自的一元一次線性回歸方程的a (截 距）、b (斜率）和r (相關系數），列出方程：Y = a+bX，求出相對發光度為50%時所對應毒 物的稀釋濃度，即EQ值。
[0026] 結果 分析化學戰劑氫氰酸的毒性劑量與對明亮發光桿菌的毒性效應關系，結果見表1所 /J、〇
[0027] 氫氰酸屬于劇毒類物質，毒性迅速而劇烈。在本實驗中，氫氰酸對明亮發光桿菌 的劑量-毒性效應實驗結果顯示，樣品發光強度均值變化范圍從最小的0.00 mV (對應 HCN濃度為0· 50 mg/L)到最大的715. 00 mV (對應HCN濃度為0. 01 mg/L)，對照發光強度 均值740. 67至802. 00 mV，而樣品相對發光率隨著毒物濃度的增加而不斷下降，從最高的 95. 50% (對應HCN濃度為0· 01 mg/L)到最低的0. 00% (對應HCN濃度為0. 50 mg/L)。隨著 氫氰酸劑量的不斷增加，明亮發光桿菌的相對發光率不斷降低，提示氫氰酸的毒性強度與 其濃度呈正相關，明亮發光桿菌的相對發光率與氫氰酸的濃度呈負相關。
[0028] 在本實驗中，EC50-15 min值是指使發明亮發光桿菌作用15min時使樣品產生50% 光損失時的污染物濃度，該值越大，說明被研究的物質毒性越低，而該值越小，說明被研究 的物質毒性越強。進一步對氫氰酸的分析發現，其EC50-15 min值為0.23 mg / L，其濃度 與毒性效應回歸方程為Y=96. 73-205. 12X，而相關系數r為-0. 98。
[0029] 實際應用 氫氰酸主要應用于電鍍業(鍍銅、鍍金、鍍銀)、采礦業(提取金銀)、船艙、倉庫的煙熏滅 鼠，制造各種樹脂單體如丙烯酸樹酯、甲基丙烯酸樹酯等行業。氫氰酸是氰化氫（HCN)的水 溶液，外觀為無色液體，有苦杏仁味。按照我國危險化學品的分類及標志（GB 13690-92)將 該物質劃為第6.1類毒害品；劇毒物品分級、分類與品名編號（GA 57-93)中，該物質屬第 一類A級無機劇毒品。
[0030] 為了驗證明亮發光桿菌對氫氰酸毒性大小的判定，本實驗室采用雙盲法進行了實 際應用，步驟如下： 3. 1氫氰酸溶液的配置分別吸取0. 30mL、0. 60mL和0. 12 mL的lOmg / L的HCN標 準貯備液入100 mL容量瓶，采用Mili-Q超純水機制備的18. 2 ΜΩ . cm超純水作為溶劑定 容至100mL，配制成0· 03,0· 06和0. 12mg / L的3個濃度，成為未知濃度的待測樣品，分別 標記為A樣品、B樣品和C樣品。以上操作由一名實驗操作人員完成。
[0031] 樣品毒性測試及濃度計算各吸取2 ml A樣品、B樣品和C樣品于3支具塞磨口 比色管（直徑1.2 cm，高5 cm)中，每個樣品設3份平行。用2ml質量百分比濃度為3% NaCl超純水溶液作空白對照，迅速吸取10μ1菌液于比色管中，加塞上下振蕩5次，去塞 計時，精確到秒，15 min后將比色管插入生物毒性測試儀中，計算相對發光率，取3個平行 的平均值作為最終計算結果。
[0032] 按照前期濃度與毒性效應回歸方程為Y=96. 73-205. 12X，其中X代表氫氰酸濃度， Υ代表該氫氰酸濃度下的相對發光率（％);計算過程是通過Υ求得X ;Υ :相對發光率（％)=樣 品發光強度/對照發光強度X100°/。是已知的，通過將已知的γ值帶入上述毒性效應回歸方 程，求得X。以上操作由另一名實驗操作人員完成。
[0033] 結果 Α樣品、Β樣品和C樣品通過回歸方程推算樣品濃度的驗證結果如表2所示。
[0034] 從上述結果可知，按照前期濃度與毒性效應回歸方程為Y=96. 73-205. 12X，實際配 置Α樣品、Β樣品和C樣品的濃度0_03mg / L、0_06mg / L和0. 12mg / L與通過明亮發光 桿菌方法推算出的樣品濃度完全一致，說明該方法具有很好的推廣價值。
[0035] 傳統生活飲用水中氰化物檢測方法根據GB/T 5750.5-2006《生活飲用水標準檢 驗方法》異煙酸-吡唑酮分光光度法；其原理是用氯胺T將氰化物轉變為氯化氰，再與異 煙酸一吡唑酮作用，生成藍色染料，比色定量；所用試劑主要包括酒石酸、乙酸鋅、氫氧化鈉 溶液、磷酸鹽緩沖溶液、磷酸氫二鈉、異煙酸、吡唑酮、N-二甲基甲酞胺、氯胺T、硝酸銀、氰 化鉀、試銀靈、丙酮、甲基橙等12種試劑；主要儀器包括500mL全玻璃蒸餾器、25mL和50mL 具塞比色管、恒溫水浴鍋、分光光度計、電爐等；實驗步驟主要包括量取樣品、蒸餾、測量吸 光度等5步化學反應；根據氰化物標準使用溶液計算標準曲線，然后從曲線上查出樣品管 中氰化物質量；檢測時間為4h至5h，所用試劑以及儀器種類較多，操作過程煩瑣。生活飲 用水中氰化物檢測方法詳見GBT 5750.5-2006生活飲用水標準檢驗方法，無機非金屬指 標.pdf 第 19-21 頁。
[0036] 本發明從污染水源地檢測出污染樣的氫氰酸濃度的時間僅為13分鐘至17分鐘， 且本發明快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法中所用試劑為明亮發光 桿菌和NaCl超純水溶液，操作步驟簡單。
[0037] 綜上所述，本發明快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法較傳統 的化學毒物檢測方法大大縮短了檢測周期、簡化了操作，說明本發明快速判定化學恐怖襲 擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法檢測周期短、操作過程簡單，大大提高了檢測效率，降低 了檢測成本，適宜于當前反恐應急化學毒物的現場快速檢測和對化學毒物進行進一步危害 性評估。
[0038]以上技術特征構成了本發明的實施例，其具有較強的適應性和實施效果，可根據 實際需要增減非必要的技術特征，來滿足不同情況的需求。
[0039] 表1氫氰酸對明亮發光桿菌的劑量-毒性效應
【權利要求】
1. 一種快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法，其特征在于按下述方 法進行：第一步，在污染水源地取污染水6mL作污染樣，將污染樣分成3份每份2mL分別移 入3支具塞磨口比色管中并分別標記為試樣A、試樣B和試樣C,在裝有試樣A、試樣B和 試樣C的3支具塞磨口比色管中分別加入10 μ 1菌液，加塞上下振蕩5次，去塞計時，精確 到秒，15 min后將裝有試樣Α、試樣Β和試樣C的3支具塞磨口比色管分別插入生物毒性測 試儀中進行樣品發光強度測試，測試后得到試樣A發光強度、試樣B發光強度和試樣C發光 強度；第二步，取6mL質量百分比濃度為3%的NaCl超純水溶液作空白對照，將空白對照分 成3份每份2mL分別移入3支具塞磨口比色管中并分別標記為空白樣A、空白樣B和空白樣 C，在裝有空白樣A、空白樣B和空白樣C的3支具塞磨口比色管中分別加入10 μ 1菌液，力口 塞上下振蕩5次，去塞計時，精確到秒，15 min后將裝有空白樣Α、空白樣Β和空白樣C的3 支具塞磨口比色管分別插入生物毒性測試儀中進行空白樣發光強度測試，測試后得到空白 樣A發光強度、空白樣B發光強度和空白樣C發光強度；第三步，將試樣A發光強度與空白 樣A發光強度的比值、試樣B發光強度與空白樣B發光強度的比值、試樣C發光強度與空白 樣C發光強度的比值平均后得到相對發光率；第四步，把相對發光率代入濃度與毒性效應 回歸方程Y=96. 73-205. 12X，其中：Y為相對發光率，X為氫氰酸濃度，計算得到X值即為污 染樣的氫氰酸濃度。
2. 根據權利要求1所述的快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法，其 特征在于菌液按下述方法得到：在裝有0. 5g明亮發光桿菌的安瓿瓶中加入lmL質量百分比 濃度為2%的NaCl超純水溶液混勻后，得到菌液。
3. 根據權利要求2所述的快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法，其 特征在于菌液按下述方法得到：在裝有0. 5g明亮發光桿菌的安瓿瓶中加入lmL質量百分比 濃度為2%的NaCl超純水溶液混勻后，得到菌液。
4. 根據權利要求3所述的快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法，其 特征在于超純水為18. 2 ΜΩ . cm的超純水。
5. 根據權利要求1或2或3或4所述的快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大 小的方法，其特征在于試樣A和空白樣A在生物毒性測試儀的檢測溫度不超過± 1 °C、試樣 B和空白樣B在生物毒性測試儀的檢測溫度不超過± 1°C、試樣C和空白樣C在生物毒性測 試儀的檢測溫度不超過±1°C。
6. 根據權利要求1或2或3或4所述的快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大 小的方法，其特征在于生物毒性測試儀為發光菌毒性測定儀DXY-3型。
7. 根據權利要求5所述的快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法，其 特征在于生物毒性測試儀為發光菌毒性測定儀DXY-3型。
8. 根據權利要求1或2或3或4所述的快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大 小的方法，其特征在于具塞磨口比色管的規格為直徑1. 2cm、高5cm。
9. 根據權利要求5所述的快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法，其 特征在于具塞磨口比色管的規格為直徑1. 2cm、高5cm。
10. 根據權利要求7所述的快速判定化學恐怖襲擊毒物中化學戰劑毒性大小的方法， 其特征在于具塞磨口比色管的規格為直徑1. 2cm、高5cm。
【文檔編號】G01N21/76GK104297228SQ201410440659
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月1日 優先權日:2014年9月1日
【發明者】王君, 張建江, 賈繼民, 田華, 馬永紅, 劉健, 王新建 申請人:烏魯木齊市疾病預防控制中心, 中國人民解放軍新疆軍區疾病預防控制中心
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