一種補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法
【專利摘要】本發明公開一種補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，包括菌懸液的制備及樣品處理、殺菌檢測和顯色判定，當陽性血清對照組為陽性結果，陰性血清對照組、補體空白對照組和細菌活性對照組均為陰性結果時，待檢血清顯色或出現針尖狀沉淀為陰性結果，即不具有殺菌活性；待檢血清不顯色或出現片狀沉淀為陽性結果，即具有殺菌活性。本發明方法無需采用肉眼逐一進行活菌計數，僅通過顯色或不顯色就可直觀、快速地判定待檢血清是否具有殺菌活性，每塊微孔板同時設立各照為檢測結果成立的條件，其檢測步驟簡便、快速、可靠準確。
【專利說明】
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細菌性疫苗免疫動物或者健康人群后，產生的血清抗體具有功能性殺 菌或抑菌活性評價【技術領域】。 一種補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法 技術背景
[0002] 血清抗體殺菌力檢測，可以衡量一個特定物種的免疫球蛋白的功能特性。血清抗 體殺菌力檢測依賴抗體識別條件，通過經典途徑激活，使表面暴露的抗原與補體、抗體結 合，導致抑菌或溶菌。現有的血清抗體殺菌力檢測，其步驟及結果判定方法復雜，特別是需 要人的肉眼直接進行活菌計數，誤差較大，試驗耗時長，且適用范圍有限。以下以流腦血清 抗體殺菌力試驗為例說明其現有血清抗體殺菌力檢測方法具體操作：
[0003] 1、菌懸液制備
[0004] 啟開菌種，于固體培養基上復蘇培養后，接種于液體培養基中擴增培養。菌液稀釋 制成均勻的菌懸液。取菌懸液于波長為540nm的分光光度計上測其光密度值，再稀釋至所 需的最終濃度（例如：4000個菌落形成單位/毫升）。
[0005] 2、殺菌抗體檢測 [0006] 2. 1待檢血清稀釋
[0007] 先在微孔板每孔內加25 μ 1稀釋液。用移液器從每排第一孔內加25 μ 1經56°C、 30min滅活的待檢血清，吹吸5?10次后吸出25 μ 1至下一孔，如此作連續倍比稀釋至最后 一孔。
[0008] 2. 2殺菌反應
[0009] 每孔中加入12. 5μ 1補體，再加入稀釋好的菌懸液12. 5μ 1，振蕩器上中速振蕩5 分鐘后，于37 °C培養25分鐘，再振蕩5分鐘。
[0010] 2. 3殺菌后顯色培養
[0011] 每孔加 50μ 1已熔化冷至45°C左右的TTC瓊脂后，微孔板置37°C條件培養15? 20小時后觀察結果。
[0012] 3、結果判定
[0013] 3.1對照設置
[0014] 陽性參考血清對照；4孔補體對照（稀釋液、補體、菌液各一滴，檢查補體自然殺菌 活性）；4孔細菌生長對照（稀釋液、滅活補體和靶菌菌液各12. 5 μ 1)。每次檢測時至少每 5塊微孔板中應有一組上述三種對照試驗。
[0015] 3. 2活菌計數判定結果
[0016] 3· 2· 1菌懸液空白對照檢驗
[0017] 各孔滴完菌懸液之后，將該菌懸液兩滴分別滴加到一個瓊脂平皿的一端，沿著劃 好的兩條線傾斜下流，于37°C與微孔板同時培養，次日檢查每滴菌懸液的菌落數及其純度。
[0018] 3. 2. 2檢查三種對照設置的結果：
[0019] 補體的和細菌生長對照的各孔應出現眾多的紅色點狀小菌落；陽性參考血清應達 到原來確定的殺菌滴度。若所試各孔中紅色點狀菌落數目明顯地少于補體對照孔或不出現 紅色點狀菌落時，則判斷為殺菌陽性；如果所試孔中的菌落數目接近補體對照孔的一半或 更多時，則判斷為殺菌陰性。
[0020] 3. 2. 3殺菌結果判定標準
[0021] 通過人的肉眼觀察并一個一個逐一地計算菌落個數（活菌計數），根據紅色點狀 菌落數目的多少，以符號" + "記錄試驗結果。若補體及靶菌生長對照各孔的細菌正常生長 時，應出現眾多紅色點狀菌落，可記為"++++"。當所試各孔與其比較，菌落數減少30%以 下，記為"+++";減少50%左右記為減少70%左右記為" + " ;每孔少于10個菌落則記 為"土"。以細菌生長成呈" + "及以下者判斷為殺菌陽性；以"++"及以上者判為殺菌陰性。 以出現殺菌陽性的血清最高稀釋度為殺菌抗體的最高滴度。
[0022] 因此，現有血清抗體殺菌力檢測結果判定需通過肉眼觀察計數菌落的活菌計數的 方式，獲得待檢血清組及生長對照組的活菌數并進行比較，若待檢血清組活菌數相對于生 長對照組減少70%則判為陽性。由于微孔板上視野差，肉眼觀察計數菌落錯誤率高，經常出 現漏計或重復計數的情況，結果誤差較大，工作量大、繁瑣復雜。若菌懸液濃度過高，菌落在 微小的孔內密集生長呈片狀菌苔，觀察不到單一的菌落，導致無法對殺菌檢測結果予以判 定。
【發明內容】
[0023] 本發明要解決的技術問題是克服現有血清抗體殺菌力檢測方法存在需通過肉眼 觀察計數菌落，經常出現漏計或重復計數的情況，計數錯誤率高，結果誤差較大，工作量大、 繁瑣復雜的缺陷。其目的是開發一種步驟簡單，結果直觀易于分辨，判定方法可靠的補體 介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法（Complement-Mediated Antibody-Dependent Bactericidal Activity Test, CMAB)〇
[0024] 本發明的方法是用抗原（疫苗或菌體）免疫試驗動物（包括品系小鼠、家兔、恒河 猴）或健康人群，獲得免疫后的特異性血清，再將特異性血清抗體、補體（與免疫動物非同 源）和檢測菌按順序混合后反應，選擇合適的活菌顯色劑區分具有活性的菌體和死菌，使 得實驗者可快速直觀的對試驗結果進行判定。
[0025] 本發明所提供的技術方案如下：
[0026] 1. 一種補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，包括以下步驟：
[0027] (1)菌懸液的制備及樣品處理
[0028] ①菌懸液制備
[0029] 在瓊脂固體培養基斜面上復蘇菌種，接種至液體培養基中擴增培養得到菌液，按 照比濁法確定菌液的濃度，用生理鹽水將菌液稀釋成工作濃度即得菌懸液；
[0030] ②試劑準備
[0031] 顯色劑配制成質量體積分數為〇. 1 %?3 %的顯色劑溶液，將顯色劑溶液過濾除 菌，于2?8°C避光保存；
[0032] ③樣品處理
[0033] 補體為與免疫動物非同源的動物血清、陰性血清為免疫動物注射生理鹽水的血 清，陽性血清為市售的目標菌的診斷血清，補體稀釋至5?10倍，陽性血清和陰性血清分別 稀釋至原倍?10倍，將稀釋5?10倍的補體與菌懸液按體積比為1:1?1:2的比例混合 后冰浴靜置2?30分鐘得到活化菌懸液；
[0034] (2)殺菌檢測
[0035] ①加樣稀釋
[0036] 取待檢血清加至無菌微孔板的樣品孔中，用生理鹽水進行倍倍稀釋；陽性對照樣 品孔、陰性對照樣品孔中分別加入稀釋至原倍?10倍的陽性血清和稀釋至原倍?10倍的 陰性血清；補體空白對照孔和細菌活性對照孔分別加入液體培養基，每個對照重復三孔；
[0037] ②殺菌反應
[0038] 除細菌活性對照孔外，微孔板中的其余各孔均加入步驟（1)③所述的活化菌懸 液，細菌活性對照孔中加入步驟（1)①所述的菌懸液，然后將微孔板于37°C條件孵育1?8 小時，再在微孔板的每個孔中加入37°C預熱的培養基，再孵育1?12小時；
[0039] (3)顯色判定
[0040] ①顯色，在微孔板的每個孔中均加入步驟（1)②所配制的顯色劑溶液后，于37°C 孵育0. 5?6小時顯色；或將微孔板于2?8°C靜置過夜，在微孔板的每個孔中均加入步驟 (1)②所配制的顯色劑溶液，于37°C孵育0. 5?6小時顯色；
[0041] ②判定
[0042] 顯色或出現針尖狀沉淀為陰性結果，即不具有殺菌活性，不顯色或出現片狀沉淀 的為陽性結果，即具有殺菌活性；當陽性血清對照組為陽性結果，陰性血清對照組、補體空 白對照組和細菌活性對照組均為陰性結果時，待檢血清顯色或出現針尖狀沉淀為陰性結 果，即不具有殺菌活性；待檢血清不顯色或出現片狀沉淀為陽性結果，即具有殺菌活性。
[0043] 2.根據技術方案1所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特 征在于：步驟（1)①菌懸液制備所復蘇的菌種為傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌屬、大腸埃希菌 屬、溶血性弧菌屬或痢疾志賀氏菌。
[0044] 3.根據技術方案2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特 征在于：
[0045] 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為傷寒沙門菌時，所述的瓊脂固體培養基和液體 培養基均為中國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基，所述的工作濃度為 10X105 ?10X108/ml ;
[0046] 步驟⑴②試劑準備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑；
[0047] 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟⑵② 殺菌反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔 加入的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空 白對照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB4789. 4- 2010中 的緩沖蛋白胨水培養基；
[0048] 步驟（2)②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，，細菌活性對照孔 中加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的 用量為樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基為中 國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基；
[0049] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0050] 4.根據技術方案2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特 征在于：
[0051] 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為副傷寒沙門菌屬時，所述的瓊脂固體培養基和液 體培養基均為中國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基，所述的工作濃度 為 10X105 ?10X108/ml ;
[0052] 步驟（1)②試劑準備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑；
[0053] 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)② 殺菌反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔 加入的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空 白對照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB4789. 4- 2010中 的緩沖蛋白胨水培養基；
[0054] 步驟⑵②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細菌活性對照孔中 加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的用 量為樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基 為中國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基；
[0055] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟⑴②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0056] 5.根據技術方案2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特 征在于：
[0057] 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為大腸埃希菌屬時，所述的瓊脂固體培養基和液 體培養基均為中國國家標準GB 4789. 38-2012中的EC肉湯培養基，所述的工作濃度為 8X105/ml ?8X108/ml ;
[0058] 步驟（1)②試劑準備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑；
[0059] 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)② 殺菌反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔 加入的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空 白對照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB 4789. 38-2012 中的EC肉湯培養基；
[0060] 步驟⑵②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細菌活性對照孔中 加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的用 量為樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基 為中國國家標準GB 4789. 38-2012中的EC肉湯培養基；
[0061] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟⑴②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0062] 6.根據技術方案2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特 征在于：
[0063] 步驟⑴①菌懸液制備中菌種為溶血性弧菌屬時，所述的瓊脂固體培養基和液體 培養基均為中國國家標準GB 4789. 7- 2013中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養基，所述的 工作濃度為 18X105/ml ?18X108/ml ;
[0064] 步驟（1)②試劑準備中所述的顯色劑為三苯基氯化四氮唑或四氮唑紫；
[0065] 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)② 殺菌反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔 加入的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空 白對照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB 4789. 7- 2013 中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養基；
[0066] 步驟⑵②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細菌活性對照孔中 加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的用 量為樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基 為中國國家標準GB 4789. 7-2013中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養基；
[0067] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟⑴②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0068] 7.根據技術方案2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特 征在于：
[0069] 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為痢疾志賀氏菌時，所述的瓊脂固體培養基和液體 培養基均為中國國家標準GB4789. 5- 2012中的志賀氏菌增菌肉湯培養基，所述的工作濃 度為 8 X 105/ml ?8 X 108/ml ;
[0070] 步驟⑴②試劑準備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑；
[0071] 步驟⑵①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟⑵② 殺菌反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后 的待檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入 的陰性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔 加入的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空 白對照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB4789. 5- 2012中 的志賀氏菌增菌肉湯培養基；
[0072] 步驟（2)②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細菌活性對照孔中 加入的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的用 量為樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基 為中國國家標準GB4789. 5- 2012中的志賀氏菌增菌肉湯培養基；
[0073] 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的 量與樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
[0074] 與現有技術相比，本發明方法的有益效果是：
[0075] 1、本發明方法提出了一種新的技術方案，無需現有技術采用肉眼逐一進行活菌計 數的方法，僅通過顯色或不顯色就可直觀、快速地判定待檢血清是否具有殺菌活性，其檢測 步驟簡便、快速、可靠準確，克服了現有技術用肉眼活菌計數經常易出現漏計或重復計數、 計數錯誤率高，結果誤差較大，工作量大、繁瑣復雜的缺陷。
[0076] 2、本發明方法在每塊微孔板同時設立了陽性對照、陰性對照、補體空白對照孔、細 菌活性對照，并以各對照為應有的結果為檢測結果成立的條件，檢測結果以各對照為驗證， 使本發明方法的檢測結果可靠準確。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0077] 圖1是本發明補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法檢測顯色后結果 示例。
【具體實施方式】
[0078] 通過以下實例進一步說明本發明。本發明并不局限于實施例，實例僅為本發明解 決案例之一。
[0079] 以下各實施例無特殊說明為常用方法。所用疫苗均由云南沃森生物技術股份有限 公司提供，也可向該公司購買，該公司地址：云南省昆明高新技術開發區北區科發路云南省 大學科技園，郵政編碼650106。
[0080] 實施例1甲型副傷寒結合疫苗免疫小鼠血清殺菌抗體檢測
[0081] 1菌懸液的制備及樣品處理
[0082] 1. 1菌懸液制備
[0083] 在瓊脂培養基斜面上復蘇甲型副傷寒菌株，37°C培養22小時，用接種環挑取適量 菌苔接種于液體培養基中，37°C搖育18小時，將菌液用生理鹽水比濁稀釋至10X10 7/ml即 得菌懸液，所述的瓊脂固體培養基和液體培養基均為中國國家標準GB4789. 4- 2010中的 緩沖蛋白胨水培養基。
[0084] 1. 2試劑準備
[0085] 顯色劑用生理鹽水配制成0. 1% (W/V)的顯色劑溶液，除菌過濾，2?8°C避光保 存，所述的顯色劑為四氮唑紫。96孔板的滅菌：96孔板放入75%乙醇中浸泡15分鐘，紫外 燈下照射30分鐘（或使用商品化的已滅菌96孔板）。
[0086] 1.3樣品處理
[0087] 補體為健康的實驗用豚鼠血清，用生理鹽水將補體做5倍稀釋；陰性血清為健康 小鼠注射生理鹽水后獲得的血清，陽性血清為市售的沙門氏菌屬0:2因子診斷血清，陰性 血清和陽性血清分別用生理鹽水做10倍稀釋。將稀釋5倍的補體與10X 107/ml的菌懸液 等體積混合，冰浴中靜置20分鐘得到活化菌懸液。
[0088] 2殺菌檢測
[0089] 2. 1加樣稀釋
[0090] ①取各待檢血清樣品20μ 1分別加至1#?14#組樣品孔的第1孔中，用60μ 1生 理鹽水做4倍稀釋，然后從1#?14#組樣品孔的第1孔中取40 μ 1稀釋后待檢血清至第2 孔中，用40 μ 1生理鹽水做倍倍稀釋，如此做倍倍稀釋至第6孔（稀釋倍數見表1)，樣品孔 每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積均為40 μ 1，樣品孔每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積 與步驟2. 2殺菌反應中①所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1。
[0091] ②陽性對照樣品孔加入10倍稀釋陽性血清40μ 1，重復三孔；陰性對照樣品孔加 入10倍稀釋陰性血清40 μ 1，重復三孔；補體空白對照孔加入液體培養基40 μ 1，重復三孔； 細菌活性對照孔加入40 μ 1液體培養基，重復三孔。補體空白對照孔和細菌活性對照孔加 入的液體培養基均為國家標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基。
[0092] 2. 2殺囷反應
[0093] ①除細菌活性對照孔外，96孔板的其余各孔分別加入步驟1. 3所述的活化菌懸液 各20 μ 1 (與倍倍稀釋后的待檢血清體積比為1:2)。細菌活性對照孔的每孔加入5 X 107/ ml的菌懸液（不含補體）20 μ 1。加樣及稀釋倍數見表1。
[0094] ②96孔板于37°C條件孵育2小時，再在96孔板的每個孔中加入37°C預熱的培養 基100 μ 1 (即樣品孔每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積40 μ 1的2. 5倍），再孵育3小時。 所述的37°C預熱的培養基為中國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基。
[0095] 表1.血清樣品稀釋表
[0096]
【權利要求】
1. 一種補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，包括以下步驟： (1) 菌懸液的制備及樣品處理 ① 菌懸液制備 在瓊脂固體培養基斜面上復蘇菌種，接種至液體培養基中擴增培養得到菌液，按照比 濁法確定菌液的工作濃度，用生理鹽水將菌液稀釋成工作濃度即得菌懸液； ② 試劑準備 顯色劑配制成質量體積分數為〇. 1 %?3 %的顯色劑溶液，將顯色劑溶液過濾除菌，于 2?8°C避光保存； ③ 樣品處理 補體為與免疫動物非同源的動物血清、陰性血清為免疫動物注射生理鹽水的血清，陽 性血清為市售的目標菌的診斷血清，補體稀釋至5?10倍，陽性血清和陰性血清分別稀釋 至原倍?10倍，將稀釋5?10倍的補體與菌懸液按體積比為1:1?1:2的比例混合后冰 浴靜置2?30分鐘得到活化菌懸液； (2) 殺菌檢測 ① 加樣稀釋 取待檢血清加至無菌微孔板的樣品孔中，用生理鹽水進行倍倍稀釋；陽性對照樣品孔、 陰性對照樣品孔中分別加入稀釋至原倍?10倍的陽性血清和稀釋至原倍?10倍的陰性血 清；補體空白對照孔和細菌活性對照孔分別加入液體培養基，每個對照重復三孔； ② 殺菌反應 除細菌活性對照孔外，微孔板中的其余各孔均加入步驟（1)③所述的活化菌懸液，細 菌活性對照孔中加入步驟（1)①所述的菌懸液，然后將微孔板于37°C條件孵育1?8小時， 再在微孔板的每個孔中加入37°C預熱的培養基，再孵育1?12小時； (3) 顯色判定 ① 顯色，在微孔板的每個孔中均加入步驟（1)②所配制的顯色劑溶液后，于37°C孵育 0. 5?6小時顯色；或將微孔板于2?8°C靜置過夜，在微孔板的每個孔中均加入步驟（1)② 所配制的顯色劑溶液，于37°C孵育0. 5?6小時顯色； ② 判定 顯色或出現針尖狀沉淀為陰性結果，即不具有殺菌活性，不顯色或出現片狀沉淀的為 陽性結果，即具有殺菌活性；當陽性血清對照組為陽性結果，陰性血清對照組、補體空白對 照組和細菌活性對照組均為陰性結果時，待檢血清顯色或出現針尖狀沉淀為陰性結果，即 不具有殺菌活性；待檢血清不顯色或出現片狀沉淀為陽性結果，即具有殺菌活性。
2. 根據權利要求1所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特征在 于：步驟（1)①菌懸液制備所復蘇的菌種為傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌屬、大腸埃希菌屬、 溶血性弧菌屬或痢疾志賀氏菌。
3. 根據權利要求2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為傷寒沙門菌時，所述的瓊脂固體培養基和液體培 養基均為中國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基，所述的工作濃度為 10X105 ?10X108/ml ; 步驟（1)②試劑準備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔加入 的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空白對 照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩 沖蛋白胨水培養基； 步驟⑵②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細菌活性對照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的用量為 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基為中國國家 標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
4. 根據權利要求2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為副傷寒沙門菌屬時，所述的瓊脂固體培養基和液體 培養基均為中國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基，所述的工作濃度為 10X105 ?10X108/ml ; 步驟（1)②試劑準備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔加入 的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空白對 照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩 沖蛋白胨水培養基； 步驟⑵②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細菌活性對照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的用量為 樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基為中 國國家標準GB4789. 4- 2010中的緩沖蛋白胨水培養基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
5. 根據權利要求2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為大腸埃希菌屬時，所述的瓊脂固體培養基和液體培養 基均為中國國家標準GB 4789. 38-2012中的EC肉湯培養基，所述的工作濃度為8 X105/ ml ?8 X 108/ml ; 步驟（1)②試劑準備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔加入 的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空白對 照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB 4789. 38-2012中的 EC肉湯培養基； 步驟⑵②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細菌活性對照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的用量為 樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基為中 國國家標準GB 4789. 38-2012中的EC肉湯培養基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
6. 根據權利要求2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為溶血性弧菌屬時，所述的瓊脂固體培養基和液體培養 基均為中國國家標準GB 4789. 7- 2013中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養基，所述的工作 濃度為 18X 105/ml ?18X 108/ml ; 步驟（1)②試劑準備中所述的顯色劑為三苯基氯化四氮唑或四氮唑紫； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔加入 的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空白對 照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB 4789. 7- 2013中的 3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養基； 步驟⑵②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細菌活性對照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的用量為 樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基為中 國國家標準GB 4789. 7-2013中的3%氯化鈉胰蛋白胨大豆培養基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
7. 根據權利要求2所述的補體介導的血清抗體依賴性殺菌活性的檢測方法，其特征在 于： 步驟（1)①菌懸液制備中菌種為痢疾志賀氏菌時，所述的瓊脂固體培養基和液體培養 基均為中國國家標準GB4789. 5- 2012中的志賀氏菌增菌肉湯培養基，所述的工作濃度為 8X105/ml ?8X108/ml ; 步驟（1)②試劑準備中所述的顯色劑為四氮唑紫或新四氮唑； 步驟（2)①加樣稀釋中樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積與步驟（2)②殺菌 反應中所述的活化菌懸液體積的體積比為2:1?4:1，且樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待 檢血清體積均相等，陽性對照孔的每孔加入的陽性血清的量、陰性對照孔的每孔加入的陰 性血清的量、補體空白對照孔的每孔加入的液體培養基的量和細菌活性對照孔的每孔加入 的液體培養基的量均與樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清的用量等體積，補體空白對 照孔和細菌活性對照孔分別加入的液體培養基均為中國國家標準GB4789. 5- 2012中的志 賀氏菌增菌肉湯培養基； 步驟⑵②殺菌反應中所述活化菌懸液體積為20 μ 1?40 μ 1，細菌活性對照孔中加入 的菌懸液的量與活化菌懸液等體積，微孔板的每個孔中加入的37°C預熱的培養基的用量為 樣品孔的每孔中倍倍稀釋后的待檢血清體積的2. 5?3倍，所述的37°C預熱的培養基為中 國國家標準GB4789. 5- 2012中的志賀氏菌增菌肉湯培養基； 步驟（3)①顯色中在微孔板的每個孔中加入的步驟（1)②所配制的顯色劑溶液的量與 樣品孔中倍倍稀釋后的待檢血清等體積。
【文檔編號】G01N21/78GK104101596SQ201410362470
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】李生迪, 吳俊波, 趙志宏, 白梅, 馬波, 張夢菲 申請人:云南沃森生物技術股份有限公司
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