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一種恩諾沙星分子印跡整體柱的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種恩諾沙星分子印跡整體柱的制備方法，其步驟為：a、將模板分子恩諾沙星、功能單體和致孔劑混合，超聲，反應(yīng)，得復(fù)合物；b、在復(fù)合物中加入交聯(lián)劑、引發(fā)劑，超聲脫氣，通氮?dú)獬酰瑢⑺没旌弦鹤⑷氩讳P鋼柱內(nèi)，封好，豎直靜置水浴加熱反應(yīng)，得分子印跡整體柱；c、將合成的分子印跡整體柱連接高壓輸液泵上，用清洗液清洗除去致孔劑和模板分子，即得恩諾沙星分子印跡整體柱。本發(fā)明制得的整體柱具有較大的孔徑結(jié)構(gòu)、均勻而穩(wěn)定的骨架以及較好的流體動(dòng)力學(xué)特征，能夠在較大的傳質(zhì)速率下具有較低的背壓和穩(wěn)定快速的傳質(zhì)能力，其柱內(nèi)聚合物不容易收縮變形，不易于與柱壁剝離，使用壽命長(zhǎng)，可循環(huán)利用，便于批量生產(chǎn)及推廣應(yīng)用。
【專利說明】一種恩諾沙星分子印跡整體柱的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物殘留分析中固相萃取整體柱的制備方法，具體地說涉及一種對(duì)恩諾沙星抗生素具有特異性識(shí)別的分子印跡整體柱的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]喹諾酮類(quinolones, QNs)抗菌藥是指人工合成的含有4_喹酮母核的一類廣譜抗微生物藥，目前廣泛使用的是第三代產(chǎn)品，如恩諾沙星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、氧氟沙星。其中恩諾沙星(Enrofloxacin)，又名乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星，其化學(xué)系統(tǒng)命名為1-環(huán)丙基-7-(4-乙基-1-哌嗪基)-6-氟-1，4- 二氫-4-氧代-3-喹啉羧酸,屬于國(guó)家指定的氟奎諾酮類動(dòng)物專用抑菌劑，是預(yù)防、診斷、治療動(dòng)物疾病的重要藥物之一。獸藥殘留是給動(dòng)物使用藥物后蓄積或貯存在細(xì)胞、組織或器官內(nèi)的藥物原形和代謝產(chǎn)物，殘留除了其毒副作用對(duì)人直接危害外，更為嚴(yán)重的是導(dǎo)致細(xì)菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抗藥性，病原體型和病型增多，新的疫病及復(fù)合感染不斷增加，人畜共犯的疾病率升高。因此，歐盟、美國(guó)食品藥品管理局(FDA)和中國(guó)農(nóng)業(yè)部對(duì)這種可食性組織設(shè)立了最高藥殘限量。目前，對(duì)喹諾酮類藥物殘留的檢測(cè)方法應(yīng)用比較廣泛的有酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、毛細(xì)管電泳法、液相色譜法與液質(zhì)聯(lián)用等；而決定這些方法的準(zhǔn)確性和精確度的關(guān)鍵步驟是樣品的前處理，即從動(dòng)物源性樣品中萃取并富集所要測(cè)得藥物。
[0003]分子印跡整體柱(molecularimprinting monolithic column)是分子識(shí)別機(jī)制和色譜制備技術(shù)的有機(jī)結(jié)合，它綜合利用了分子印跡技術(shù)及整體柱的特性，以其具備制備簡(jiǎn)單、傳質(zhì)快、選擇性高、易于分離富集等的優(yōu)勢(shì)，成為行業(yè)內(nèi)萃取分離技術(shù)研究的熱門課題。如CN101852791公開了一種離子液體中諾氟沙星分子印跡整體柱的制備方法，該方法將模板分子諾氟沙星、功能單體甲基丙烯酸超聲溶解于由二甲基亞砜和N，N-二甲基甲酰胺組成的混合溶劑中超聲溶解反應(yīng)后，然后加入致孔劑1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽混合、超聲，靜置作用4-6小時(shí)形成復(fù)合物，加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯、引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲脫氣，注入不銹鋼柱，水浴，清洗去除致孔劑和模板分子，得到諾氟沙星分子印跡整體柱。CN101246150公開了一種四環(huán)素分子印跡整體柱的制備，將四環(huán)素超聲溶解于極性溶劑中，然后加入功能單體甲基丙烯酸、致孔劑環(huán)乙醇等混合反應(yīng)后，再加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基烯酸酯、引發(fā)劑偶氮二異丁腈混合反應(yīng)，超聲脫氣，注入不銹鋼柱，水浴，清洗去除致孔劑和模板分子，得到四環(huán)素分子印跡整體柱。上述方法雖然制備簡(jiǎn)單、避免繁瑣的研磨過程、分子識(shí)別性能好，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)特定藥殘進(jìn)行高效分離、富集和純化，但是采用上述方法制備的分子印跡整體柱經(jīng)使用發(fā)現(xiàn)，其耐壓性差，連接到液相色譜高壓泵上其流速一般限制在0.8 mL/min以內(nèi)，分離效率較低，柱內(nèi)聚合物骨架不穩(wěn)定，在使用過程中受壓容易收縮變形，容易與柱壁發(fā)生剝離，壽命較短。這些問題極大地限制了其在商業(yè)上的推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的就是提供一種對(duì)恩諾沙星抗生素具有特異性識(shí)別的分子印跡整體柱的制備方法，以解決現(xiàn)有方法制備的分子印跡整體柱存在聚合物骨架不穩(wěn)定、容易收縮變形、容易與管壁剝離、耐壓性差、分離效率低、壽命短、不可循環(huán)使用的問題。
[0005]本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:一種恩諾沙星分子印跡整體柱的制備方法，包括以下步驟:
a、將模板分子恩諾沙星、功能單體和致孔劑按摩爾體積比為Imol: 4 mol: 4.8 mL混合，超聲，反應(yīng)2 h，得復(fù)合物；其中所述功能單體是由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸羥乙酯按摩爾比為1:1組成的混合物，所述致孔劑是由甲苯、十二醇和聚乙二醇-200按體積比為1:4:1組成；
b、在所述復(fù)合物中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑,超聲脫氣10min,通氮?dú)獬?0 min,將所得混合液注入不銹鋼柱內(nèi)，封好，豎直靜置在55°C水浴環(huán)境中反應(yīng)24 h，得分子印跡整體柱；所述交聯(lián)劑與模板分子的摩爾比為15: 1，其中交聯(lián)劑是由乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯按摩爾比為2:1組成的混合物；所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，所述引發(fā)劑的用量為模板分子、功能單體、混合溶劑、致孔劑和交聯(lián)劑添加總質(zhì)量的1% ;
C、將步驟b所合成的分子印跡整體柱連接在高壓輸液泵上，用清洗液清洗去除致孔劑和模板分子，即得恩諾沙星分子印跡整體柱。
[0006]本發(fā)明步驟c所述清洗液為體積比為4:1的甲醇/冰醋酸溶液；也可按照現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)用料和用量選用。
[0007]本發(fā)明選擇了最佳組分及特定組分比例的功能單體、致孔劑、交聯(lián)劑以及引發(fā)劑，通過功能單體(甲基丙烯酸和甲基丙烯酸羥乙酯按摩爾比為1:1)和交聯(lián)劑(乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯按摩爾比為2:1)的協(xié)同作用，制備了對(duì)恩諾沙星具有特異性識(shí)別的分子印跡整體柱，該整體柱不僅制備簡(jiǎn)單易行，重現(xiàn)性好，可直接在不銹鋼柱中合成，無(wú)需研磨就可應(yīng)用為色譜固定相，而且所制得的整體柱親和力強(qiáng)，選擇性好，具有多功能基團(tuán)和較好的分子專一性識(shí)別位點(diǎn)；更重要的是，該分子印跡整體柱具有較大的孔徑結(jié)構(gòu)、均勻而穩(wěn)定的骨架以及較好的流體動(dòng)力學(xué)特征，連接到液相色譜高壓泵上能夠承受的流速可達(dá)2.0 mL/min,并能實(shí)現(xiàn)在較大的傳質(zhì)速率下具有較低的背壓和穩(wěn)定快速的傳質(zhì)能力，從而使得整體柱在分離富集有效成分時(shí)聚合物不容易收縮變形以及與柱壁剝離。此外，由于該整體柱在使用之后完好無(wú)損，所以使用后的整體柱經(jīng)過洗脫處理，可以循環(huán)利用。
[0008]本發(fā)明制備的分子印跡整體柱可作為預(yù)分離富集柱，在線固相萃取-液相色譜聯(lián)用來分析食物中抗生素類藥物殘留，其制備方法重現(xiàn)性好，分離效率高，使用壽命長(zhǎng)，便于批量生產(chǎn)及推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]圖1為實(shí)施例1制備的分子印跡整體柱MIPl的SEM圖。
[0010]圖2為對(duì)比例I制備的分子印跡整體柱MIP2的SEM圖。
[0011]圖3-8分別為對(duì)比例6-11制備的分子印跡整體柱MIP7-MIP12的SEM圖。
[0012]圖9中a和b分別為對(duì)比例12和實(shí)施例1制備的分子印跡整體柱的耐壓測(cè)試圖。【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
在錐形瓶中，稱取0.5 mmol的恩諾沙星,加入0.4 mL甲苯，1.6 mL十二醇和0.4 mL聚乙二醇-200 (PEG-200)，超聲混合后，加入功能單體甲基丙烯酸(MAA) 1.0 mmol和甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA) 1.0 mmol，使之相互作用2 h以形成復(fù)合物。再加入交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)5.0 mmol和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TMPTA)2.5 mmol，加入引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)30 mg,溶液經(jīng)過超聲脫氣10 min,通氮?dú)獬?0 min,然后將此混合液注入到不銹鋼色譜柱(50 mmX4.6 mm)中，密封。豎直靜止在55°C水浴中反應(yīng)24 h。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，冷卻到室溫，取出合成的色譜柱，去掉密封頭，將其連接到液相色譜泵上，用甲醇/冰醋酸(4:1，v/v)溶液清洗除去致孔劑和模板分子，得到聚合物為MIP1，見圖1。
[0014]對(duì)比例I
加入功能單體MAA (2.0 mmol)，不加入HEMA，其它同實(shí)施例1，可得MIP2，見圖2。
[0015]對(duì)比例2
加入功能單體HEMA (2.0 mmol)，不加入MAA，其它同實(shí)施例1，可得MIP3。
[0016]對(duì)比例3
加入功能單體MAA (0.5 mmol)和HEMA (1.5 mmol)，其它同實(shí)施例1，可得MIP4。
[0017]對(duì)比例4
加入功能單體MAA (1.5 mmol)和HEMA (0.5 mmol)，其它同實(shí)施例1，可得MIP5。
[0018]對(duì)比例5
加入致孔劑十二醇(2.0 mL)，不加聚乙二醇-200，其它同實(shí)施例1，可得MIP6。
[0019]對(duì)比例6
加入致孔劑十二醇(1.4 mL)、甲苯(0.6 mL)和PEG-200 (0.4 mL)，其它同實(shí)施例1，可得MIP7，見圖3。
[0020]對(duì)比例7
加入致孔劑十二醇(1.4 mL)、甲苯(0.4mL)和PEG-200 (0.6 mL)，其它同實(shí)施例1，可得MIP8，見圖4。
[0021]對(duì)比例8
加入交聯(lián)劑EDMA (7.5 mmol)，不加入TMPTA，其它同實(shí)施例1，可得MIP9，見圖5。
[0022]對(duì)比例9
加入交聯(lián)劑EDMA (10 mmol)，不加入TMPTA，其它同實(shí)施例1，可得MIP10，見圖6。
[0023]對(duì)比例10
加入交聯(lián)劑TMPTA (7.5 mmol)，不加入EDMA，其它同實(shí)施例1，可得MIP11，見圖7。
[0024]對(duì)比例11
加入交聯(lián)劑TMPTA (10 mmol)，不加入EDMA，其它同實(shí)施例1，可得MIP12，見圖8。
[0025]對(duì)比例12
加入功能單體(MAA, 2.0 mmol)、交聯(lián)劑EDMA (7.5 mmol),致孔劑甲苯(0.40 mmol)和十二醇(2.0 mmol)，不加入其它功能單體、交聯(lián)劑和致孔劑，其它步驟同實(shí)施例1，可得MIP13。
[0026]本發(fā)明的實(shí)施例1及對(duì)比例1-12的原料組成如表I所示，制備方法同實(shí)施例1。[0027]本發(fā)明中實(shí)施例與對(duì)比例制得產(chǎn)品經(jīng)測(cè)試，其技術(shù)指標(biāo)如表2和圖9所示。
[0028]實(shí)施例2分子印跡整體柱的性能檢測(cè)
(I)動(dòng)態(tài)吸附容量的檢測(cè)方法:將實(shí)施例和對(duì)比例制備的分子印跡整體柱連接到色譜儀上，以乙腈/水(25/75, v/v)為流動(dòng)相在0.8 mL/min的流速下沖洗柱子,并在280 nm下監(jiān)測(cè)，直到基線穩(wěn)定；然后將整體柱從HPLC系統(tǒng)中撤出，以含有恩諾沙星1.0 mg/mL的乙腈/水(25/75，v/v)溶液為流動(dòng)相，充分沖洗從流動(dòng)相入口至色譜柱的管路；再將整體柱接回到色譜系統(tǒng)中，繼續(xù)以恩諾沙星的乙腈/水(25/75)溶液為流動(dòng)相，仍然在0.8 mL/min的流速下進(jìn)行色譜實(shí)驗(yàn)，記錄檢測(cè)信號(hào)就可以得到動(dòng)態(tài)穿透。通過穿透曲線可以計(jì)算得到動(dòng)態(tài)吸附容量，其計(jì)算公式如下:
Q = (Wt0) FC/m
其中，t5(W為穿透50%所需時(shí)間，t0為死時(shí)間，F(xiàn)為體積流速，C為上樣液的濃度，m為吸附介質(zhì)的質(zhì)量。
[0029](2)耐壓性的檢測(cè)方法:按照對(duì)比例12的方法制備的整體柱，并將實(shí)施例1制備的分子印跡整體柱分別連接到液相色譜高壓泵上，在流速2.0 mL/min下，進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的耐壓性測(cè)試，記錄柱子壓力發(fā)生明顯波動(dòng)的時(shí)間點(diǎn)，以背壓為縱坐標(biāo)，耐壓時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖。
[0030]檢測(cè)結(jié)果:
從表2可以看出:實(shí)施例1的骨架很穩(wěn)定，通透性好，其吸附容量較對(duì)比例1-5更高。同時(shí)，由于對(duì)比例6-12骨架穩(wěn)定性差、通透性差、柱內(nèi)聚合物容易變形收縮，所以無(wú)法對(duì)其進(jìn)行吸附能力測(cè)試；此外，從實(shí)施例1及部分對(duì)比例的耐壓測(cè)試實(shí)驗(yàn)數(shù)值可以得出:本發(fā)明在眾多功能單體、交聯(lián)劑、致孔劑以及引發(fā)劑類型中選擇了最佳的組分及組分比例，制備得到的分子印跡整體柱，其背壓值最小，能夠在流速2.0 mL/min下，耐壓時(shí)間達(dá)到120 h以上，且骨架穩(wěn)定，傳質(zhì)能力好，其各項(xiàng)指標(biāo)性能明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。
[0031]由圖9中b顯示可知:實(shí)施例1制備的分子印跡整體柱在2.0 mL/min的流速下60h的耐壓測(cè)試中，其背壓變化較小，未出現(xiàn)任何異常波動(dòng)，說明其柱內(nèi)聚合物骨架穩(wěn)定，傳質(zhì)能力好。而圖9中a (對(duì)比例12制備的分子印跡整體柱)在0-35 h內(nèi)背壓穩(wěn)定，在35_37h時(shí)，柱內(nèi)聚合物構(gòu)架發(fā)生塌陷變形，柱內(nèi)聚合物與柱壁發(fā)生剝離，背壓迅速增大，整體柱已經(jīng)損壞。
[0032]本發(fā)明所有實(shí)施例所用的原材料均為市售產(chǎn)品，所用的分析儀器為島津LC-20A液相色譜儀。
[0033]表I實(shí)施例及對(duì)比例制備過程中部分物質(zhì)的添加用量
【權(quán)利要求】
1.一種恩諾沙星分子印跡整體柱的制備方法，其特征是，包括以下步驟: a、將模板分子恩諾沙星、功能單體和致孔劑按摩爾體積比為Imol: 4 mol: 4.8 mL混合，超聲，反應(yīng)2 h，得復(fù)合物；其中所述功能單體是由甲基丙烯酸和甲基丙烯酸羥乙酯按摩爾比為1:1組成的混合物，所述致孔劑是由甲苯、十二醇和聚乙二醇-200按體積比為1:4:1組成； b、在所述復(fù)合物中加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑,超聲脫氣10min,通氮?dú)獬?0 min,將所得混合液注入不銹鋼柱內(nèi)，封好，豎直靜置在55°C水浴環(huán)境中反應(yīng)24 h，得分子印跡整體柱；所述交聯(lián)劑與模板分子的摩爾比為15: 1，其中交聯(lián)劑是由乙二醇二甲基丙烯酸酯和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯按摩爾比為2:1組成的混合物；所述引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，所述引發(fā)劑的用量為模板分子、功能單體、混合溶劑、致孔劑和交聯(lián)劑添加總質(zhì)量的1% ; C、將步驟b所合成的分子印跡整體柱連接在高壓輸液泵上，用清洗液清洗去除致孔劑和模板分子，即得恩諾沙星分子印跡整體柱。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述恩諾沙星分子印跡整體柱的制備方法，其特征是，步驟c所述清洗液為體積比為4:1的甲醇/冰醋酸溶液。
【文檔編號(hào)】G01N30/56GK103884803SQ201410140078
【公開日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2014年4月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月9日
【發(fā)明者】秦新英, 張利萍, 呂運(yùn)開, 楊磊 申請(qǐng)人:河北大學(xué)