一種拉曼可視化快速檢測藻毒素高靈敏紙的制備方法及檢測方法
【專利摘要】一種拉曼可視化快速檢測藻毒素高靈敏紙的制備方法及檢測方法，屬于納米材料與生物化學檢測【技術領域】。本發明包括：藻毒素抗體的制備，球形及星形納米粒子的制備、具有拉曼信號的金標抗體的制備、紙基拉曼試紙條的組裝以及在藻毒素檢測中的應用等步驟。本發明提供了一種高靈敏紙基拉曼可視化快速檢測藻毒素的方法，通過合成具有拉曼信號的納米粒子，并標記藻毒素抗體，用于免疫金標記技術（ICA）結合拉曼檢測儀器對藻毒素進行高靈敏檢測。
【專利說明】一種拉曼可視化快速檢測藻毒素高靈敏紙的制備方法及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種拉曼可視化快速檢測藻毒素高靈敏紙的制備方法及檢測方法，屬于納米材料與生物化學檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]微囊藻毒素(MC)，即微囊藻素。從藍 藻水華中分離出的多肽毒素，具有水溶性、耐熱性和相當的穩定性，加熱煮沸都不能將毒素破壞；自來水處理工藝的混凝沉淀、過濾、加氯、氧化、活性炭吸附等也不能將其完全去除。微囊藻素易溶于水、甲醇或丙酮，不揮發，抗PH變化?；瘜W性質相當穩定，自然降解過程十分緩慢。MC在去離子水中可保持穩定狀態長達27d，在滅囷的河水中可保持穩定12d，而在普通河水中7d以內即會降解。它對蛋白憐Ife酶I和蛋白磷酸酶2A具有抑制作用，因此與腫瘤促進作用有直接關系。國內外研究最多的主要是MC-LR和MC-RR。MC的毒性和其結構相關，Adda是表達MC毒性的必需基團。研究表明，MC-LR的急性毒性最強，MC-YR次之，MC-RR最弱。在已報道的MC的80多種異構體中，MC-LR是最為常見的種類，且相關的毒理學研究最多，腹腔注射小白鼠的LD50值一般在50-60 μ g/kg (體重)，因此，MC-LR的毒性可與化學類有機磷神經毒劑相當。
[0003]國內外的微囊藻毒素檢測標準世界衛生組織(WHO)推薦的飲水中的藻毒素標準為l.0ppb。各國已有飲水中的藻毒素含量標準一般都為微囊藻毒素LR的含量，加拿大健康組織規定飲水中可接受的藻毒素標準為0.5ppb，澳大利亞學者建議Ippb的含量為安全飲用水的上限。中國微囊藻毒素的標準檢測國標主要有:《飲用水的有機標準》GB/T5750.8-2006、《水中微囊藻毒素的測定》GB/T20466-2006、《地表水環境質量標準》GB3838-2002、《地表水和污水監測技術規范》HJ/T91-2002。隨著中國水體的富營養化程度逐漸加劇，藍藻水華和赤潮的發生逐漸增加。80%的藍藻水華都可以檢測出次生代謝產
物---微囊藻毒素(microcystins, MCs),它對水體環境和人群健康的危害已成為全球關注
的重大環境問題之一。
[0004]傳統檢測方法采用物化分析方法，其中最主要的是:高效液相色譜法(HPLC)。液質聯用法(LC-MS)，HPLC-電噴霧電離質譜法(HPLC-ES1-MS)和超高效液相色譜串聯質譜法(UPLC-MS/MS )。這些方法需要昂貴的儀器和專業的操作人員，不適合用于現場檢測。
[0005]免疫化學法是目前比較有前景的可以快速、靈敏的檢測藻毒素的方法。免疫分析技術是指基于抗原和抗體之間的相互作用檢測各種物質(如藥物、激素、蛋白質、細菌等)的分析方法?？乖贵w之間的相互作用是指抗原與相應抗體之間所發生的特異性結合反應，抗原抗體分子之間存在著結構互補性和親和性，依靠非共價鍵(靜電引力、分子間作用力、氫鍵結合力和疏水作用)的相互作用進行結合，且抗原與抗體結合形成抗原抗體復合物的過程是一種動態平衡。利用微囊藻毒素誘發免疫反應產生抗體，利用抗體對抗原的特異性識別來對各種毒素進行檢測。以免疫技術為基礎，微囊藻毒素的免疫化學法包括酶聯免疫吸附法、放射免疫分析法、免疫親和色譜法、膠體金法及免疫傳感器法等。這類方法靈敏度較高、樣品處理簡單，便于操作，其檢測限低于WHO水平，被認為是較有發展前景的方法。
[0006]免疫金標記技術(ICA技術)具有獨特的優點，已成為第四大免疫標記新技術,是標記免疫分析方法的一種。膠體金免疫層析法的原理是將抗體標記到納米金粒子上利用抗原抗體的反應對目標物質達到定量檢測。由于具有簡便、快速、低成本等優點，已經在激素檢測、藥物監管、癌癥診斷等領域得到廣泛應用?？梢酝ㄟ^肉眼對顏色深淺做出判斷，但是缺點是靈敏度低，基質干擾大。同時結合讀數儀器可以達到半定量的檢測，但是目前的讀數儀器是基于灰度分析，對灰度值的細小差別分辨率低。
[0007]近些年表面增強拉曼光譜免疫分析技術(SERSIA)作為一種靈敏度極高的標記免疫分析方法逐漸得到深入的研究和開發。1974年，Fleischinann第一次發現了表面增強拉曼散射效應(Surface^enhanced Raman Scattering, SERS),發現吸附在粗糖銀電極表面的吡啶分子的Raman信號比溶液中的吡啶拉曼信號增強了約IO6倍，即100萬倍；而1977年，VanDuyne和Creighton研究小組通過實驗研究和理論計算確認了表面增強拉曼散射效應的存在。SERS的發現極大地激發了人們對拉曼光譜的研究興趣，因為它有效地解決了Raman光譜在表面科學和痕量分析中存在的低靈敏度問題。目前，隨著新型納米增強材料和增強基片的引入，SERS已經可以提供非破壞性和低至單分子水平的超靈敏檢測，因此廣泛地應用于化學和生物傳感器、生物醫學檢測、痕量檢測與分析、細菌分析與細胞成像、環境監測等諸多領域。SERSIA就是將SERS的高靈敏度與免疫反應的高特異性相結合的新型分析方法，巧妙的將免疫分析技術、納米技術與SERS三者有機結合，具有獨特的優越性，比如靈敏度極高、不受水的干擾、拉曼譜峰寬度窄且不會粹滅等。
[0008]目前ICA技術和其他方法或材料聯用已成為新的發展趨勢和研究熱點，但利用信標分子在納米粒子表面增強拉曼的特點結合ICA反應的原理進行高靈敏的檢測仍處在初步階段。在本發明項目中 ，通過合成具有拉曼信號的納米粒子，并標記藻毒素抗體，用于ICA技術結合拉曼檢測儀器對藻毒素進行高靈敏檢測。
【發明內容】
[0009]本發明的目的是提供一種拉曼可視化快速檢測藻毒素高靈敏紙的制備方法及檢測方法。利用表面增強拉曼技術結合ICA技術，實現對水中污染物MC-LR的高靈敏檢測。
[0010]本發明的技術方案，一種拉曼可視化快速檢測藻毒素高靈敏紙的制備方法，
包括如下步驟:
1、合成藻毒素的抗原，制備能夠結合藻毒素的抗體；2、制備不同尺寸和形狀的金納米粒子；3、金納米粒子表面修飾信標分子和抗體；4、組建藻毒素快速拉曼檢測試紙條；5、通過拉曼信號建立藻毒素濃度依賴曲線；6、環境樣品的檢測。
[0011]具體步驟如下:
(I)藻毒素單克隆抗體的制備:合成藻毒素的免疫原和弗氏佐劑混合后，刺激小鼠產生針對藻毒素的抗體。通過小鼠脾臟細胞和SP20細胞在PEG的作用下進行融合，得到能夠分泌藻毒素單克隆抗體的細胞株，通過體外誘生的方法制備腹水，純化得到藻毒素單克隆抗體。
[0012](2)球形及星形納米粒子的制備:一定濃度的單寧酸和檸檬酸三鈉混合液加入到四氯合金酸的水溶液中，60°C水浴攪拌,制備IOnm, 20nm, 30nm球形金納米粒子。采用種子生長法合成10nm，20nm，30nm星形納米粒子，采用透射電鏡、紫外分析儀等測試描述的基本性質。
[0013](3)金納米粒子表面修飾信標分子和抗體:以球形金納米粒子為例，首先將拉曼信標分子修飾在金納米粒子表面，然后再修飾抗體，并用牛血清白蛋白封閉剩余位點。
[0014]首先將拉曼信標分子4-氨基苯硫酚和金納米粒子過夜反應，利用4-氨基苯硫酚的巰基和金表面形成穩定的金硫鍵；過夜反應后，離心，用PH8.0的硼酸緩沖液重懸，再加入藻毒素抗體，使得藻毒素抗體終濃度為lOPg/mL ;振蕩標記2h，加入牛血清白蛋白封閉未反應的位點2h，終濃度0.5% ;離心，后加入PBS重懸到原始體積；
(4)組建藻毒素快速拉曼檢測試紙條:將制備好的具有拉曼信號的金標記抗體，均勻浸泡到金標結合墊上，然后烘干；在塑料底板上順序組裝樣品墊玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙，將金標結合墊組裝到塑料底板上使之在樣品墊玻璃纖維膜和硝酸纖維素膜之間相互疊加Imm ;在組裝好的試紙條的硝酸纖維素膜上用噴膜儀器噴好檢測線(MC-LR和牛血清白蛋白的偶聯物)和質控線(羊抗鼠二抗)后烘干2h ;然后將組裝好的片狀試紙條在切條儀器剪切成3_的試紙條，組裝到塑料卡殼中，單個封裝，干燥保存。
[0015]所述拉曼可視化快速檢測藻毒素高靈敏紙的檢測方法:
(5)通過拉曼信號建立藻毒素濃度依賴曲線:在目標物存在的條件下，由于抗原抗體的競爭關系會使得拉曼信號降低，在這個原理的基礎上，實現對藻毒素的高靈敏檢測。采用拉曼光譜儀器等測試描述的基本性質。
[0016]添加不同濃度的藻毒素，觀察對拉曼信號的影響，從而建立目標物MC-LR與拉曼信號的標準曲線。將不同濃度的藻毒素標準品滴加到試紙條上的樣品孔中，5min后，在拉曼光譜儀器上進行檢測；所使用藻毒素標準品濃度依次為:0、0.05ng/mL、0.lng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、Ing/mL、2ng/mL、5ng/mL,對所得到的拉曼譜圖進行鑒定,得到不同藻毒毒濃度下的拉曼光譜圖，并根據信號分子的特征峰值得到標準曲線；
(6)實際樣品檢測方法的確立:檢測自來水和湖水實際樣品。應用所開發的拉曼試紙條對自來水和湖水中的藻毒素污染情況進行檢測，并根據標準曲線進行對比，得到檢測樣品中藻毒素的濃度。
[0017]本發明的有益效果:本發明試紙條利用拉曼高靈敏檢測技術可以對環境污染物藻毒素進行高靈敏檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1藻毒素單克隆抗體的制備過程。
[0019]圖2制備不同尺寸和形狀的金納米粒子。
[0020]圖3金納米粒子表面修飾拉曼信標分子和抗體示意圖。
[0021]圖4基于試紙條拉曼信號的藻毒素檢測標準曲線。
【具體實施方式】
[0022](I)藻毒素單克隆抗體的制備:將合成藻毒素的免疫原和弗氏佐劑混合后，刺激小鼠產生針對藻毒素的抗體，五次免疫后通過尾部采集血檢測血清中是否含有藻毒素的抗體。將能夠產生藻毒素抗體的小鼠沖免三天后，處死，無菌取出脾臟，小鼠脾臟細胞和SP20細胞在PEG的作用下進行融合，7天后，用間接競爭酶聯免疫法進行篩選，得到能夠分泌藻毒素單克隆抗體的細胞株，然后經過三個單個細胞的亞克隆后通過體外誘生的方法制備腹水，純化得到藻毒素單克隆抗體。如圖1。
[0023](2)球形和星形納米粒子的制備:
球形納米粒子:潔凈的三口燒瓶中加入42mL超純水，加入2.6mL 0.2%氯金酸溶液，攪拌并加熱至沸騰，10分鐘后加入0.9mL 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液從無色變為紅色后，停止加熱，繼續攪拌20分鐘；透射電鏡顯示平均粒徑為25nm ；
星形納米粒子:首先制備種子溶液:4mL ImM的HAuCl4溶液，煮沸后，往其中加入0.6mL1%檸檬酸鈉溶液，加熱反應15min。然后，制備星狀金納米顆粒:10mL 0.25mM HAuCl4 (混有ΙΟμL IM的HCl )，再加入100μL種子溶液，攪拌，加入100μL AgNO3 (0.5~3Μ)攪拌30s，離心5min (300(T5000r/min)。如圖 2。
[0024]( 3 )納米粒子表面修飾拉曼信標分子和抗體:首先將拉曼信標分子4-氨基苯硫酚和金納米粒子過夜反應，利用4-氨基苯硫酚的巰基和金表面形成穩定的金硫鍵。由于4-氨基苯硫酚在金的表面會有表面增強拉曼 效應，修飾上4-氨基苯硫酚的金納米粒子會有強烈的拉曼信號。過夜反應后，離心，用PH8.0的硼酸緩沖液重懸，再加入藻毒素抗體，使得終濃度為lOPg/mL。振蕩標記2h，加入牛血清白蛋白封閉未反應的位點2h，終濃度0.5%。離心，后加入PBS重懸到原始體積。如圖3。
[0025](4)組建藻毒素快速拉曼檢測試紙條:將制備好的具有拉曼信號的金標記抗體，均勻浸泡到金標結合墊上，然后烘干。同時在塑料底板上依次組裝裝樣品墊玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙，將藻毒素抗原和羊抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上烘干2h。然后將金標結合墊組裝到塑料底板上使之在硝酸纖維素膜和樣品墊玻璃纖維膜之間相互疊加1mm。將組裝好的片狀試紙條在切條機器上切成3_每條的單個試紙條。組裝到塑料卡殼中，單個封裝，干燥保存。
[0026](5)通過拉曼信號建立藻毒素濃度依賴曲線:將不同濃度的藻毒素標準品滴加到試紙條上的樣品孔中，5 min后，在拉曼光譜儀器上進行檢測。
[0027]本發明所使用的藻毒素標準品濃度依次為:0、0.05ng/mL、0.lng/mL>0.2ng/mL>
0.5ng/mL、Ing/mL、2ng/mL、5ng/mL,對所得到的拉曼譜圖進行鑒定,可以得到不同藻毒素濃度下的拉曼光譜圖，并根據信號分子的特征峰值(1087cm-l)得到標準曲線。如圖4。
[0028](6)實際樣品檢測方法的確立:應用所開發的拉曼試紙條對自來水和湖水中的藻毒素污染情況進行檢測，并根據標準曲線進行對比，得到檢測樣品中藻毒素的濃度。
【權利要求】
1.一種拉曼可視化快速檢測藻毒素高靈敏紙的制備方法，其特征在于步驟為: (1)制備具有拉曼信號的金標記抗體:首先將拉曼信標分子4-氨基苯硫酚和金納米粒子過夜反應，利用4-氨基苯硫酚的巰基和金表面形成穩定的金硫鍵；過夜反應后，離心，用PH8.0的硼酸緩沖液重懸，再加入藻毒素抗體，使得藻毒素抗體終濃度為lOPg/mL ;振蕩標記2h，加入牛血清白蛋白封閉未反應的位點2h，終濃度0.5% ;離心，后加入PBS重懸到原始體積； (2)試紙條的制備:將步驟(I)制備好的具有拉曼信號的金標記抗體，均勻浸泡到金標結合墊上，然后烘干；同時在塑料底板上依次組裝樣品墊玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜和吸水紙，將金標結合墊組裝到塑料底板上使之在樣品墊玻璃纖維膜和硝酸纖維素膜之間相互疊加Imm ;將藻毒素抗原MC-LR-BSA及羊抗鼠二抗依次噴到硝酸纖維膜上烘干2h，作為檢測線及質控線； 然后將組裝好的片狀試紙條在切條機器上切成寬3_每條的單個試紙條，組裝到塑料卡殼中，單個封裝，干燥保存。
2.用權利要求1所述拉曼可視化快速檢測藻毒素高靈敏紙的檢測方法，其特征在于步驟為: (1)標準曲線的繪制:將不同濃度的藻毒素標準品滴加到試紙條上的樣品孔中，5min后，在拉曼光譜儀器上進行檢測；所使用藻毒素標準品濃度依次為:0、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL、2ng/mL、5ng/mL,對所得到的拉曼譜圖進行鑒定,得到不同藻毒毒濃度下的拉曼光譜圖，并根據信號分子的特征峰值得到標準曲線； (2)實際樣品檢測方法的確立:應用所開發的拉曼試紙條對自來水和湖水中的藻毒素污染情況進行檢測，并根據標準曲線進行對比，得到檢測樣品中藻毒素的濃度。
【文檔編號】G01N21/65GK104007264SQ201410227553
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月27日 優先權日:2014年5月27日
【發明者】徐麗廣, 胥傳來, 邢常瑞, 匡華, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學
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