包合物包合率測定儀的測定方法
【專利摘要】一種包合物包合率測定儀的測定方法，所采用的測定儀包括檢測部分(1)、控制部分(2)和顯示部分(3)，檢測部分(1)包括樣品管(11)、第一透鏡(12)、短波通濾光片(13)、第二透鏡(14)、激發光源(15)、第三透鏡(16)、長波通濾光片(17)、第四透鏡(18)和光電倍增管(19)；控制部分(2)主要為芯片；顯示部分(3)為液晶顯示屏.采用本裝置測定包合物包合率的方法按五個步驟進行：一是備料，二是溶液的制備，三是儀器校正，四是熒光強度-包合率標準曲線的建立，五是樣品包合率的測定.本發明獨創了無光譜特征的包合物采用熒光法測定的新途徑，且所改進的儀器靈敏度高，樣品量低，操作簡單，應用范圍廣。
【專利說明】包合物包合率測定儀的測定方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種化學實驗儀器的使用方法，具體是用于藥物包合物包合率即β-環糊精-藥物包合物包合率的測定方法.【背景技術】
[0002]環糊精是一類由6~8個葡萄糖單元通過1，4糖苷鍵相互連接形成的一類環狀低聚糖，具有“外親水、內疏水、特殊空腔”的性質，可以通過超分子相互作用與許多有機或無機分子形成主客體包合物，在超分子化學領域得到了極為廣泛的應用.環糊精在環糊精種類中應用最廣，是一類由7個葡萄糖單元通過1，4糖苷鍵相互連接形成的一類環狀低聚糖，能夠包合各種形狀大小與環糊精內腔相匹配的疏水性客體藥物分子，以此提高客體藥物分子的溶解性.[0003]目前，對于藥物包合物包合率的測定多采用光譜法直接進行測定，即根據包合前后藥物分子光譜特性的變化來計算，此法不能測定無光譜特征的藥物包合物分子，且操作復雜，樣品用量高，存在一定缺陷.[0004]藥物進入人體后通過體液輸送到達體內能使具有內源熒光的蛋白質的熒光量子產率降低(熒光猝滅)，而藥物包合物通過體液輸送到達靶位緩慢釋放出藥物，對蛋白也有一定的熒光猝滅作用，因此可根據蛋白質的熒光猝滅差異來計算藥物包合物的包合率，此法尚未見報道.所涉及的熒光計是一種重要的儀器，大多數傳統的熒光計需要用大光束激發樣品，并需要大孔徑光匯聚器件提高儀器的靈敏度，因此儀器龐大，樣品用量大.CN203299124U公告了一種便攜式熒光計，利用透鏡將激發光進行匯聚，并通過空間濾光片或擋板去除背景及雜光，大大提高了儀器的靈敏度，本申請在此基礎上，結合藥物包合物對蛋白質的猝滅機理設計了一種新穎簡便的包合物包合率測定儀及其測定方法.
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種改進型的包合物包合率測定儀的測定方法.[0006]為便于了解本方法，首先介紹一下本改進型的包合物包合率測定儀，它包括檢測部分(I)、控制部分(2)和顯示部分(3)，檢測部分(I)包括樣品管(11)的水平方向右側設置有第一透鏡(12)和第二透鏡(14)，第一透鏡(12)和第二透鏡(14)之間設置有短波通濾光片(13)，第二透鏡(14)右`側設置有激發光源(15)，樣品管(11)的正上方設置有第三透鏡(16)和第四透鏡(18)，第三透鏡(16)和第四透鏡(18)之間設置有長波通濾光片(17)，第四透鏡(18)的上端設置有光電倍增管(19);控制部分(2)是根據操作規程自行編程制成的芯片，顯示部分(3)是與芯片相連的液晶顯示屏.[0007]用上述裝置檢測β -環糊精-藥物包合物包合率的方法按如下步驟進行:
[0008](I)備料:市購或網購足量的三羥甲基氨基甲烷粉劑、質量濃度為37%的濃鹽酸、蛋白粉、無水乙醇；按實驗設計要求向有關企業訂購梯度系列齊全的不同包合率的固態β-環糊精-藥物包合物標準品；[0009](2)溶液的制備:
[0010]①取6.59g三羥甲基氨基甲烷和7.83mL濃鹽酸，用蒸餾水配制成1000mL濃度為
0.1mol.L-1PH=?.43的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液；
[0011]②以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X10^5mol.L_1的蛋白標準溶液；
[0012]③以無水乙醇為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X 10_3mol.L_1的梯度系列不同包合率的β-環糊精-藥物包合物標準溶液；
[0013](3)儀器校正:取25 μ L已知包合率的包合物標準溶液注入含2.5mL蛋白標準溶液的樣品管中，打開激發光源并將光引入樣品管中，激發樣品管中被測分子中的電子并導致發出熒光，此熒光經光電倍增管將光信號轉化為電信號，經芯片計算出樣品的包合率，通過比較當前的包合率與計算出的包合率，進行儀器校正；
[0014](4)熒光強度-包合率標準曲線的建立:將25 μ L不同包合率的環糊精-藥物包合物標準溶液逐一注入含2.5mL蛋白標準溶液的樣品管中，分別檢測其熒光發射強度，此熒光強度經芯片擬合后得到以熒光強度為縱坐標，包合物的包合率為橫坐標的熒光強度-包合率標準曲線；
[0015](5)樣品包合率的測定:將25 μ L待測樣品注入含2.5mL蛋白標準溶液的樣品管中，檢測其熒光發射強度 ，此熒光強度經過芯片代入已擬合的熒光強度-包合率標準曲線中，得到對應的包合率即為該樣品的包合率.[0016]本發明的有益效果是能夠獨辟蹊徑地提供一種實現無光譜特征的包合物包合率的測定方法，而且所提供的儀器靈敏度較高，樣品量低，操作簡單.【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為本包合物包合率測定儀的組成部件框示圖.[0018]圖2為本包合物包合率測定儀檢測部分的結構示意圖.[0019]圖3為白藜蘆醇對牛乳鐵蛋白的熒光猝滅圖.[0020]圖4為β -環糊精對牛乳鐵蛋白的熒光猝滅圖.【具體實施方式】
[0021]下面本發明將結合實施例并參照附圖作進一步詳述，參見圖1與圖2，本包合物包合率測定儀，從功能上分，包括檢測部分(I)、控制部分(2)和顯示部分(3)，檢測部分(I)包括有居中的樣品管(11)，其水平方向的右側設置有第一透鏡(12)和第二透鏡(14)，第一透鏡(12)和第二透鏡(14)之間設置有短波通濾光片(13)，第二透鏡(14)右側設置有激發光源(15)，樣品管(11)的正上方設置有第三透鏡(16)和第四透鏡(18)，第三透鏡(16)和第四透鏡(18)之間設置有長波通濾光片(17)，第四透鏡(18)的上端設置有光電倍增管
(19);控制部分(2)是根據操作規程自行編程制成的芯片，顯示部分(3)是與芯片相連的液晶顯示屏.[0022]本包合物包合率測定儀的樣品管(11)為石英管；激發光源(15)為激發光二級管；四個透鏡(12、14、16、18)均用于聚光；長波通濾光片(17)和短波通濾光片(13)均為玻璃濾光片，用來篩選出希望的激發光或熒光并濾除不需要的雜光干擾；控制部分(2)主要為自行編程制成的芯片，由于不屬專利法保護范疇，準備申請計算機軟件保護，因此不贅述；光電倍增管(19)將光信號轉化為點信號并放大；顯示器部分(3)是液晶觸摸顯示屏，用于數據的顯示及與熒光計交互作用如鍵入變量、設定參數等的輸入。
[0023]本包合物包合率測定儀使用時，將樣品注入樣品管(11)中，打開激發光源(15)，激發光經第二透鏡(14)匯聚后通過短波通濾光片(13)過濾去除雜光，再經第一透鏡(12)匯聚通入樣品管中，激發樣品管中被測分子中的電子并導致發出熒光，此熒光經第三透鏡
(16)匯聚后通過長波通濾光片(17)過濾去除雜光，再經第四透鏡(18)匯聚通入光電倍增管中將光信號轉化為電信號并放大，最后經過芯片計算出樣品的包合率，并由液晶顯示屏向用戶顯示正確的包合率.[0024]本包合物包合率測定儀用于檢測β -環糊精-藥物包合物包合率的方法按如下步驟進行:
[0025](1)備料:市購或網購足量的三羥甲基氨基甲烷粉劑、質量濃度為37%的濃鹽酸、蛋白粉、無水乙醇；按實驗設計要求向有關企業訂購梯度系列齊全的不同包合率的固態β-環糊精-藥物包合物標準品；
[0026](2)溶液的制備:
[0027]①取6.59g三羥甲基氨基甲烷和7.83mL濃鹽酸，用蒸餾水配制成1000mL濃度為
0.1mol.L-1PH=?.43的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液；
[0028]②以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X10^5mol.L-的蛋白標準溶液；
[0029]③以無水乙醇為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X 10_3mol.L-1的梯度系列不同包合率的β-環糊精-藥物包合物標準溶液；
[0030](3)儀器校正:取25 μ L已知包合率的包合物標準溶液注入含2.5mL蛋白標準溶液的樣品管中，打開激發光源并將光引入樣品管中，激發樣品管中被測分子中的電子并導致發出熒光，此熒光經光電倍增管將光信號轉化為電信號，經芯片計算出樣品的包合率，通過比較當前的包合率與計算出的包合率，進行儀器校正；
[0031](4)熒光強度-包合率標準曲線的建立:將25 μ L不同包合率的環糊精-藥物包合物標準溶液逐一注入含2.5mL蛋白標準溶液的樣品管中，分別檢測其熒光發射強度，此熒光強度經芯片擬合后得到以熒光強度為縱坐標，包合物的包合率為橫坐標的熒光強度-包合率標準曲線；
[0032](5)樣品包合率的測定:將25 μ L待測樣品注入含2.5mL蛋白標準溶液的樣品管中，檢測其熒光發射強度，此熒光強度經過芯片代入已擬合的熒光強度-包合率標準曲線中，得到對應的包合率即為該樣品的包合率.[0033]熒光儀測定包合物包合率的原理:
[0034]蛋白質分子中含有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基，可產生較強的內源熒光.藥物通過體液輸送到達體內能使具有內源熒光的蛋白質的熒光量子產率降低(熒光猝滅)，且存在一定的量-效關系，因此可以利用藥物對蛋白質的熒光猝滅作用檢知藥物的
含量.[0035]凡能使蛋白發生熒光猝滅的藥物均可用上述方法可檢知其含量，藥物如結晶紫、水飛薊賓、芥子堿、氧氟沙星、大黃酚、槲皮素、黃芩苷、白藜蘆醇、阿魏酸等，蛋白如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛乳鐵蛋白等，下面我們以白藜蘆醇對牛乳鐵蛋白的猝滅為例進行實驗，結果如圖3所示，其中縱坐標表示熒光強度，橫坐標表示掃描波長，牛乳鐵蛋白濃度為1.0X10_5mol.ΙΛ曲線從上至下I~7表示白藜蘆醇濃度分別為O、1.0X 10_5、
1.6Χ10'3.2Χ10_5、4.0Χ10_5、4.8Χ10_5、6.4Χ10-5(單位:mol.171).從圖 3 可以看出，白藜蘆醇對牛乳鐵蛋白的猝滅作用很大，且隨著白藜蘆醇濃度的增加，牛乳鐵蛋白的熒光強度會逐漸降低，白藜蘆醇濃度與牛乳鐵蛋白的熒光強度呈一定線性關系，經線性擬合獲得方程為:y=_63.1281x+2060.4481，相關系數為0.9925。一般而言，相關系數大于0.8時，認為兩個變量有很強的相關性，越接近I相關性越好，本實驗相關系數為0.9925，說明白藜蘆醇濃度與牛乳鐵蛋白的熒光強度的線性好，可用于白藜蘆醇含量的測定.[0036]圖4為環糊精對牛乳鐵蛋白的熒光猝滅圖，其中縱坐標表示熒光強度，橫坐標表示掃描波長，牛乳鐵蛋白濃度為1.0X IO-5Hiol.L—1，曲線從上至下I~7表示β -環糊精濃度分別為 0、1.0Χ10_5、1.6Χ10_5、3.2X 10_5、4.0X 10_5、4.8X 10_5、6.4Χ10-5(單位:mol.η.從圖4可以看出，β-環糊精對牛乳鐵蛋白幾乎無猝滅作用.[0037]β -環糊精-藥物包合物進入人體后通過體液輸送到達靶位會緩慢釋放出藥物，對蛋白也有一定的熒光猝滅作用，而β -環糊精對牛乳鐵蛋白幾乎無猝滅作用，說明藥物包合物對牛乳鐵蛋白起猝滅作用的是包合物中釋放的藥物，而藥物包合物中釋放藥物的含量與其包合率大小呈正相關性，據此可根據藥物包合物中釋放出的藥物對牛乳鐵蛋白的猝滅作用，計算出釋放的藥物含量，進一步推測藥物包合物的包合率.本申請是利用梯度系列不同包合率的藥物包合物標準品對蛋白質的猝滅差異繪制標準曲線，用此來計算未知包合物的包合率。`
【權利要求】
1.一種包合物包合率測定儀的測定方法，其特征是按如下步驟進行: (1)備料:市購或網購足量的三羥甲基氨基甲烷粉劑、質量濃度為37%的濃鹽酸、蛋白粉、無水乙醇；按實驗設計要求向有關企業訂購梯度系列齊全的不同包合率的固態環糊精-藥物包合物標準品； (2)溶液的制備: ①取6.59g三羥甲基氨基甲烷和7.83mL濃鹽酸，用蒸餾水配制成1000mL濃度為0.1mol.L-1PH=?.43的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液； ②以三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X10^5mol.L-1的蛋白標準溶液； ③以無水乙醇為溶劑，配制與備料匹配的濃度為1.0X10_3mol.L-1的梯度系列不同包合率的β-環糊精-藥物包合物標準溶液； (3)儀器校正:取25μ L已知包合率的包合物標準溶液注入含2.5mL蛋白標準溶液的樣品管中，打開激發光源并將光引入樣品管中，激發樣品管中被測分子中的電子并導致發出熒光，此熒光經光電倍增管將光信號轉化為電信號，經芯片計算出樣品的包合率，通過比較當前的包合率與計算出的包合率，進行儀器校正； (4)熒光強度-包合率標準曲線的建立:將25μ L不同包合率的β-環糊精-藥物包合物標準溶液逐一注入含2.5mL蛋白標準溶液的樣品管中，分別檢測其熒光發射強度，此熒光強度經芯片擬合后得到以熒光強度為縱坐標，包合物的包合率為橫坐標的熒光強度-包合率標準曲線； (5)樣品包合率的測定:將25μ L待測樣品注入含2.5mL蛋白標準溶液的樣品管中，檢測其熒光發射強度，此熒光強度經過芯片代入已擬合的熒光強度-包合率標準曲線中，得到對應的包合率即為該樣品的包合率。
【文檔編號】G01N21/64GK103776806SQ201410006134
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月6日 優先權日:2014年1月6日
【發明者】郭明, 伍周玲, 詹敏忠 申請人:浙江農林大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
