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一種檢測受實驗者體液體外促進疾病相關蛋白磷酸化修飾能力的方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測受試者體液體外促進磷酸化修飾的疾病相關蛋白形成能力的方法。更具體地說，涉及一種檢測受試者體液體外促進磷酸化修飾的疾病相關蛋白如α-突觸核蛋白形成能力的方法。該方法包括將純化的重組人疾病相關蛋白與受試者體液在一定溫度下進行振蕩孵育，然后利用能夠檢測磷酸化修飾蛋白質的方法檢測孵育后的體液中磷酸化修飾的疾病相關蛋白如α-突觸核蛋白的含量。
【專利說明】一種檢測受實驗者體液體外促進疾病相關蛋白磷酸化修飾能力的方法
【技術領域】:
[0001]本發明涉及一種檢測受試者體液體外促進磷酸化修飾的疾病相關蛋白形成能力的方法，該方法可用于帕金森病的診斷。
【背景技術】:
[0002]帕金森病是一種常見的神經系統退行性疾病，臨床上主要表現為靜止振顫、運動遲緩、肌肉僵直和姿勢不穩定等運動癥狀(1，2)。引起這些癥狀的原因是中腦黑質多巴胺神經元大量死亡和由此引起的紋狀體部位的多巴胺神經遞質的大幅度減少。帕金森病的主要病理特征是神經細胞內出現嗜酸性包涵體一路易體(Lewy body)和路易神經索(Lewyneurite)。構成路易體和路易神經索的主要成分是α-突觸核蛋白(a-synuclein) (3)。其中，約90%的α-突觸核蛋白為磷酸化修飾形式(4)。大量研究表明，磷酸化修飾可促進α-突觸核蛋白的聚合，從而在帕金森病的發生和發展中起關鍵性作用(5-9)。因此，檢測磷酸化α-突觸核蛋白在體液中的變化被認為對帕金森病具有診斷意義。目前研究表明，帕金森病人血液中磷酸化α-突觸核蛋白含量增高，而總α-突觸核蛋白及寡聚化α-突觸核蛋白則無此改變(7，10)。因此，磷酸化α-突觸核蛋白可能成為一種帕金森病診斷的潛在標記物。然而，由于檢測技術的限制，血液中磷酸化α-突觸核蛋白檢測的靈敏度及特異度較低。
[0003]現有技術中對血液中磷酸化α -突觸核蛋白檢測方法主要有:利用ELISA方法直接檢測其含量。
[0004]現有方法的缺陷是:患者和對照的差異較小，很多數據重疊，難以用于臨床。本方法的優勢:數據穩定，患者和對照差異較大；主要反映血漿促進α -突觸核蛋白磷酸化的能力。
[0005]為克服上述缺陷，本發明提供一種檢測受試者體液體外促進磷酸化修飾的疾病相關蛋白形成的方法，該方法具有較好的穩定性和重復性，可以顯著區分帕金森病人和正常健康人，是帕金森病高危人群篩選、臨床診斷及病情監測的重要手段。

【發明內容】
:
[0006]本發明提供一種帕金森病的診斷方法，其中包括檢測受試者體液體外促進磷酸化修飾的疾病相關蛋白如α-突觸核蛋白形成能力的方法。
[0007]本發明將純化的重組人疾病相關蛋白與受試者體液在一定溫度下進行振蕩孵育，然后利用鼠抗人磷酸化-α-突觸核蛋白單克隆抗體作為捕獲抗體，利用生物素化的鼠抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體作為檢測抗體，利用抗原-抗體反應原理檢測帕金森病人和正常健康人體液體外促進疾病相關蛋白磷酸化修飾形式的形成能力并進行比較。
[0008]本發明檢測受試者體液體外促進磷酸化修飾的疾病相關蛋白如檢測α -突觸核蛋白形成能力的方法包括以下步驟和內容:[0009]I)分離血漿；
[0010]2)加入重組人α -突觸核蛋白，得到磷酸化α -突觸核蛋白；
[0011]3)抗人磷酸化-α-突觸核蛋白單克隆抗體和磷酸化α-突觸核蛋白以及抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體孵育，隨后加入堿性磷酸酶和顯色劑，進行顯色；
[0012]4)用分光光度法對顯色的樣品進行吸光度測定，根據標準曲線計算樣品中磷酸化α-突觸核蛋白的含量。
[0013]以下對本發明所用名稱術語進行解釋:
[0014]重組人α -突觸核蛋白:將攜帶人α -突觸核蛋白基因的質粒轉染至大腸桿菌，培養、提取并純化獲得的帕金森病相關蛋白。
[0015]磷酸化α -突觸核蛋白:129位絲氨酸發生磷酸化修飾的α -突觸核蛋白。
[0016]抗人磷酸化-α-突觸核蛋白單克隆抗體:抗原為含129位磷酸化修飾的絲氨酸在內的人α-突觸核蛋白短肽，其氨基酸序列為GILEDMPVDTONEAYEMPSEEGYQDYEPEA，與靈長類動物發生反應。本發明使用的抗人磷酸化-α-突觸核蛋白單克隆抗體名稱為:4Ε6抗體,為已知抗體,是Santa cruz公司所售的p-a-synuclein (Ser129)抗體(貨號:sc-135638)。
[0017]抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體:3D5抗體，識別α -突觸核蛋白第115_121個氨基酸，抗原為人重組α-突觸核蛋白，與靈長類動物發生反應。(該抗體已經公開，在
S.Yu, et al.Neuroscience, 145 (2007) 539-555中已經發表,可通過購買得到)。也可以按照以下方法制備:
[0018]步驟1，蛋白抗原的制備:本實驗室制備并純化人全長α -突觸核蛋白作為抗原。
[0019]步驟2，免疫小鼠；使用福氏完全佐劑(第一次免疫)與福氏不完全佐劑(隨后的免疫)乳化人α-突觸核蛋白，每隔2周對BALB/c雌性小鼠進行免疫(50mg抗原/只小鼠)。抽取動物血清，利用ELISA與Western blot方法檢測其效價與特異性。
[0020]步驟3，用3D5雜交瘤細胞(可購買得到)產生特性性抗體。3D5雜交瘤細胞可以產生特異性抗人α-突觸核蛋白抗體。
[0021]步驟4 ;抗體制備:3D5細胞大量擴增，并由腹膜內注射入BALB/c裸鼠體內，產生腹水，后利用protein A親和層析純化,得到3D5抗體。
[0022]堿性磷酸酶:在ELISA測定中，堿性磷酸酶的色原底物是對硝基苯磷酸鹽(p-nitropheny-phosate, ρΝΡΡ)。ρΝΡΡ在堿性磷酸酶的作用下生成對硝基酹(pNP),其在入=405nm處有最大吸收。
[0023]親和素標記的堿性磷酸酶:將堿性磷酸酶進行親和素標記，親和素可與生物素結合，起級聯放大作用。
[0024]顯色劑:硝基苯磷酸單鈉鹽，可簡稱為ρΝΡΡ單鈉。與ρΝΡΡ —樣，用于ELISA的化學顯色底物。堿性磷酸酶和PNPP反應后，形成黃色水溶反應產物，該產物在405nm處有光吸光。
[0025]ELISA 酶標板:在酶聯免疫吸附試驗(Enzyme Linked ImmunosorbentAssay, ELISA)中，作為載體的固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面對抗原、抗體或抗原抗體復合物的吸附起重要作用。抗原、抗體和其它生物分子通過多種機制吸附至載體表面，這包括通過疏水鍵、流水/離子鍵的被動吸附，通過引入其它活性基團如氨基和碳基的共價結合，以及通過表面改性后的親水鍵結合。
[0026]PBS:憐酸緩沖液(phosphate buffer solution),濃度為 0.01mol/L。
[0027]NaHCO3緩沖液:碳酸氫鈉緩沖液，濃度為200mmol/L，PH9.6。
[0028]封閉液:明膠含量為2.5%的PBST溶液，作用為封閉非特異結合，降低ELISA背
旦
-5^ O
[0029]PBST:在0.01mol/L PBS中含有0.05% Tween20即為磷酸鹽吐溫緩沖液，PBST。
[0030]標準曲線的制作方法如下:每次試驗時將磷酸化α -突觸核蛋白肽段進行系列稀釋，終濃度分別為0.5,0.25,0.125,0.0625,0.03125、0 μ mol/L，與樣品同時進行檢測，讀取相對應405nm處吸光值，做出其與濃度之間的關系曲線。
[0031]生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體3D5，其制備方法如下:
[0032]步驟I，用無水DMSO配制10mg/ml生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。
[0033]步驟2，用硼酸鹽緩沖液(0.lmol/L, pH8.8)配制濃度至少為I~3mg/ml的抗體3D5溶液，若抗體儲存時加入了疊氮鈉，則標記前須先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉。 [0034]步驟3，按25~100 μ g/mg的比率將生物素酯加入抗體3D5中，混合均勻并在室溫下孵育4h。
[0035]步驟4，每250 μ g生物素酯內加入20 μ I lmol/L的氯化銨，室溫孵育lOmin。
[0036]步驟5，將抗體3D5溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結合的生物素。
[0037]步驟6，按純化抗體3D5的儲存方法保存標記抗體3D5。
[0038]優選的本發明的檢測α -突觸核蛋白形成能力的方法，步驟如下:
[0039]步驟1，
[0040]取靜脈血，必要時可以加入EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝，分離血漿層備用；
[0041]步驟2，
[0042]血漿中加入重組人α -突觸核蛋白，得到磷酸化α -突觸核蛋白；
[0043]步驟3，
[0044]ELISA酶標板中加入抗人磷酸化-α -突觸核蛋白單克隆抗體和磷酸化α -突觸核蛋白，以及抗人_α -突觸核蛋白單克隆抗體進行孵育，加入親和素標記的堿性磷酸酶，對硝基酚磷酸顯色液；
[0045]步驟4，
[0046]在405nm處測定酶標板各孔的吸光度值，根據標準曲線計算磷酸化_ α -突觸核蛋
白的含量。
[0047]特別優選的本發明的檢測α -突觸核蛋白形成能力的方法，步驟如下:
[0048]步驟1，
[0049]血漿的分離:
[0050]抽取5-10ml抗凝血(EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝)。將抗凝血上下顛倒輕輕混勻，貼壁加入至50ml離心管中，記錄全血的體積，1:1加入PBS，充分混勻。
[0051]將稀釋后的全血緩慢加至淋巴細胞分離液上，400Xg，離心20min。此時管內液體由上至下的順序依次為血漿層、白膜層(外周血單個核細胞)、分離液層以及紅細胞層。
[0052]吸取表面的血漿層、分裝，_80°C保存備用。[0053]步驟2，
[0054]磷酸化α -突觸核蛋白的體外制備:將血漿用PBS適當稀釋，加入一定濃度的重組人α-突觸核蛋白，在恒溫振蕩器中37°C振蕩孵育一定時間，于4°C保存備用。
[0055]步驟3，
[0056]包被:用NaHCO3緩沖液稀釋抗人磷酸化-α -突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度為
0.1?I μ g/mL。向酶標板各孔加入100 μ L該抗體稀釋液，4°C孵育過夜。用PBST (其為含有吐溫的PBS)沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0057]封閉:向酶標板各孔加入100 μ L封閉液(其為含有明膠和吐溫的PBS)，在37°C孵育I?2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0058]向各孔加入100 μ L已制備好的磷酸化α -突觸核蛋白樣品稀釋液，在37°C孵育I?2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0059]用封閉液稀釋生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體3D5抗體至終濃度為
0.1?I μ g/mL。向酶標板的各孔加入100 μ L該抗體稀釋液，在37°C孵育I?2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0060]用封閉液稀釋親和素標記的堿性磷酸酶(由Sigma公司出售)，向酶標板的各孔加AlOOyL該酶的稀釋液，在37°C孵育0.5?2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0061]向酶標板的各孔加入100 μ L ρΝΡΡ (對硝基酹磷酸顯色液，由Sigma公司出售)，37°C顯色10?50分鐘。
[0062]步驟4，
[0063]測定405nm處酶標板各孔的吸光度值。
[0064]根據磷酸化α -突觸核蛋白標準品濃度與405nm處吸光值之間的關系曲線計算受試者血液中磷酸化α-突觸核蛋白的形成量。
[0065]本發明經過研究發現，上述方法與現有技術相比具有如下優點:
[0066]診斷準確性提高；
[0067]診斷靈敏度及特異度提高。
[0068]以下通過比較證明本發明的優點:
[0069]Foulds PG等人2011年的一篇文獻報導血漿中自身磷酸化α -突觸核蛋白含量可作為帕金森病診斷標記物，該方法ROC曲線下面積為0.68 ；Foulds PG等人2013年另一篇關于血漿中自身磷酸化α-突觸核蛋白含量的縱向研究報導，該方法ROC曲線下面積為
0.717。而本發明ROC曲線下面積可達0.901，診斷準確性明顯高于前者。
[0070]根據以上文獻報導中的ROC曲線可得出其大致靈敏度及特異度，分別為0.6及
0.75。而本方法靈敏度及特異度分別為0.795及0.886，可見本方法靈敏度及特異度均有提聞。
[0071]由于本發明效果的優越性，本發明人根據上述方法制備了一種檢測試劑盒，所述試劑盒包括以下試劑:
[0072]重組人α-突觸核蛋白
[0073]抗人磷酸化-α -突觸核蛋白單克隆抗體
[0074]生物素化抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體[0075]根據需要，所述試劑盒還可包括以下輔助試劑:
[0076]堿性磷酸酶，或親和素標記的堿性磷酸酶
[0077]對硝基酚磷酸顯色液
[0078]ELISA 酶標板
[0079]PBS
[0080]NaHCO3 緩沖液
[0081]封閉液
[0082]PBST
[0083]其中，
[0084]PBS的濃度為0.01mol/L,配制方法為 [0085]
Na3HPCK2.72 g
NaH2PCM0.28 g
NaCI9 g
DDWI 000 ml
[0086]NaHCO3緩沖液的濃度為200mmol/L，pH9.6，配制方法為
[0087]NaHCO30.84g
[0088]20% 疊氮鈉(NaN3) 50 μ I
[0089]DDff50ml
[0090]封閉液的濃度為2.5%，配制方法為
[0091]明膠2.5g
[0092]PBST100mL
[0093]PBST 為含 0.05% Tween20 的 0.0ImoI/L PBS，配制方法為
[0094]
Na2HPO42.72 g
NaH3PO40.28 g
NaCl9 g
DDW1000 ml
Twccn 20500 μL
[0095]上述試劑盒的使用是以血漿中磷酸化-α-突觸核蛋白作為標準蛋白，以磷酸化-α-突觸核蛋白與吸光度值的關系曲線作為標準曲線，通過測定樣本中的磷酸化- α -突觸核蛋白的濃度以及形成率達到診斷帕金森病的目的。
[0096]本發明的試劑盒，各試劑分別包裝，優選使用包裝管，每個包裝管中裝入試劑的量以夠一個樣本使用量為基本量，可以擴大到10個，100個，1000個樣本的使用量。
[0097]本發明的試劑盒的使用是根據上述檢測血漿中磷酸化-α-突觸核蛋白的方法進行的，使用時將試劑盒中的試劑根據需要配制成相應的濃度，按照所述方法測定即可。
[0098]為研究本發明，還進行了以下重復性試驗，精密度試驗，檢測方法的篩選等試驗[0099] 相同樣本重復實驗3次，結果顯示相對標準差RSD為0.60%。
[0100]將實施例3中制備的試劑盒分別取三批進行精密度實驗。以實施例3中所抽取的試劑盒測定三份高、中、低值樣本0.5ymol/L、0.125 μ mol/L和0.03125 μ mol/L各8次。計算測定濃度的變異系數。實施例3中的三批試劑盒的結果表明變異系數小于8.0%。
[0101]采用棋盤滴定試驗確定抗體包被濃度以及生物素化抗體濃度。根據初步確定的濃度縮小間距，再做進一步棋盤滴定，確定最佳試驗條件。最終確定包被濃度為0.1~I μ g/mL,生物素化抗體濃度為0.1~I μ g/mL。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0102]圖1為紅細胞分離過程中，不同成分分層示意圖。
[0103]圖2為92例對照與H)患者血漿中磷酸化a -Syn形成量的ELISA檢測結果。【具體實施方式】:
[0104]以下通過實施例進一步說明本發明。
[0105]實施例1，
[0106]具體步驟如下:
[0107](1)血漿的分離:
[0108].抽取5-10ml抗凝血(EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝)。將抗凝血上下顛倒輕輕混勻，貼壁加入至50ml離心管中，記錄全血的體積，1:1加入PBS，充分混勻。
[0109]?將稀釋后的全血緩慢加至淋巴細胞分離液上，400Xg，離心20min。此時管內液體由上至下的順序依次為血漿層、白膜層(外周血單個核細胞)、分離液層以及紅細胞層。
[0110].吸取表面的血漿層、分裝，-80°C保存備用。
[0111](2)磷酸化α -突觸核蛋白的體外制備:將血漿用PBS適當稀釋，加入一定濃度的重組人α-突觸核蛋白，在恒溫振蕩器中37°C振蕩孵育一定時間，于4°C保存備用。
[0112](3)包被:用NaHCOj^沖液稀釋抗人磷酸化-α -突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度為0.1~I μ g/mL。向酶標板各孔加入100 μ L該抗體稀釋液，4°C孵育過夜。用PBST (其為含有吐溫的PBS)沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0113](4)封閉:向酶標板各孔加入100 μ L封閉液(其為含有明膠和吐溫的PBS)，在37°C孵育I~2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0114](5)向各孔加入100 μ L已制備好的磷酸化α -突觸核蛋白樣品稀釋液，在37 V孵育I~2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0115](6)用封閉液稀釋生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體3D5抗體至終濃度為0.1~I μ g/mL。向酶標板的各孔加入100 μ L該抗體稀釋液，在37°C孵育I~2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0116](7)用封閉液稀釋親和素標記的堿性磷酸酶(由Sigma公司出售)，向酶標板的各孔加入100 μ L該酶的稀釋液，在37°C孵育0.5~2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。
[0117](8)向酶標板的各孔加入100 μ LpNPP(對硝基酚磷酸顯色液，由Sigma公司出售)，37°C顯色10~50分鐘。[0118](9)測定405nm處酶標板各孔的吸光度值。
[0119](10)根據磷酸化α -突觸核蛋白標準品濃度與405nm處吸光值之間的關系曲線計算受試者血液中磷酸化α-突觸核蛋白的形成量。
[0120]實施例2，
[0121 ] 血漿促進α -突觸核蛋白磷酸化修飾的能力的檢測
[0122]采用相對定量ELISA法，對44例臨床診斷的帕金森病人和44例健康對照血漿促進α-突觸核蛋白磷酸化修飾的能力進行了檢測。結果顯示帕金森病人血漿中磷酸化α -突觸核蛋白形成量為68.2 μ mol/L ;而正常健康對照血漿中磷酸化α -突觸核蛋白形成量為41.6 μ mol/L。帕森病人血漿中磷酸化α -突觸核蛋白形成量明顯高于正常健康對照(P < 0.01)。
[0123]實施例3，
[0124]試劑盒成分舉例
[0125]重組人α -突觸核蛋白，IOmg
[0126]抗人磷酸化-α-突觸核蛋白單克隆抗體IOyg
[0127]生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體10 μ g
[0128]堿性磷酸酶，或親和素標記的堿性磷酸酶5 μ I
[0129]對硝基酚磷酸顯色液IOml
[0130]ELISA 酶標板
[0131]PBSlOml
[0132]NaHCO3 緩沖液 IOml
[0133]封閉液20ml
[0134]PBST500ml
[0135]以下為參考文件:
[0136]Reference List
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【權利要求】
1.一種用于檢測磷酸化修飾的α-突觸核蛋白含量的試劑盒，試劑盒中包括以下試劑:重組人α -突觸核蛋白，抗人磷酸化-α -突觸核蛋白單克隆抗體，抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體或生物素化的抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，根據需要，所述試劑盒還可包括以下輔助試劑: 堿性磷酸酶，或親和素標記的堿性磷酸酶 對硝基酚磷酸顯色液 ELISA酶標板 PBS NaHCO3緩沖液 封閉液 PBST。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其中 PBS 的濃度為 0.01mol/L, NaHCO3 緩沖液的濃度為 200mmol/L，pH9.6， 封閉液的濃度為2.5%，
PBST 為含 0.05% Tween-20 的 0.01M PBS。
4.根據權利要求2所述的試劑盒，其中各試劑分別包裝，每個包裝裝入試劑的量以夠一個樣本使用量為基本量，可以擴大到10個，100個，1000個樣本的使用量。
5.根據權利要求1所述的試劑盒，其中抗人磷酸化α-突觸核蛋白單克隆抗體為4E6抗體。
6.根據權利要求1所述的試劑盒，所述抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體為3D5抗體。
7.生物素化的抗人α-突觸核蛋白單克隆抗體3D5，其制備方法如下: 步驟1，用無水DMSO配制10mg/ml生物素N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液。 步驟2，用0.lmol/L, pH8.8硼酸鹽緩沖液配制濃度為I~3mg/ml的抗體3D5溶液，若抗體儲存時加入了疊氮鈉，則標記前須先在硼酸鹽緩沖液中充分透析以除去疊氮鈉。 步驟3，按25~100 μ g/mg的比率將生物素酯加入抗體3D5中，混合均勻并在室溫下孵育4h。 步驟4，每250 μ g生物素酯內加入20 μ I lmol/L的氯化銨，室溫孵育lOmin。 步驟5，將抗體3D5溶液用PBS或其他所需的緩沖液透析，以除去未結合的生物素。 步驟6，按純化抗體3D5的儲存方法保存標記抗體3D5。
8.一種用權利要求1的試劑盒檢測磷酸化α-突觸核蛋白含量的方法，包括以下步驟: (1)分離血漿； (2)加入重組人α-突觸核蛋白，得到磷酸化α-突觸核蛋白； (3)抗人磷酸化-α -突觸核蛋白單克隆抗體和磷酸化α -突觸核蛋白以及抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體孵育，隨后加入堿性磷酸酶和顯色劑，進行顯色； (4)用分光光度法對顯色的樣品進行吸光度測定，根據標準曲線計算樣品中磷酸化α-突觸核蛋白的含量。
9.根據權利要求8所述的方法，步驟如下:步驟1， 取靜脈血，必要時可以加入EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝，分離血漿層備用； 步驟2， 血漿中加入重組人α -突觸核蛋白，得到磷酸化α -突觸核蛋白； 步驟3， ELISA酶標板中加入抗人磷酸化- α -突觸核蛋白單克隆抗體和磷酸化α -突觸核蛋白，以及抗人_α -突觸核蛋白單克隆抗體進行孵育，加入親和素標記的堿性磷酸酶，對硝基酚磷酸顯色液； 步驟4， 在405nm處測定酶標板各孔的吸光度值，根據標準曲線計算磷酸化_ α _突觸核蛋白的含量。
10.根據權利要求9所述的方法，步驟如下: 步驟1， 血漿的分離: 抽取5-10ml抗凝血(EDTA、肝素或枸櫞酸抗凝)。將抗凝血上下顛倒輕輕混勻，貼壁加入至50ml離心管中，記錄全血的體積，1:1加入PBS,充分混勻。 將稀釋后的全血緩慢加至淋巴細胞分離液上，400Xg，離心20min。此時管內液體由上至下的順序依次為血漿層、白膜層(外周血單個核細胞)、分離液層以及紅細胞層。 吸取表面的血漿層、分裝，_80°C保存備用。 步驟2， 磷酸化α-突觸核蛋白的體外制備:將血漿用PBS適當稀釋，加入一定濃度的重組人α-突觸核蛋白，在恒溫振蕩器中37°C振蕩孵育一定時間，于4°C保存備用。 步驟3， 包被:用NaHCOj^沖液稀釋抗人磷酸化-α -突觸核蛋白單克隆抗體至終濃度為0.1~I μ g/mL。向酶標板各孔加入100 μ L該抗體稀釋液，4°C孵育過夜。用PBST (其為含有吐溫的PBS)沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。 封閉:向酶標板各孔加入100 μ L封閉液(其為含有明膠和吐溫的PBS)，在37°C孵育I~2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。 向各孔加入100 μ L已制備好的磷酸化α -突觸核蛋白樣品稀釋液，在37°C孵育I~2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。 用封閉液稀釋生物素化的抗人α -突觸核蛋白單克隆抗體3D5抗體至終濃度為0.1~I μ g/mL。向酶標板的各孔加入100 μ L該抗體稀釋液，在37°C孵育I~2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。 用封閉液稀釋親和素標記的堿性磷酸酶，向酶標板的各孔加入100 μ L該酶的稀釋液，在37°C孵育0.5~2小時。用PBST沖洗酶標板各孔，根據需要確定沖洗次數和時間。 向酶標板的各孔加入100 μ L ρΝΡΡ (對硝基酚磷酸顯色液)，37°C顯色10~50分鐘。 步驟4， 測定405nm處酶標板各孔的吸光度值。 根據磷酸化α -突觸核蛋白標準品濃度與405nm處吸光值之間的關系曲線計算受試者血液中磷 酸化α-突觸核蛋白的形成量。
【文檔編號】G01N33/577GK103954763SQ201410193762
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年5月8日 優先權日:2014年5月8日
【發明者】于順, 尹娜, 楊巍巍, 李昕 申請人:首都醫科大學宣武醫院