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一種電化學(xué)生物傳感器及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種電化學(xué)生物傳感器，通過(guò)液液界面法合成單分散金納米薄膜并修飾到ITO電極表面并進(jìn)一步修飾乙酰膽堿酯酶和殼聚糖，得到復(fù)合電化學(xué)生物傳感器。該電化學(xué)生物傳感器可以用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥中甲胺磷，具有較寬的檢測(cè)范圍，低檢出限，良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，并可用于蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷殘留的實(shí)樣檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】一種電化學(xué)生物傳感器及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物電化學(xué)傳感器【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地涉及一種電化學(xué)生物傳感器及其 應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 中國(guó)農(nóng)業(yè)儀器網(wǎng)曾經(jīng)報(bào)道陜西省對(duì)蔬菜中有機(jī)磷農(nóng)藥的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)甲胺磷排在檢 出率與超標(biāo)率前五位，這說(shuō)明我國(guó)蔬菜農(nóng)藥殘留問(wèn)題依然很?chē)?yán)重。利用高效液相色譜/質(zhì) 譜聯(lián)用（HPLC-MS)或者氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS)檢測(cè)的缺點(diǎn)在于：分析時(shí)間長(zhǎng)、儀器 設(shè)備昂貴、需要專業(yè)技術(shù)人員操作、不適合現(xiàn)場(chǎng)操作。電化學(xué)檢測(cè)快速、靈敏、簡(jiǎn)便，因此利 用甲胺磷抑制乙酰膽堿酯酶對(duì)底物乙酰膽堿的催化活性而構(gòu)建的電化學(xué)生物傳感器得到 普遍石開(kāi)究。Liu 等（Xiao T, Ju HX, Chen HY. Direct electrochemistry of horseradish peroxidase immobilized on a colloid/cysteamine-modified gold electrode. Anal. Biochem,2000,278(1) :22-28
[0003] Liu SQ, Ju HX. Reagentless glucose biosensor based on direct electron transfer of glucose oxidase immobilized on colloidal gold modified carbon paste electrode. Biosens· Bioelectron·，2003,19 (3) : 177-183)，分析了納米金提高傳感器性能 的原因，認(rèn)為體系中納米金可以提高酶的生物活性，增強(qiáng)酶與底物分子之間的作用。納米金 固定酶時(shí)具有表面反應(yīng)活性高、吸附能力強(qiáng)、比表面積大、催化效率高、表面活性中心多等 特點(diǎn)，已經(jīng)成為固定化載體的重要研究對(duì)象。但現(xiàn)有的傳感器檢測(cè)范圍較窄，穩(wěn)定性和重現(xiàn) 性差，不適宜用于蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷殘留的實(shí)樣檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種電化學(xué)生物傳感器，通 過(guò)在ΙΤ0電極表面修飾金納米薄膜并進(jìn)一步依次吸附乙酰膽堿酯酶和殼聚糖，從而使得到 的復(fù)合電極能夠用于檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷殘留，具有檢測(cè)范圍寬，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好的。
[0005] 技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提出一種電化學(xué)生物傳感器，該傳感器通 過(guò)如下步驟制備得到：
[0006] (1)用液液界面法在有機(jī)相和水相界面間合成單分散金納米薄膜；
[0007] (2)清洗ΙΤ0電極并烘干，然后浸入到步驟（1)中的水相中通過(guò)提拉將單分散金納 米薄膜覆蓋在所述ΙΤ0電極上，得到單分散金納米薄膜修飾的ΙΤ0,即Au/ITO電極；
[0008] (3)將步驟（2)得到的Au/ITO電極浸泡在乙酰膽堿酯酶溶液中，使乙酰膽堿酯酶 吸附到單分散金納米薄膜表面上，洗滌，得到AChE/Au/ΙΤΟ傳感器。
[0009] 為了減低金納米薄膜與ΙΤ0電極剝離的可能性，在得到的AChE/Au/ITO傳感器表 面進(jìn)一步滴涂殼聚糖溶液，得到Chi/AChE/Au/ΙΤΟ傳感器。
[0010] 其中，步驟（1)中，液液界面法合成單分散金納米薄膜的步驟為：首先將？?4與 HAuC14反應(yīng)形成Au (PPh3) C1，然后將其轉(zhuǎn)移到甲苯中形成有機(jī)相溶液；其次，將CTAB和 NaOH溶解到H20中形成水相溶液，并將N2H4 · H20加入到水相中作為還原劑；然后將上述有 機(jī)相溶液緩緩加入到水相溶液中，當(dāng)界面出現(xiàn)紫色時(shí)表明反應(yīng)開(kāi)始進(jìn)行，反應(yīng)在50?60°C 恒溫條件下進(jìn)行10?12h，隨著反應(yīng)進(jìn)行，界面的顏色逐漸加深，最后在界面上形成單分散 金納米薄膜。
[0011] 步驟（3)中，乙酰膽堿酯酶溶液的濃度為0· 020?0· 040g/L，浸泡條件為在0? 8°C下浸泡6?12h。
[0012] 優(yōu)選地，步驟（3)中，所述的AChE/Au/ITO傳感器用0· Imol/LpH = 7. 0的PBS緩 沖液進(jìn)行洗滌。
[0013] 在殼聚糖修飾的過(guò)程中，優(yōu)選地，所述的殼聚糖溶液的濃度為0. 1?0. 5wt%，滴 加的量為每mm2 ΙΤ0電極滴加0. 25?0. 3 μ 1。
[0014] 優(yōu)選地，上述傳感器中，所述的ΙΤ0電極的大小為3mmX6mm。該尺寸的大小取決于 制備金膜的菌種瓶大小有關(guān)，也和發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)的電解槽大小有關(guān)。可以根據(jù)實(shí)際需要 對(duì)尺寸進(jìn)行選擇。
[0015] 本發(fā)明進(jìn)一步提出了上述的電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥中甲胺磷的應(yīng) 用。
[0016] 有益效果：本發(fā)明得到的AChE/Au/ITO傳感器在檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷時(shí)，具有 較寬的檢測(cè)范圍，低檢出限，良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，并可用于蔬菜有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷殘留 的實(shí)樣檢測(cè)。本傳感器可以快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留，避免食用殘留超標(biāo)農(nóng)產(chǎn)品而引起的 中毒事件，為農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)提供技術(shù)保障。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為界面法合成金納米粒子（AuNPs)和單分散Au-AChE納米復(fù)合膜的FESEM圖， 其中，（a)AuNPs (低倍）；(b)AuNPs (高倍）；（c)單分散Au-AChE納米復(fù)合膜；
[0018] 圖2為電極在不同溶液中的循環(huán)伏安曲線圖，其中，（a)為Au/ITO電極在8mmol/ LATC1中的循環(huán)伏安曲線；(b)為Au/IT0電極0. lmol/LPBS (pH 7. 0)中的循環(huán)伏安曲線； (c)為AChE/Au/ITO在8mmol/LATCl中的循環(huán)伏安曲線；
[0019] 圖3為AChE/Au/ITO分別在（a) 0和（b) 10 μ g/mL甲胺磷標(biāo)準(zhǔn)溶液中的循環(huán)伏安 曲線；
[0020] 圖4為AChE/Au/ITO對(duì)不同濃度甲胺磷的CV響應(yīng)（從a至1分別為0. 005、0. 02、 0· 05、0· 2、0· 5、1· 5、5、5、10、25、50、100μ gmL-1，其中交點(diǎn)處即為 5μ gmL-1 濃度對(duì)應(yīng)的值）；
[0021] 圖5為AChE/Au/ITO對(duì)甲胺磷檢測(cè)的線性關(guān)系。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下通過(guò)具體的實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明但不用于限制本發(fā)明。
[0023] 本發(fā)明的電化學(xué)生物傳感器的制備方法及應(yīng)用步驟如下：
[0024] (1)構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器：
[0025] A)利用液液界面法在有機(jī)相-水相界面間合成單分散金納米薄膜：
[0026] 首先將 1. 9mg PPh3 加入到 25μ L 0· 24mol/L HAuC14 中反應(yīng)形成 Au(PPh3)Cl，然后 將其轉(zhuǎn)移到5. OmL甲苯中形成有機(jī)相溶液；其次，將0. 8mg CTAB (十六烷基三甲基溴化銨） 和2mg NaOH溶解到8mL H20中形成水相溶液，并將25 μ LN2H4 · H20加入到水相中作為還原 齊U;然后將有機(jī)相緩緩加入到水相中。當(dāng)界面出現(xiàn)紫色時(shí)表明反應(yīng)開(kāi)始進(jìn)行。反應(yīng)在60°C 恒溫條件下進(jìn)行12h，隨著反應(yīng)進(jìn)行，界面的顏色逐漸加深，最后在界面上形成了單分散薄 膜。
[0027] Β) ΙΤ0電極的修飾：首先將ΙΤ0 (氧化銦錫）電極裁剪成面積大約為3mmX6mm，用 水洗滌、超純水洗滌，烘干密封保存。將清洗后ΙΤ0電極浸入到步驟（A)的水相中通過(guò)提拉 將單分散納米薄膜覆蓋到ΙΤ0電極表面，得到單分散金納米薄膜修飾的ΙΤ0,即Au/ITO電 極，然后將有序的單分散金納米薄膜修飾的ΙΤ0 (即Au/ITO電極）浸泡在新配制的0. 024g/ L乙酰膽堿酯酶（AChE)溶液中，在4°C下浸泡12 h使AChE吸附到單分散金納米薄膜上， 從而得到AChE/Au/ITO電極（傳感器）。得到的AChE/Au/ITO電極（傳感器）用0· lmol/ LpH = 7. 0的PBS洗滌。最后在電極表面滴涂0. 1 %的殼聚糖溶液（Chi)，緩慢滴5微升得 到Chi/AChE/Au/ITO電極（傳感器），所有電極在使用之前都儲(chǔ)存在4°C冰箱中。
[0028] 構(gòu)建原理：固定于電極表面的Au-AChE納米復(fù)合膜中的AChE催化氯化乙酰膽堿 (ATC1)水解生成硫代膽堿，硫代膽堿在特定電位下產(chǎn)生氧化峰電流。有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷對(duì) AChE有抑制作用，當(dāng)溶液中有機(jī)磷農(nóng)藥甲胺磷增多時(shí)，AChE催化ATC1水解生成硫代膽堿量 減少，氧化峰電流下降。
[0029] C)產(chǎn)品的表征：對(duì)液液界面法合成的金納米粒子和單分散Au-AChE納米復(fù)合膜 進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1所示。其中，圖（a)為金納米粒子低倍鏡下的FESEM圖，圖（b)為為 金納米粒子高倍鏡下的FESEM圖，圖（c)為單分散Au-AChE納米復(fù)合膜的FESEM圖。從 (a)中可以看出AuNPs生長(zhǎng)得枝繁葉盛，枝葉之間具有空隙，這樣的Au NPs膜比表面積大， 分散性好。從（b)中可以看出納米粒子呈片狀生長(zhǎng)，片層上有不規(guī)則似魚(yú)鱗形狀的花紋， 直徑大約在25?30nm之間。這與Munaiz等研究發(fā)現(xiàn)金納米粒子的尺寸在20nm時(shí)電化 學(xué)響應(yīng)最好相符合（Escosura-Muniz A，Parolo C，Maran F，Mekogi A. Size-dependent direct electrochemical detection of gold nanoparticles ：application in magneto immunoassay s. Nanoscale，2011，3 (8) :3350-3356)。同時(shí)在片層上還生長(zhǎng)著類(lèi)似就 魚(yú)須上的小乳突，乳突大多在垂直于片層的方向上生長(zhǎng)，少數(shù)有傾斜，長(zhǎng)度在20?60nm之 間。從（c)中可以看出納米粒子好像被覆蓋了一層凝膠，小乳突將凝膠鼓起，外形酷似仙人 掌表面，說(shuō)明金膜已經(jīng)被AChE和殼聚糖包裹。
[0030] (2)建立檢測(cè)方法：將制備的Chi/AChE/Au/ITO電極電極浸入不同濃度的甲胺磷 標(biāo)準(zhǔn)溶液中8min，然后轉(zhuǎn)移到電解池中。電解液是pH = 7. 0,8mmol/LATCl的PBS緩沖體 系，電解池中配置三電極體系，在0?IV進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。并根據(jù)下面公式計(jì)算甲胺磷 對(duì)酶的抑制率：
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 一種電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，其通過(guò)如下步驟制備得到： (1) 用液液界面法在有機(jī)相和水相界面間合成單分散金納米薄膜； (2) 清洗ITO電極并烘干，然后浸入到步驟（1)中的水相中通過(guò)提拉將單分散金納米薄 膜覆蓋在所述ITO電極上，得到單分散金納米薄膜修飾的ITO,即Au/ITO電極； (3) 將步驟（2)得到的Au/ITO電極浸泡在乙酰膽堿酯酶溶液中，使乙酰膽堿酯酶吸附 到單分散金納米薄膜表面上，洗滌，得到AChE/Au/ITO傳感器。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，在得到的AChE/Au/IT0傳感 器表面進(jìn)一步滴涂殼聚糖溶液，得到Chi/AChE/Au/ITO傳感器。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，步驟（1)中，液液界面法合 成單分散金納米薄膜的步驟為：首先將PPh 3與HAuC14反應(yīng)形成Au(PPh3)Cl，然后將其轉(zhuǎn)移 到甲苯中形成有機(jī)相溶液；其次，將CTAB和NaOH溶解到H 20中形成水相溶液，并將Ν2Η4 ·Η20 加入到水相中作為還原劑；然后將上述有機(jī)相溶液緩緩加入到水相溶液中，當(dāng)界面出現(xiàn)紫 色時(shí)表明反應(yīng)開(kāi)始進(jìn)行，反應(yīng)在50?60°C恒溫條件下進(jìn)行10?12h，隨著反應(yīng)進(jìn)行，界面 的顏色逐漸加深，最后在界面上形成單分散金納米薄膜。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，步驟（3)中，乙酰膽堿酯酶 溶液的濃度為〇. 020?0. 040g/L，浸泡條件為在0至8°C下浸泡6至12h。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，步驟（3)中，所述的AChE/ Au/ITO傳感器用0· lmol/L pH = 7. 0的PBS緩沖液進(jìn)行洗滌。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，所述的殼聚糖溶液的濃度 為(λ 1?0· 5wt%，滴加的量為每mm2IT0電極滴加 (λ 25?(λ 3μ 1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1?6任一項(xiàng)所述的電化學(xué)生物傳感器，其特征在于，所述的ITO電極 的大小為3mmX6mm。
8. 權(quán)利要求1或2所述的電化學(xué)生物傳感器在檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥中甲胺磷的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】G01N27/327GK104280438SQ201410468306
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年9月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月15日
【發(fā)明者】苗向陽(yáng), 郁惠珍, 戴志暉 申請(qǐng)人:蘇州健雄職業(yè)技術(shù)學(xué)院