一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒制備方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒及其應用。本發明原試劑盒含有Inhibin-B蛋白標準品，包被Inhibin-B特異性多克隆抗體的酶標板，CdTe量子點標記的Inhibin-B單克隆抗體。本發明試劑盒所用的檢測抗體為單克隆抗體用CdTe量子點標記，能更好的去除背景信號；本發明檢測方法簡便，實用性強；直接通過熒光酶標儀測定檢測結果，所發射的熒光譜峰狹窄，自發熒光弱，靈敏度高；熒光強度高，穩定時間長，克服了傳統酶免疫檢測試劑盒靈敏度低，特異性差的現狀；可提高卵巢儲備功能檢測的分辨率、靈敏度及特異性。
【專利說明】—種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人I nh i b i n-B的試劑盒制備方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于免疫診斷【技術領域】，涉及基于量子點的免疫熒光定量檢測，具體涉及一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒及其制備和應用。
【背景技術】
[0002]目前臨床上國內各診療單位評估卵巢功能主要根據年齡、竇卵泡的數目(Antralfollicle count)、濾泡刺激激素(FSH)和雌激素(E2)水平等。但上述傳統方法檢查容易受到各種因素影響而產生誤差，同時容易受到檢測者主觀判斷而產生結果偏倚；此外，上述指標的檢測受月經周期的時限制約，且其檢測數值受到月經周期的波動較大，因而無法準確給予判斷。能否尋找某一有效指標，在月經不同時期均能有效評估卵巢功能是目前婦科生殖內分泌面臨的主要問題之一。近年來，臨床上開始采用抑制素B激素作為卵巢功能評估的一項指標。抑制素B是一種由女性生長期卵泡顆粒細胞分泌的異二聚體蛋白質激素。其通過選擇性抑制卵泡刺激素(FSH)的分泌從而調節卵泡的發育。完整的抑制素B分子是一個分子量約為32KD的分子，由兩個不同的亞單位(α亞單位和β亞單位)經二硫鍵連接而成。研究表明，抑制素B水平與卵巢儲備功能呈正相關。
[0003]目前在歐美，大部分臨床診療中心已將Inhibin-B作為評估卵巢儲備的常規指標。主要所采用酶聯免疫顯色法測定(enzyme-linked immunoassay, Elisa)。但是,酶免疫分析法靈敏度低，影響因素較多，易造成假陰性和假陽性結果。量子點(QDs)具有連續而寬的激發光光譜。其熒光可被波長小于其量子限域峰的任意光源所激發，且熒光譜峰位置可以通過改變量子點物理尺寸進行調控。這樣僅用一種波長的激發光源便可激發多種不同顏色熒光的量子點進行多元熒光檢測。有效提高了分辨率和靈敏度。因此，量子點免疫分析法遠遠優于酶免疫測定。
[0004]目前國內尚未見檢測Inhibin-B的注冊試劑盒供應，該項檢測在臨床上的研究也還未廣泛展開。且目前國外的Inhibin-B檢測試劑盒多采用的是酶聯免疫方法，但是酶免疫分析法靈敏度低，影響因素多，易造成假陰性和假陽性。而根據大量的試驗結果及臨床應用資料，從實用性、穩定性、準確性及臨床應用前景來看，量子點免疫分析法遠遠優于酶免疫測定。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種量子點免疫熒光定量檢測人抑制素B的試劑盒。
[0006]本發明的另一目的在于提供上述試劑盒在檢測卵巢儲備功能中的應用。
[0007]本發明所采取的技術方案是:
[0008]一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，該試劑盒包括Inhibin-B蛋白標準品,包被Inhibin-B特異性多克隆抗體的酶標板，CdTe量子點標記的Inhibin-B單克隆抗體。[0009]進一步的，上述Inhibin-B蛋白標準品為原核細胞表達的重組蛋白，其氣基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]進一步的，上述Inhibin-B特異性多克隆抗體是以原核表達的Inhibin-B重組蛋白作為免疫原合成的兔抗人Inhibin-B多克隆抗體。
[0011]進一步的，上述Inhibin-B單克隆抗體是以原核表達的Inhibin-B重組蛋白作為免疫原合成的鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體。
[0012]進一步的，本發明試劑盒還包括:標記抗體稀釋液、洗板液、封閉液和樣品稀釋液。
[0013]本發明的有益效果是:
[0014]試劑盒中作為檢測抗體的單克隆抗體，由于采用的量子點標記法具有激發光譜寬，自發熒光弱，熒光穩定和半衰期長等特點，大大的提高了檢測的分辨率、靈敏度和特異性。
[0015]本發明的試劑盒以CdTe量子點標記鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體作為檢測抗體，更好的去除背景信號，提高檢測的分辨率和靈敏度；且通過熒光酶標儀測量熒光強度獲得檢測結果，所發射的熒光譜峰狹窄，自發熒光弱，靈敏度高；熒光強度高，穩定時間長；克服了現有的抑制素B酶免疫檢測試劑盒靈敏度低，特異性差的現狀，提高檢測的分辨率、靈敏度及特異性，更為有效地對早期卵巢儲備功能進行檢測及風險評估。
[0016]本發明用量子點免疫分析法檢測Inhibin-B是先進而有效的方法，能夠有效的提供臨床檢測的分辨率、靈敏度及特異性，且檢測方法操作簡便，實用性強。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1為人Inhibin-B重組蛋白純化前后的western blotting圖片；
[0018]圖2為純化后的兔抗人Inhibin-B多克隆抗體的標準曲線；
[0019]圖3為純化后的鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的標準曲線；
[0020]圖4為Inhibin-B量子點免疫分析檢測試劑盒的檢查區間曲線。
【具體實施方式】
[0021 ] 以下結合具實施例對本發明作進一步說明，但并不局限于此。
[0022]I) Inhibin-B原核表達載體的構建
[0023]選擇Inhibin-B的免疫原區，其基因序列如SEQ ID N0.2所示，共330bp，所對應的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，為Inhibin-B完整氨酸酸序列的N端到C端的第298個至第407個氨基酸，共110個氨基酸。
[0024]設計擴增Inhibin-B免疫原區序列的特異性引物如下:
[0025]EcoR I Up primer:CCGGAATTCGGCCGGACCAACCTCTGTTG (下劃線標記部分為內切酶EcoR I的識別序列)(如SEQ ID N0.3所示，)，
[0026]Xho I Down primer:CCGCTCGAGGGCGCAGCCGCACTCCTCCG (下劃線標記部分為內切酶Xho I的識別序列)(如SEQ ID N0.4所示，)。
[0027]利用氯仿抽提法從卵巢癌細胞總RNA，通過逆轉錄及PCR引物擴增出Inhibin-B免疫原區序列，將擴增后的Inhibin-B序列酶切后連接到PGEX-4T-1原核表達載體上，轉化至DH5a感受態細胞中，用涂布棒將轉化細胞接種到氨芐抗性的LB固體培養基，37°C培養過夜，挑取單克隆菌落并進行小量擴增培養，提取質粒，采用EcoR I和Xho I雙酶切質粒后，瓊脂糖電泳驗證，若能酶切出約300bp的帶，將初步鑒定為含目的基因的菌落，進一步測序驗證，測序正確，即成功獲Inhibin-B的原核重組融合蛋白表達載體，記為pGEX-4T-l-1nhibin-B。
[0028]2) Inhibin-B免疫原的表達及純化
[0029]Inhibin-B目的蛋白的表達
[0030]將pGEX-4T-l-1nhibin-B轉化大腸桿菌RG2，挑取克隆37°C，250rpm震蕩培養直到OD值達到0.4?0.6，在0.5mM IPTG誘導下10°C、150rpm培養過夜，然后5000g離心IOmin收集菌體備用。細菌干沉淀可以保存于_80°C。
[0031]Inhibin-B目的蛋白的表達檢測
[0032]細菌干沉淀中加入適量裂解液，冰浴下超聲裂解菌體超聲過程中保證蛋白始終處于冰浴中，防止超聲過熱影響蛋白穩定。12000rpm,4°C離心,收集上清蛋白，Western Blot鑒定蛋白及檢測蛋白表達量。
[0033]Inhibin-B目的蛋白的分離純化
[0034]細菌干沉淀中加入適量裂解液，冰浴下超聲裂解菌體超聲過程中保證蛋白
[0035]終處于冰浴中，防止超聲過熱影響蛋白穩定。12000rpm，4°C離心，收集上清蛋白，0.44um過濾。將離心收集的蛋白裂解液和預清洗GSH - agarose充分混勻,4°C震蕩共孵育4h。細胞裂解液清洗3次，TBS清洗3次，加入IOmM谷胱甘肽洗脫液洗脫蛋白。洗脫后的蛋白可以通過IOKD的蛋白濃縮柱濃縮蛋白并去除液體中的谷胱甘肽，并用PBS洗滌。純化后的蛋白用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度并通過western blot鑒定其純度(見圖1)。
[0036]二、兔抗人Inhibin-B多克隆抗體制備與鑒定
[0037]I)兔抗人Inhibin-B多克隆抗體制備
[0038]動物免疫
[0039]準備兩只成年兔，將100 μ g抗原/兔溶入Iml磷酸緩沖溶液中待用。在Iml福氏不完全佐劑中加入分枝桿菌制成完全佐劑，并加入Iml抗原溶液，劇烈震蕩使之充分乳化，用3ml注射器抽取該乳化液，接上25G針頭，排除注射器中的氣泡。從籠中取出兔子放在平坦處，在4個不同的部位進行皮下注射，兩處在后背，兩處在大腿處。撫去注射處的兔毛并用乙醇消毒暴露的皮膚。捏出皮膚，將針頭以相對皮膚15度的角度進針，進針深度為Icm?2cm，小心不要刺入肌肉中，在4個不同部位分別注射約500 μ I抗原溶液。注射結束后，將針在注射處放置幾秒鐘后再輕輕拔出，并用乙醇在注射處消毒。在4個部位重復上述操作。每4?6周注射抗原，并在注射后的7天?10天按照收集血液。將收集的血液與注射前收集的血液進行比較，檢查是否有抗體產生。待確定產生抗體后可大量收集血液，但每只兔子收集血液不能多于40ml以防止休克。
[0040]收集血清
[0041]將家兔輕輕放入固定架上，二甲苯涂于耳部血管的上中部，用刀片傾斜45°在該處切出0.23cm?0.3cm的切口使血液能自由的流出。用消毒后的管收集滴出的血液，若在結束之前出現凝固可用溫水輕擦切口處，再繼續收集。收集適量血液后可用消毒后的紗布輕擦患處，輕按患處10秒?20秒確定血流停止后方可。將血液在37°C恒溫箱中放置30分鐘，再在4°C放置過夜。用藥鏟將血凝塊從管壁上撥落，將血液轉移至塑料離心管中，4°C，10，OOOg離心10分鐘，收集上清液即為抗血清，可在-20°c保存數年。
[0042]抗體純化
[0043]將抗血清放入冰水或4°C冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質的聚集。在蛋白質解凍過程中出現的聚集可通過37°C預熱而溶解。加入固體疊氮化鈉至濃度為0.05%,4°C, 15, OOOg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經過濾器過濾除去多余的脂。
[0044]將抗體用TBS緩沖溶液以1:5的比例進行稀釋，再用過濾器進行過濾。以每分鐘0.5ml的速度將抗血清上到柱上，為保證抗血清與填料的結合,需連續上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖溶液清洗柱子至A λ 280nm<0.008后加pH2.7洗脫緩沖溶液，以0.5ml/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。用已經加入IOOul中和緩沖溶液的1.5ml EP管分管收集洗脫液，混勻后用PH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低于7可利用中和緩沖液調至約PH7.4以防止抗體的變性。在柱中加入IOml，ρΗ1.9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至 A λ 280nm〈0.008。
[0045]利用分光光度計測定各管中蛋白質的含量，抗體濃度為2.9mg/ml，將純化的抗體分裝后在2~8°C保存。
[0046]2)抗Inhibin-B多克隆抗體的鑒定
[0047]兔抗人Inhibin-B多克隆抗體靈敏度的初步檢測
[0048]采用間接Elisa 法，將重組蛋白 Inhibin-Β 分別按 lug、lOOng、10ng、lng、lOOpg、IOpgUpg的量進行包被，分別加入按1:500,1:1000,1:2000、1:5000,1:10000稀釋的兔免疫血清作為一抗，加入按1:80000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG作為二抗，TMB顯色，450nm測OD值。以蛋白稀釋度`為橫坐標，以450nm處的OD值為縱坐標，繪出曲線圖，結果顯示1:10000稀釋的血清存在良好的線性關系的檢測區間IOOpg~100ng。
[0049]兔抗人Inhibin-B多克隆抗體的Western blotting鑒定
[0050]將重組蛋白Inhibin-B分別按lng、100pg、10pg、Ipg的量進行SDS-PAGE膠點樣、電泳，孵抗體時，分別加入1:500、1:1000,1:2000倍稀釋的多克隆抗體血清作為一抗，加入I:10000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG作為二抗,通過Western鑒定抗體效價,結果顯示1:2000稀釋的多克隆抗體血清可以很好的識別lng Inhibin-B重組蛋白。
[0051]純化后抗Inhibin-B多克隆抗體的效價測定
[0052]采用間接Elisa法,用重組蛋白Inhibin-B抗原I μ g/100 μ I包被,4?過夜；洗漆后5%脫脂奶粉封閉過夜；將純化的多克隆抗體進行系列稀釋作為一抗，37°C溫育2h ;洗滌后加入1: 50，000稀釋的HRP-標記的山羊抗兔IgG作為二抗，37°C溫育Ih ;洗滌后加底
物顯色并及時終止，測OD45tol值。
[0053]檢測結果如圖2所示，多克隆抗體的效價為1:25600，其中橫坐標為稀釋度的Log值，縱坐標為OD值。
[0054]三、鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體制備與鑒定
[0055]I)鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的制備
[0056]i動物免疫
[0057]將純化的重組人Inhibin-B抗原與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，制成油包水抗原乳劑，SPF級純系BALB/c雌性小鼠6~8周齡，背部皮下多點注射，100 μ g/只，兩星期后用等量抗原加體積相同的弗氏不完全佐劑，進行乳化，免疫。分別于首次免疫后的第2、4、6周末進行加強免疫，每次用相同劑量的目的蛋白。用間接Elisa法檢測血清抗體的效價。細胞融合前3天小鼠尾靜脈注射或腹腔注射100 μ g Inhibin-B蛋白以加強免疫。
[0058]ii小鼠脾細胞的分離
[0059]取加強免疫的BALB/c小鼠，摘眼球采血處死，75%酒精浸泡5?10分鐘，固定于蠟盤；用75%酒精消毒皮膚后，剪開腹部皮膚，暴露腹膜并用75%酒精擦拭消毒；用玻璃注射器吸取無血清DMEM培養液5ml注入小鼠腹腔，用注射器在腹腔內反復抽吸(注意不可刺破小鼠的消化器官)；用該注射器抽出腹腔內液體，注入50ml離心管內；換鑷子，提起腹膜，換剪刀，暴露腹腔，無菌摘取脾臟，小心快速剪去周邊脂肪和筋膜，用無血清DMEM培養液洗I?2次，再將脾放入盛200目銅篩的平皿中，剪破包膜，用注射器芯研磨、擠壓脾細胞過網，吸取無血清DMEM培養液5ml吹打銅篩，收集過網后的脾細胞放入50ml無菌離心管中；將兩離心管lOOOrpm，離心5min ;棄上清，加入5ml無血清DMEM培養液重懸細胞，細胞計數，待用；用完全培養液重懸沉淀的腹腔內巨噬細胞，加入96孔培養板，100 μ I/孔，然后置于37 °C、5%C02培養箱內培養，備用。
[0060]iii SP2/0細胞的復蘇與培養
[0061]從液氮罐中取出含有SP2/0細胞凍存管，立即投入37 °C水浴鍋中，融化后于IOOOrpm離心5?lOmin，棄上清；配制含10%小牛血清的DMEM培養液培養復蘇細胞。將細胞接種于正常BALB/c小鼠背部兩側皮下，待瘤生長至3?5cm左右，即進行無菌摘瘤，用無血清DMEM培養液洗滌3次后，用小剪刀剪成直徑約2mm左右小塊，加入預先加了 2?3ml無血清DMEM培養液的200目銅篩中，用注射器芯研磨、擠壓出單個腫瘤細胞，置含10%FBS的DMEM培養液中常規培養，使細胞維持對數生長期。融合前I天給SP2/0細胞換一次液，調節細胞密度為I?5X 105/ml，融合當天取約I?5X107個SP2/0細胞收集至50ml無菌離心管中，離心棄上清，加入5ml無血清DMEM培養液，混勻，細胞計數，備用。
[0062]IV細胞融合及選擇培養
[0063]將SP2/0細胞與脾細胞按1:5比例混合50ml無菌離心管中，IOOOrpm,離心5min ；棄上清，輕彈管底，使沉淀松動，沿離心管壁緩慢滴加37°C預溫的45%PEG溶液1ml，同時緩慢轉動離心管以混勻細胞，Imin內將PEG4000加完；置37°C水浴中Imin后，再于5min內緩慢加入37°C預溫的無血清DMEM培養液8ml，同時輕輕攪動使細胞成均一的懸液；置37°C水浴中5min后，lOOOrpm，離心5min，棄上清；加入37°C預溫的HAT培養液，輕懸細胞，按IXlO5個脾細胞/孔滴加到含飼養層細胞的96孔細胞培養板中，置于37°C、5%C02培養箱中培養。融合后5?10天可根據克隆生長情況用HAT培養液半量換液；2周后可換HT培養液，3周后可換完全培養液；培養3?5天即可見小克隆出現，雜交細胞較大，呈圓形且透明，其他細胞透光性差并逐漸死亡；培養8?2天，克隆生長至孔底面積的1/3?1/2，此時可取培養上清液，進行抗體檢測；一旦檢測到分泌預定抗體的克隆細胞，及時將陽性克隆轉種到24孔培養板，再進一步轉入培養瓶擴大培養，凍存部分克隆細胞，同時進行克隆化培養。
[0064]V雜交瘤細胞的篩選
[0065]細胞融合后，一旦長出大小適宜的克隆時，應及時選擇靈敏、快速、可靠的免疫學方法篩選分泌預定抗體的雜交細胞克隆。本實驗采用重組人ES抗原的間接Elisa法檢測，其中一抗為雜交瘤細胞的上清液，二抗為HRP-山羊抗鼠IgG (1:80，000)。具體操作步驟同鼠血清效價檢測。
[0066]Vl亞克隆化培養
[0067]克隆化培養對于獲得分泌單一抗體的雜交瘤細胞株至關重要，一般需要進行3?4次亞克隆化培養，以保證分泌性克隆生長的穩定性。采用有限稀釋法，詳細步驟如下:制備飼養層，取正常小鼠腹腔細胞，制成細胞懸液，接種96孔培養板，每孔50 μ 1，約含2 X IO4細胞，37°C、5%C02培養箱中培養過夜；次日用微量移液器吹打雜交瘤細胞培養板中孔內的克隆，懸浮于完全培養液中；取樣，用血球計數板計數，調整細胞濃度分別為20個/ml、5個/ml ;分別將二種密度的雜交瘤細胞懸液接種于含飼養層細胞的培養板中，每孔50μ 1，使每孔分別含2、1、0.5個細胞；置于37°C、5%C02培養箱中培養，一周后加100 μ I培養基。培養12?15天，對有克隆的培養上清進行抗體檢測；對陽性單克隆細胞再克隆化培養，直到100%的克隆分泌特異性抗體為止；同時將陽性克隆進一步擴大培養、凍存。
[0068]vii鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的大量制備及純化
[0069]在細胞培養過程中雜交瘤能產生和分泌單克隆抗體約10?100 μ g/ml。為了獲得大量高效價抗體，通常將雜交瘤細胞植入BALB/c小鼠體內，制備并收集含特異性單克隆抗體的腹水，方法如下:選用8?10周BALB/c雌性小鼠，在接種雜交瘤細胞前I?2周，先給小鼠腹腔注射0.5ml福氏不完全佐劑，預處理過的小鼠在2?3個月均可使用；收集生長良好的雜交瘤細胞，離心洗滌I次，重懸于無血清培養液中，調整細胞密度為I?2 X 106/ml，每只小鼠腹腔注射0.5ml細胞懸液；密切觀察小鼠的健康狀況與腹水征象，接種細胞7?12天，可見小鼠腹部明顯膨大，以手觸摸時，皮膚有緊張感，即可消毒腹部皮膚，用5ml注射器接8號針頭，刺入腹腔，卸下注射器，抬高小鼠頭部，使腹水滴入離心管中；間隔2?3天，待腹水再生積聚后，同法再取，一只小鼠一般可抽取2?3次。3000rpm離心15min，棄去上層油脂、細胞成分和其他沉淀物，吸取淡黃色腹水；采用飽和硫酸銨沉淀法粗純化，ProteinG S印harose4FF親和層析柱法純化雜交瘤細胞腹水，純化后的抗體濃度為1.2mg/ml。
[0070]2)抗Inhibin-B單克隆抗體的鑒定
[0071]i間接Elisa初步檢測抗Inhibin-B單克隆抗體靈敏度
[0072]將重組蛋白Inhibin-B 分別按 lug、lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、Ipg 的量進行包被，分別加入按1:500、1:1000,1:2000,1:4000稀釋的含雜交瘤細胞的腹水作為一抗，力口入1:80000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，TMB顯色，450nm測OD值。以蛋白稀釋度為橫坐標，以OD45tol值為縱坐標，繪出曲線圖，結果顯示1:4000稀釋的腹水存在良好的線性關系的檢測區間IOOpg?lOOng。
[0073]ii鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的Western blotting鑒定
[0074]將重組蛋白Inhibin-B分別按lng、lOOpg、10pg、Ipg的量進行SDS-PAGE膠點樣、電泳，分別加入按1:500、1:1000倍稀釋的單克隆抗體腹水作為一抗，加入1:10000稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，Western檢測抗體效價。檢測結果顯示1:1000稀釋的單克隆抗體腹水可以很好的識別IOOpg Inhibin-B重組蛋白。
[0075]iii純化后抗Inhibin-B單克隆抗體的效價測定
[0076]采用間接Elisa法，用重組人ES抗原I μ g/100 μ I包被，4°C過夜；洗滌后5%脫脂奶粉封閉過夜；純化后將單克隆抗體進行系列稀釋作為一抗，37°C溫育2h ;洗滌后將1:80, 000稀釋的HRP-標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，37°C溫育Ih ;洗滌后加底物顯色并及時終止，測OD45tlnm值。檢測結果如圖3所示，單克隆抗體的效價為1:512。
[0077]iv鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的免疫球蛋白類別及亞型鑒定
[0078]參照Sigma公司抗體亞型檢測試劑盒說明書,采用Antigen-Mediated Elisa法測定單克隆抗體的Ig類別和亞型。
[0079]四、量子點標記
[0080]I) CdTe量子點的合成
[0081]CdCl2.2.5H20 (2.5X ΙΟΛιοΙ)溶于25ml的超純水中，加入谷胱甘肽GSH(3Xl(T4mol)，二水合檸檬酸三鈉(0.lg),Na2TeO3 (0.5X ΙΟΛιοΙ)和 NaBH4 (2.4Χ ΙΟΛιοΙ)，在磁力攪拌的條件下用NaOH調節pH到10.5，所有反應都是在室溫環境下，Cd2+、TeO32 一和GSH的摩爾比為5:1:6，放入帶回流的微波裝置中(功率設為600W)，當溶液顏色變成淡綠色時開始回流，隨著回流時間的不同形成一系列不同粒徑的以谷胱甘肽為穩定劑的量子點。選擇合適的量子點將反應后的溶液冷卻至室溫后用無水乙醇進行沉淀，在4000rpm的條件下離心5min。去除上清中過量的Cd2+、Te032 —等雜質，重復3遍，待乙醇完全揮發后，將沉淀重懸于ρΗ7.4的PBS中。
[0082]2) CdTe量子點與鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體的偶聯及純化(量子點標記的二抗)
[0083]取上述濃度的量子 點(008)0(^60(^1，加入18ul的EDC (lmg/ml)和800 μ I的甲醇混合后避光震蕩30min，再加入8ul的β —巰基乙醇進行終止，取0.75mg的二抗用PBS稀釋至適當體積加入活化的QDs中與之混合，避光震蕩2h，反應結束后再加入巰基乙醇穩定量子點，進行透析。透析后在16300g條件下離心3min，去除上清，沉淀(即為純化的偶聯有量子點的Inhibin-B重組蛋白抗體)重懸于PBS中，4°C保存。
[0084]經過間接ELISA法檢測發現標記二抗在1:10000的稀釋條件下檢測效果最好。
[0085]所有所述的間接Elisa法的具體步驟為:
[0086]a包板:pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋抗原至最適濃度I μ g/孔，且100 μ I/孔，放入濕盒，4°C過夜；
[0087]b封閉:次日棄去包被液，PBST洗滌酶標反應孔4次，每次5min，甩干，5%牛血清白蛋白300 μ I/孔封閉，放入濕盒，4°C過夜；
[0088]c棄去封閉液，同上洗滌，PBS倍比稀釋兔血清樣品100μ I/孔，同時設立空白，陽性和陰性對照，37°C濕盒溫育1.5h ;
[0089]d棄去血清樣品，同上洗滌，PBS稀釋成1:80，000的HRP-山羊抗兔IgGlOO μ I/孔，37°C溫育 Ih ；
[0090]e棄去酶標二抗，同上洗滌，TMB顯色，底物A和B各50 μ I/孔，37 °C避光顯色IOmin,每孔加入50 μ L2mol/L H2SO4終止液，全自動酶標儀測定OD45tlnm值。
[0091]五、基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B試劑盒及其檢測方法
[0092]I)試劑盒檢測方法
[0093]利用純化的兔抗人Inhibin-B多克隆抗體作為捕獲抗體，偶聯有量子點的鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體作為檢測抗體，建立Inhibin-B的單抗和多抗雙夾心量子點檢測法。
[0094]i酶標板的包被及封閉
[0095]pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋多克隆抗體至最適濃度I μ g/孔，且100 μ I/孔，放入濕盒，4°C過夜；次日棄去包被液，PBST洗滌酶標反應孔4次，每次5min，甩干，5%牛血清白蛋白300 yl/孔封閉，放入濕盒或干燥的金屬薄袋內，4°C過夜。
[0096]ii標準品或被檢血清的處理
[0097]Inhibin-B蛋白標準品(陽性標準品)或被檢血清用樣品稀釋液(含1%BSA和0.05%的吐溫-20的PBS)做適當比例的稀釋，不加血清的樣品稀釋液作為陰性標準品，IOOiU/孔，37°C反應I小時后用洗板液洗板3次，將酶標板拍干。
[0098]iii單克隆抗體檢測
[0099]Inhibin-B單克隆抗體1:5000稀釋后使用，現配現用。100 iil/孔，37°C反應I小時后用洗板液洗板3次，拍干后加入IOOiU PBS0將處理好的酶標板經由熒光酶標儀測定熒光強度值。建立標準曲線，得到檢測限。
[0100]2)試劑盒性能指標檢測
[0101]i試劑盒的檢測區間
[0102]取包被好兔抗人Inhibin-B多克隆抗體并進行封閉的酶標板,將Inhibin-B蛋白標準品做適當比例的稀釋，每個樣品做3個重復孔。IOOiU/孔，37°C反應I小時后用洗板液洗板3次，將酶標板拍干。用PBS稀釋鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體1:10000稀釋后使用，現配現用，IOOiU/孔，37°C反應I小時后用洗板液洗板3次，拍干后加入IOOiU PBS,將處理好的酶標板經由熒光酶標儀測定熒光強度值。檢測數據如下表1所示，以不同濃度的Inhibin-B的標準品蛋白為橫坐標，以相應的突光強值為縱坐標,繪制曲線如圖4所示，本試劑盒具有良好的線性關系的檢測區間為0.14pg/ml~213.28ng/ml，在該區間的標準曲線方程為 y=2.9179x+271.51 (R2=0.9931)。
[0103]表1Inhibin-B量子點免疫分析檢測試劑盒可檢測的蛋白濃度區間
[0104]
【權利要求】
1.一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包括Inhibin-B蛋白標準品,包被Inhibin_B特異性多克隆抗體的酶標板，CdTe量子點標記的Inhibin-B單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:所述的Inhibin-B蛋白標準品為原核細胞表達的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.根據權利要求1所述的一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:所述的Inhibin-B特異性多克隆抗體是以原核表達的Inhibin-B重組蛋白作為免疫原合成的兔抗人Inhibin-B多克隆抗體。
4.根據權利要求1所述的一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:所述的Inhibin-B單克隆抗體是以原核表達的Inhibin-B重組蛋白作為免疫原合成的鼠抗人Inhibin-B單克隆抗體。
5.根據權利要求1所述的一種基于量子點的雙夾心免疫熒光定量檢測人Inhibin-B的試劑盒，其特征在于:該試劑盒還包括:標記抗體稀釋液、洗板液、封閉液和樣品稀釋液。
【文檔編號】G01N33/68GK103728457SQ201310740120
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月25日 優先權日:2013年12月25日
【發明者】夏曦, 胡向明, 郭忠振, 黎俊青 申請人:李志榮
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
