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一種偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，所述凝膠是將Stat3抗體偶聯至瓊脂糖凝膠載體上制成偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠；所述Stat3抗體是由Stat3抗原多肽經免疫反應后進行提取純化而獲得，所述Stat3抗原多肽的氨基酸序列為序列2、序列3、序列5、序列8和序列9之一所示；本發明所述Stat3抗體靈敏性好，效價高；本發明中所得到的偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠可以直接富集細胞中的Stat3蛋白及其Stat3結合蛋白，用于Stat3蛋白相關疾病中的功能研究；序列2：DFDFNYKTLKSQGC；序列3：PEADPGSAAPYLKT；序列5：LYPDIPKEEAFGKY；序列8：ESQEHPEADPGSAAPY；序列9：KVSYKGDPIVQHRP。
【專利說明】一種偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠及其應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種 Stat3 抗體（Signal Transducers and Activators of Transcription3)及其抗體填料制備方法與應用。具體而言，是基于Stat3氨基酸序列選擇 多個位點的多肽免疫，篩選高效價的Stat3抗體，并制備成偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠。 (二）

【背景技術】
[0002] Stat3 抗體（Signal Transducers and Activators of Transcription3)為信號 傳導與轉錄激活因子（Signal Transducers and Activators of Transcription，STAT)蛋 白家族的成員，在維持胚胎干細胞的全能性及調節免疫中發揮重要作用。Stat3基因敲除的 小鼠可引起胚胎致死，其異常表達與多種疾病密切相關。
[0003] Stat3執行生理功能具有多樣性特點：（1)維持胚胎干細胞的自我更新；(2)刺激 T細胞增殖，誘導Thl7細胞生成；（3)保持外周神經細胞存活；（4)參與上皮組織中胸腺細 胞的發育及乳腺細胞的退化；（5)介導肝細胞的急性期損傷修復等。由于Stat3執行功能 的多樣性，在多種腫瘤及免疫性疾病中均發現Stat3的異常表達（參見 ：Levy，D.E.，and Lee,C.K. (2002). What does Stat3 do ? The Journal of clinical investigation 109, 1143-1148. Yu, H. , Pardoll, D. , and Jove, R. (2009). STATs in cancer inflammation and immunity:a leading role for STAT3. Nature reviews Cancer 9,798-809·)。
[0004] Stat3在細胞內有兩種異構體Stat3a和Stat3 0，Stat3a蛋白全長770個氨 基酸，由六個功能區組成（Becker S, Groner B, Muller CW. Three-dimensional structure of the Stat3beta homodimer bound to DNA. Nature 1998 ；394:145-151.Schaefer TS, Sanders LK, Nathans D. Cooperative transcriptional activity of Jun and Stat3 beta, a short form of Stat3. Proc Natl Acad Sci USA 1995;92:9097-9101.) ：(1)N 端的氨基酸保守序列（1-130);⑵螺旋區（Coil-coil Domain 130-320, CCD) ; (3)DNA 結 合域（DNA Binding Domain 320-494, DBD) ; (4)連接區（Linker Domain 495-583) ; (5) SH2 結構域（SH2 Domain 584-688) ; (6) C 端的轉錄激活區（Transactivation domain689_770， TAD)，見圖I所示。
[0005] 精確的認識Stat3在不同組織、細胞中的功能有助于我們認識Stat3在疾病發生 中的作用。針對Stat3制備的抗體，在多個商業化的公司均有多種Stat3抗體在銷售，如 SantaCruz 公司的 Stat3 抗體對應貨號有 SC-482, SC-8019, SC-7179 等。Cell signaling technology公司的Stat3抗體對應貨號有9319、4904等。公司關于使用哪一段多肽免疫產 生的Stat3抗體均屬于商業機密，我們根據Stat3蛋白的氨基酸序列特性，合成了 10段候 選抗原多肽，并篩選到一個能高效制備Stat3抗體的抗原多肽。
[0006] NHS活化瓊脂糖凝膠偶聯抗體在檢測細胞或者組織內的低豐度蛋白及篩選目的蛋 白的結合蛋白中應用廣泛。關于偶聯抗體的填料產品，目前有偶聯標簽抗體填料的商業化 產品如 c-Myc Tag IP/Co-IP kit (Thermo Scientific?#23610)，ANTI-FLAG M2Magnetic Beads(Sigma#A2220)，關于瓊脂糖凝膠偶聯Stat3抗體的產品未見銷售。根據文獻檢索 表明目前篩選Stat3結合蛋白的方法有：將Stat3構建到帶標簽蛋白的表達載體中用偶 聯標簽抗體的瓊脂糖凝膠進行篩選，這個方法牽涉到轉染和載體構建的過程，方法復雜， 流程時間長，而且不能排除標簽抗體自身拉下的結合蛋白的干擾。或者用傳統的IP方法 利用Stat3 -抗聯合ProteinA+G珠分離細胞內的Stat3結合蛋白，因為過程中要使用 ProteinA+G珠，因此這種方法不可避免會導致大量IgG及IgA的結合，極大的干擾了實驗結 果的準確性。制備瓊脂糖凝膠偶聯的Stat3抗體對于研宄Stat3的功能會帶來很多便捷， 實驗的準確性和穩定性也能夠得到很好的控制。 (三）
【發明內容】

[0007] 本發明目的是提供一種基于Stat3氨基酸序列合成10段免疫原性強的抗原肽，篩 選出一種新的高效價的Stat3抗體，并將其制備成偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠；該方法中 制備的抗體效價高、特異性強。所得到的偶聯Stat3抗體瓊脂糖凝膠穩定性好，特異性和敏 感性強。在研宄Stat3的功能及篩選其結合蛋白更加便捷、準確；可以做成商業化產品，用 于Stat3蛋白相關的疾病中的功能研宄。
[0008] 本發明采用的技術方案是：
[0009] 本發明提供一種偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，所述凝膠是將Stat3抗體偶聯至 瓊脂糖凝膠載體上制成偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠；所述Stat3抗體是由Stat3抗原多 肽經免疫反應后進行提取純化而獲得，所述Stat3抗原多肽的氨基酸序列為序列2、序列3、 序列5、序列8和序列9之一；
[0010] 序列 2 :DFDFNYKTLKSQGC ;序列 3 :PEADPGSAAPYLKT ;
[0011] 序列 5 :LYPDIPKEEAFGKY ;序列 8 :ESQEHPEADPGSAAPY ;
[0012] 序列 9 :KVSYKGDPIVQHRP。
[0013] 進一步，所述制備Stat3抗體的最優抗原多肽的氨基酸序列為序列3所示。
[0014] 進一步，所述瓊脂糖凝膠為NHS活化的瓊脂糖凝膠FF，更優選購自北京韋氏博慧 色譜科技有限公司CS-A30。
[0015] 進一步，所述偶聯方法為：將Stat3抗體用pH8. 0的0. 2M碳酸氫鈉水溶液溶解制 成10mg/ml偶聯溶液；將瓊脂糖凝膠用ImM鹽酸水溶液抽濾清洗后，獲得載體；將載體加入 偶聯溶液中，4°C，震蕩反應12小時，抽濾，濾餅用pH8. 0的0. 2M碳酸氫鈉水溶液清洗后浸 入IOmM乙醇胺溶液中，室溫震蕩過夜，抽濾后用pH8. 0,0. 2M碳酸鈉緩沖液清洗，去除洗滌 液即獲得偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠；所述IOmM乙醇胺溶液是由pH8. 0、0. 2M碳酸鈉緩 沖液配制，所述的載體與偶聯溶液的體積比為I :1. 5?2,所述瓊脂糖凝膠為NHS活化的瓊 脂糖凝膠FF。
[0016] 進一步，所述Stat3抗體按如下方法制備：（1)將Stat3抗原多肽與載體偶聯，制 成Stat3抗原多肽復合物；所述Stat3抗原多肽的氨基酸序列為序列2、序列3、序列5、序 列8和序列9之一所示；（2)用Stat3抗原多肽復合物進行免疫反應，收集含Stat3抗體的 血清，分離提取Stat3抗體，獲得Stat3抗體。
[0017] 進一步，優選步驟（1)所述載體為鑰孔血藍蛋白。
[0018] 本發明所述抗原多肽的合成方法為本領域公知技術，但是關于抗原多肽的免疫原 性的情況未知，在本發明中我們通過后期檢測篩選表明序列2、序列3、序列5、序列7、序列 8、序列9多肽序列制備的抗體通過ELISA檢測和點雜檢測表明結果陽性。蛋白免疫印跡鑒 定表明序列2、序列3、序列5、序列8、序列9多肽制備的抗體結果陽性。進一步通過檢測細 胞內源性Stat3蛋白表明3號多肽序列制備的Stat3抗體效價和敏感性均為最優。3號多 肽為最優的制備Stat3抗體的抗原肽。
[0019] 本發明還涉及一種偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠在富集細胞中Stat3及其結合蛋 白中的應用。通過實驗我們得到了偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠富集細胞中Stat3蛋白的 條件：IO 6個細胞加入500 μ 1的IP裂解液（P0013碧云天生物技術有限公司），4°C旋轉Ih 使其充分裂解，20, OOOg離心20min，取上清，加入2 μ g偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，4°C 混合過夜。之后用裂解液洗滌填料一次，再用PBS洗滌填料三次。該偶聯Stat3抗體的瓊 脂糖凝膠上可以富集細胞中的Stat3蛋白及其Stat3結合蛋白。該方法可用于相關的疾病 中Stat3功能的研宄。
[0020] 與現有技術相比，本發明有益效果主要體現在：本發明所述Stat3抗體靈敏性好， 效價高；關于偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，目前市場上沒有看到銷售，當前多通過在細胞 內過表達帶標簽的Stat3蛋白來篩選Stat3的結合蛋白，方法復雜流程長，而且沒有直接篩 選內源性的Stat3結合蛋白真實可信；本發明中所得到的偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠可 以直接富集細胞中的Stat3蛋白及其Stat3結合蛋白，目前在市場上尚未發現同類產品，可 以做成商業化產品，用于Stat3蛋白相關疾病中的功能研宄。 (四）【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1為Stat3蛋白的結構示意圖。
[0022] 圖2為10條抗原多肽在Stat3蛋白中的位置。
[0023] 圖3為抗原多肽的HPLC鑒定，A為1號抗原多肽，B為2號抗原多肽，C3號抗原多 肽，D為4號抗原多肽，E為5號抗原多肽，F為6號抗原多肽，G為7號抗原多肽，H為8號 抗原多肽，I為9號抗原多肽，J為10號抗原多肽。
[0024] 圖4為抗原多肽的質譜鑒定，A為1號抗原多肽，B為2號抗原多肽，C3號抗原多 肽，D為4號抗原多肽，E為5號抗原多肽，F為6號抗原多肽，G為7號抗原多肽，H為8號 抗原多肽，I為9號抗原多肽，J為10號抗原多肽的HPLC鑒定。
[0025] 圖5為ELISA鑒定抗血清效價圖，2、3、4、5、7、8、9分別表示2、3、4、5、7、8、9號抗原 多肽制備的含Stat3抗體血清的抗體效價結果。
[0026] 圖 6 為 Dot-Blot 鑒定 Stat3 抗體，2、3、4、5、7、8、9 分別表示 2、3、4、5、7、8、9 號抗 原多肽制備的Stat3抗體鑒定結果。
[0027] 圖7為Stat3抗體檢測過量表達的Stat3, 2、3、4、5、7、8、9分別表示2、3、4、5、7、8、 9號抗原多肽制備的Stat3抗體檢測結果，其中泳道A表示293T細胞未轉染Myc-Stat3表 達載體蛋白樣本；泳道B表示293T細胞轉染Myc-Stat3表達載體蛋白樣本，蛋白內含有高 豐度的Stat3蛋白；泳道M為Marker，從上之下的前三條帶依次為170kd、130kd、95kd。箭 頭指示位置為Stat3蛋白被抗體識別到的陽性信號的位置。
[0028] 圖8為Stat3抗體檢測Pc-9細胞中內源性Stat3,2、3、5、8、9分別為2、3、5、8、 9號抗原多肽制備的Stat3抗體，對照為商業化的Stat3抗體（Santa Cruz公司，貨號為 sc-482);其中泳道M為Marker，從上之下的前三條帶依次為170kd、130kd、95kd ;泳道S為 人肺癌細胞PC9總蛋白樣本。
[0029] 圖9為Stat3抗體填料純化過量表達的Stat3蛋白，A為用細胞總蛋白進行鑒定 的圖：泳道1為293T細胞總蛋白，泳道2為Myc純化柱純化后的蛋白（箭頭指示位置為 Myc-Stat3蛋白）；B為用細胞漿蛋白和細胞核蛋白兩種細胞組分蛋白鑒定：泳道1為293T 細胞的細胞漿總蛋白，泳道2為293T細胞的細胞核總蛋白，泳道3為Stat3抗體填料純化 細胞衆中Myc_Stat3蛋白，泳道4為偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠純化細胞核中Myc_Stat3 蛋白，泳道M為Marker從上之下的分子量（kd)依次為：170、130、95、70、55、40、35、25。
[0030] 圖10為偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠純化內源性的Stat3蛋白電泳圖，泳道1為 人肺癌細胞PC9總蛋白；泳道2為偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠純化人肺癌細胞PC9總蛋 白中內源性Stat3蛋白，泳道M為Marker從上之下的分子量（kd)依次為：170、130、95、70、 55、40、35、25,箭頭指示位置為Stat3蛋白。
[0031] 圖11為Stat3抗體填料純化內源性的Stat3及其結合蛋白的質譜鑒定，A為Stat3 蛋白質譜鑒定分析；B為PKC質譜鑒定分析。 (五）【具體實施方式】
[0032] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0033] 如未特別指明之處，可根據本領域技術人員所熟悉的《Making and Using Antibodies: A Practical Handbook》（CRC Press，Florida，2006)、《抗體制備與使用實驗 指南》（科學出版社，北京，2010年）等手冊以及本文所引用的參考文獻中所列的方法來實 施。另外，實施例中所使用的材料除有特別說明外，均可通過商業途徑從市場上購買。
[0034] 實施例1 :基于Stat3蛋白序列的新型抗Stat3抗體及其偶聯載體的制備
[0035] 1、多肽的合成及偶聯
[0036] 通過對Stat3蛋白序列（序列11所示，結構見圖1)進行對比分析，委托杭州聚成 生物技術有限公司合成10條多肽，10條多肽序列為序列1-10所示，其在Stat3蛋白中的位 置如圖2所示。
[0037] Stat3蛋白序列（序列11):
[0038] MAQWNQLQQLDTRYLEQLHQLYSDSFPMELRQFLAPWIESQDWAYAASKESHATLVFHNLLGEIDQQ YSRFLQESNVLYQHNLRRIKQFLQSRYLEKPMEIARIVARCLWEESRLLQTAATAAQQGGQANHPTAAVVTEKQQ MLEQHLQDVRKRVQDLEQKMKVVENLQDDFDFNYKTLKSQ⑶MQDLNGNNQSVTRQKMQQLEQMLTALDQMRRSI VSELAGLLSAMEYVQKTLTDEELADWKRRQQIACIGGPPNICLDRLENWITSLAESQLQTRQQIKKLEELQQKVS YKGDPIVQHRPMLEERIVELFRNLMKSAFVVERQPCMPMHPDRPLVIKTGVQFTTKVRLLVKFPELNYQLKIKVC IDKDS⑶VAALRGSRKFNILGTNTKVMNMEESNNGSLSAEFKHLTLREQRCGNGGRANCDASLIVTEELHLITFE TEVYHQGLKIDLETHSLPVVVISNICQMPNAWASILWY匪LTNNPKNVNFFTKPPIGTWDQVAEVLSWQFSSTTK RGLSIEQLTTLAEKLLGPGVNYSGCQITffAKFCKENMAGKGFSFffVffLDNIIDLVKKYILALffNEGYIMGFISKE RERAILSTKPPGTFLLRFSESSKEGGVTFTWVEKDISGKTQIQSVEPYTKQQLNNMSFAEIIMGYKIMDATNILV SPLVYLYPDIPKEEAFGKYCRPESQEHPEADPGAAPYLKTKFICVTPTTCSNTIDLPMSPRTLDSLMQFGNNGEG AEPSAGGQFESLTFDMELTSECATSPM
[0039] 1-10號抗原多肽序列：
[0040] I ：KVSYKGDPIVQHR ；2 ：DFDFNYKTLKSQGC ；
[0041] 3 ：PEADPGSAAPYLKT ；4 ：SKERERAILSTKP ；
[0042] 5 ：LYPDIPKEEAFGKY ；6 ：PESQEHPEADPGS ；
[0043] 7 ：LHQLYSDSFPMELR ；8 ：ESQEHPEADPGSAAPY ；
[0044] 9 ：KVSYKGDPIVQHRP ；10 ：TLKSQGDMQDLNGNN〇
[0045] 將10條抗原多肽序列進行HPLC和質譜的鑒定，結果如圖3、4所示。
[0046] 條件為采用反相高效液相色譜測定合成的多肽，色譜柱為Boston Crest ODS, 4. 6*250mm, 5um。流速為 I. Oml/min，檢測波長為 220nm，進樣量為 IOul.流動相 Solvent A(0. I % Trif luoroacetic in 100% Acetonirile), Solvent B(0. I % Trif luoroacetic in 100% Water)，A和B等體積混合作為流動相。
[0047] 表1質譜檢測條件

【權利要求】
1. 一種偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，其特征在于所述凝膠是將Stat3抗體偶聯至瓊 脂糖凝膠載體上制成偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠；所述Stat3抗體是由Stat3抗原多肽 經免疫反應后進行提取純化而獲得，所述Stat3抗原多肽的氨基酸序列為序列2、序列3、序 列5、序列8和序列9之一所示； 序列 2 :DFDFNYKTLKSQGC ;序列 3 :PEADPGSAAPYLKT ; 序列 5 :LYPDIPKEEAFGKY ;序列 8 :ESQEHPEADPGSAAPY ; 序列 9 :KVSYKGDPIVQHRP。
2. 如權利要求1所述偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，其特征在于所述瓊脂糖凝膠為 NHS活化的瓊脂糖凝膠FF。
3. 如權利要求1所述偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，其特征在于所述Stat3抗原的氨 基酸序列為序列3所示。
4. 如權利要求1所述偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，其特征在于所述偶聯方法為：將 Stat3抗體用pH8. 0的0. 2M碳酸氫鈉水溶液溶解制成10mg/ml偶聯溶液；將瓊脂糖凝膠用 ImM鹽酸水溶液抽濾清洗后，獲得載體；將載體加入偶聯溶液中，4°C，震蕩反應12小時，抽 濾，濾餅用PH8. 0的0. 2M碳酸氫鈉水溶液清洗后浸入10mM乙醇胺溶液中，室溫震蕩過夜， 抽濾后用PH8. 0,0. 2M碳酸鈉緩沖液清洗，去除洗滌液即獲得偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝 膠；所述1〇禮乙醇胺溶液是由PH8. 0、0. 2M碳酸鈉緩沖液配制，所述的載體與偶聯溶液的體 積比為1 :1. 5?2,所述瓊脂糖凝膠為NHS活化的瓊脂糖凝膠FF。
5. 如權利要求1所述偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，其特征在于Stat3抗體按如下方 法制備：（1)將Stat3抗原多肽與載體偶聯，制成Stat3抗原多肽復合物；（2)用Stat3抗原 多肽復合物進行免疫反應，收集含Stat3抗體的血清，分離提取Stat3抗體，獲得Stat3抗 體。
6. 如權利要求5所述偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠，其特征在于步驟（1)所述載體為 鑰孔血藍蛋白。
7. -種權利要求1所述偶聯Stat3抗體的瓊脂糖凝膠在富集Stat3蛋白及其結合蛋白 中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK104479023SQ201410457680
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年9月10日 優先權日:2014年9月10日
【發明者】徐莉, 秦樾, 季巾君, 程胤凱, 王鑫 申請人:浙江中醫藥大學