制備抗Lp（a）多克隆抗血清的方法及多克隆抗血清的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種制備高特異性的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法，該方法包括采用Seq?ID?No.1所示序列的抗原通過動物免疫制備獲得抗Lp（a）多克隆抗血清。本申請的制備高特異性的抗Lp（a）多克隆抗血清的方法克服了傳統方法的血漿來源困難、社會供給不足的問題；并且，所制備的抗Lp（a）多克隆抗血清效價高，特異性強，不會與LDL或PLG發生交叉反應，從而提高了Lp(a)檢測的準確性和有效性，為Lp(a)檢測的推廣應用奠定了基礎。
【專利說明】制備抗Lp (a)多克隆抗血清的方法及多克隆抗血清
【技術領域】
[0001] 本申請涉及免疫檢測領域，特別是涉及一種制備高特異性的抗Lp (a)多克隆抗血 清的方法，以及有該方法制備的抗Lp (a)多克隆抗血清。
【背景技術】
[0002] 血漿脂蛋白按密度分為四大類：乳糜微粒（縮寫，CM)、極低密度脂蛋白（縮寫， VLDL)、低密度脂蛋白（縮寫，LDL)和高密度脂蛋白（縮寫，HDL)。同時，在血漿中還存在一 類特殊的脂蛋白：脂蛋白（a)(縮寫，Lp(a))，它是一個獨立的脂蛋白系統。Lp(a)的脂質成 分與LDL相似，主要由膽固醇脂和甘油三酯組成，表面被覆一層磷脂和游離膽固醇，甘油三 酯的組份大于LDL，Lp(a)與LDL均是膽固醇轉移蛋白的底物。Lp(a)含有兩類載脂蛋白： ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，前者與LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，ΑροΒΙΟΟ上有LDL受體結合位點；后者是 Lp (a)的獨特載脂蛋白，ΑροΒ 100和Apo (a)通過1至2個二硫鍵共價相連。
[0003] 從Apo (a)的N-末端到C-末端，所有的Kringle域通過兩兩之間的大約30個氨 基酸的中間序列依次相連。除最靠近C端的Kringle域與纖溶酶原中的Kringle5同源外， 其余Kringle域均與纖溶酶原中的Kringle4同源，并依次被命名為Kringle IV 1?10型； 需要說明的是，人類Apo (a)與人纖維蛋白溶酶原（英文名，Plasminogen.縮寫，PLG)在DNA 和蛋白質水平均存在80%的同源性，從而具有共同的抗原決定簇，呈免疫交叉反應。在所有 這10型的Kringle IV中，不同個體的Kringle IV 2型的串聯重復數一般在3?43之間變 化，因此Apo (a)的分子量也就在250?838kD的范圍中變化，其體積與分子量在相同的個 體內或不同的個體間都具有較大的差異，因其這種特性，決定了 Lp(a)在不同的個體間具 有較大的差異。Kringle IV 9型中有7個半胱氨酸，其中未參與分子內二硫鍵的第4057位 半胱氨酸（縮寫，Cys4057)與載脂蛋白B-100中的第4326位半胱氨酸（縮寫，Cys4326)形 成分子間二硫鍵，進而組成完整的Lp (a)。
[0004] Lp(a)是動脈粥樣硬化的獨立危險因素，是冠心病（CHD)、心肌梗塞（MI)、腦卒中、 動脈重新狹窄的危險因子。另外，Lp (a)水平可作為慢性腎功能衰竭合并心腦血管病及血栓 形成的預示指標。Lp(a)的血清水平受遺傳因素的高度影響，個體差異很大，主要由Apo(a) 基因決定，因種族而異，與性別、年齡無關，不易受環境，生活方式和一般降脂藥物的干擾， 僅能夠被腎衰、急性免疫反應輕微影響。一般把人血清Lp (a)正常值定為<300mg/L。因此， Lp (a)的檢測對臨床分析和病理分析具有重要的參考價值。
[0005] 目前，已知的檢測Lp (a)濃度的方法有酶聯免疫法、放射免疫法、熒光免疫測定法 和免疫比濁法，以上免疫檢測方法均需要特異性強的Lp(a)抗血清/抗體作為核心原料。目 前基本上都是采用提純人血清的方法制備免疫原Lp (a)或Apo (a)，即利用超高速離心機通 過密度梯度離心制取Lp (a)，或者利用SDS-PAGE電泳分離獲得Apo (a)抗原；再利用抗原免 疫動物獲得抗血清。如前面分析，因為Lp (a)含有兩類載脂蛋白：ΑροΒΙΟΟ和Apo (a)，其中 ΑροΒΙΟΟ與LDL的ΑροΒΙΟΟ相同，所以利用Lp (a)作為免疫原制備的抗血清會與LDL存在免 疫交叉反應。而利用Apo (a)作為免疫原，因Apo (a)的氨基酸結構與PLG很相似，而PLG是 一種以較高濃度存在于人血液中的蛋白質，因此，利用Apo (a)作為免疫原制得的抗血清會 因與PLG發生交叉反應。因此，無論是Lp (a)還是Apo (a)作為抗原制備的抗血清都無法準 確地測定Lp (a)含量。并且，采用提純人血清的方法制備免疫原Lp (a)或Apo (a)所需血漿 來源困難、社會供給不足；制備的抗血清不僅會與LDL或PLG有交叉反應，特異性較差；而 且，抗血清的效價也不高。
【發明內容】
[0006] 本申請的目的是提供一種制備抗Lp (a)多克隆抗血清的方法，以及由該方法制備 的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0007] 為了實現以上目的，本申請的一方面公開了一種制備高特異性的抗Lp (a)多克隆 抗血清的方法，該方法包括采用Seq ID No. 1所示序列的抗原通過動物免疫制備獲得所述抗 Lp (a)多克隆抗血清。
[0008] 優選的，動物免疫包括選擇青壯年時期并對Apo(a)易感的山羊或兔子，以濃度為 l-5mg/mL的Seq ID No. 1所示序列的抗原進行多點多次免疫，直至抗體效價達到預期值后， 頸動脈放血提取純化本申請的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0009] 優選的，Seq ID No. 1所不序列的抗原為提純的克隆表達的融合蛋白；克隆表達具 體包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為插入片段構建質粒，將構建的質粒進行轉化 和融合蛋白表達，然后提純獲得Seq ID No. 1所不序列的抗原。
[0010] 進一步的，Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為PCR擴增的產物，PCR擴增具體包括 采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的引物，以LPA基因為模板進行PCR擴 增。
[0011] 本申請的另一面還公開了本申請的制備方法制備的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0012] 本申請的再一面還公開了一種制備高特異性的抗Lp (a)多克隆抗血清的抗原，該 抗原含有Seq ID No. 1所不序列；并且，該抗原為提純的克隆表達的融合蛋白；其中，克隆表 達具體包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為插入片段構建質粒，將構建的質粒進行 轉化和融合蛋白表達，然后提純獲得抗原。
[0013] 優選的，Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為PCR擴增的產物，PCR擴增具體包括 采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的引物，以LPA基因為模板進行PCR擴 增。
[0014] 本申請的再一面還公開了本申請的抗Lp (a)多克隆抗血清，和本申請的抗原在 Lp (a)檢測中的應用。
[0015] 本申請的再一面還公開了一種檢測Lp(a)濃度的方法，該述方法包括采用本申請 的抗Lp (a)多克隆抗血清，進行酶聯免疫法、放射免疫法、熒光免疫測定法和免疫比濁法中 的至少一種。
[0016] 本申請的再一面還公開了一種用于Lp (a)檢測的試劑盒，該試劑盒中含有本申請 的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0017] 由于采用以上技術方案，本申請的有益效果在于：
[0018] 本申請的制備高特異性的抗Lp (a)多克隆抗血清的方法克服了傳統方法的血漿 來源困難、社會供給不足的問題；并且，所制備的抗Lp (a)多克隆抗血清效價高，特異性強， 不會與LDL或PLG發生交叉反應，從而提高了 Lp (a)檢測的準確性和有效性，為Lp (a)檢測 的推廣應用奠定了基礎。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019] 圖1 :是本申請實施例中克隆片段的PCR擴增結果圖，其中Μ為marker，l和2為 PCR擴增產物樣品；
[0020] 圖2 :是本申請實施例中收集的融合蛋白的SDS-PAGE檢測結果圖，其中marker為 蛋白質分子量標，apo (a)為受檢樣品；
[0021] 圖3 :是本申請實施例中收集的融合蛋白的WESTERN-BLOT分析結果圖，其中 marker為蛋白質分子量標，apo (a)為受檢樣品；
[0022] 圖4 :是本申請實施例中融合蛋白純化后再次進行SDS-PAGE檢測的結果圖，其中A 為電泳結果圖，B為基于電泳結果的數值分析圖。
【具體實施方式】
[0023] 本申請采用的抗原針對性的制備出了僅能與Lp (a)進行免疫反應的抗Lp (a)多 克隆抗血清，該抗Lp (a)多克隆抗血清不會與LDL和PLG存在免疫交叉反應。只要采用本 申請的抗原即可獲得本申請的特異性強的效果，可以理解，抗原的獲取方法有很多種，而本 申請的一種優選方案是，克隆表達融合蛋白，提取所需抗原，這種方法獲得的抗原純度高， 針對性強。而獲得克隆表達融合蛋白的方法是將外源片段插入到載體中進行轉化表達，可 以理解，外源插入片段同樣可以采用化學合成或者直接從基因組中提取或者采用PCR擴增 獲得，本申請的優選方案中，采用PCR擴增獲得外源插入片段；為此，本申請還特別設計了 特異性的引物。
[0024] 本申請中，在動物免疫時采用多點多次免疫，使抗體效價達到預期值后再提取純 化，從而使得制備的抗Lp (a)多克隆抗血清效價高，能夠很好的滿足使用要求。其中，多點 多次免疫是指，分多次對免疫動物的背部、頸部、腋窩皮下結合皮內進行多點注射；抗體效 價達到預期值是指根據實驗設計，預期達到的效價，這是根據實驗材料和實驗目的設定的， 在此不作具體限定，比如期望制備出更高效價的抗Lp (a)多克隆抗血清，則抗體效價預期 值可以高些，對免疫動物多進行幾次注射，不過，需要注意的是效價并不是無限次增加的。
[0025] 本申請的一個關鍵在于采用克隆表達方法獲得高效、準確的抗原，從而制備出高 特異性的抗血清。為了使用方便，本申請進一步的，將本申請的高特異性的抗Lp (a)多克 隆抗血清制備成便于保存的固體或高濃度溶液，從而制備成試劑盒以方便Lp (a)免疫檢測 使用。
[0026] 需要說明的是，雖然克隆表達的原理是已知的，并且，克隆表達制備抗原在多克隆 抗體制備中的應用也是蛋白免疫檢測領域比較常用的；但是，目前并沒有采用克隆表達方 法制備抗Lp (a)多克隆抗血清的研究，至少，這方面的研究不甚理想；正是如此，本申請為 了填補該漏洞，通過對Lp (a)蛋白基因進行研究，創造性的基于LPA基因設計了特異性引 物，通過該特異性引物構建可用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清制備的質粒，從而制備出特 異性強、效價高的抗Lp (a)多克隆抗血清。
[0027] 本申請的一個關鍵點在于所選擇的克隆片段以及特異性的引物序列，可以理解， 對于本申請的用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的質粒來說，插入片段是其重點，因此，理論 上實驗室常規使用的原核表達載體，比如PET系列載體、pGEM-T系列載體等都適用于本申 請；本申請的優選實施方案中選擇的是pet28a+。
[0028] 另外，在進行轉化、表達的過程中，同樣，目前實驗室常規使用的原核表達細胞，如 大腸桿菌、凝結芽孢桿菌、枯草芽胞桿菌和鏈霉菌等都適用于本申請，其中，大腸桿菌中常 規使用的HB101，BL21，JM109和DH5a等也可以用于本申請的融合蛋白表達。當然，原核 表達細胞的選擇要和選擇的載體相符。另外，可以理解，除了可以采用原核表達細胞體系以 夕卜，實驗室常規使用的真核細胞表達體系同樣適用于本申請，比如釀酒酵母、畢赤巴斯德酵 母等。
[0029] 下面通過具體實施例并結合附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅僅對 本申請進行進一步的說明，不應理解為對本申請的限制。
[0030] 一、材料與方法
[0031] 1、載體構建及轉化
[0032] (1)引物設計
[0033] 經過大量的分析，本申請以人LPA基因為研究對象，選取基因序列號： NM_005577. 2, X06290. 1的序列中第12050-12990位片段，共941bp的片段進行克隆表達，并 設計其特異性引物，引物序列如表1所示。所設計的引物在生物試劑公司合成。
[0034] 表1用于制備抗Lp (a)多克隆抗血清的引物
【權利要求】
1. 一種制備高特異性的抗Lp (a)多克隆抗血清的方法，其特征在于：所述方法包括采 用Seq ID No. 1所示序列的抗原通過動物免疫制備獲得所述抗Lp (a)多克隆抗血清。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述動物免疫包括選擇青壯年時期并對 Apo(a)易感的山羊或兔子，以濃度為l-5mg/mL的所述抗原進行多點多次免疫，直至抗體效 價達到預期值后，頸動脈放血提取純化所述抗Lp (a)多克隆抗血清。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述Seq ID No. 1所示序列的抗原為 提純的克隆表達的融合蛋白；所述克隆表達包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為插 入片段構建質粒，將所述質粒進行轉化和融合蛋白表達，然后提純獲得所述Seq ID No. 1所 示序列的抗原。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于：所述Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為 PCR擴增的產物，所述PCR擴增包括采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的 引物，以LPA基因為模板進行PCR擴增。
5. 根據權利要求1-4任一項所述的方法制備的抗Lp (a)多克隆抗血清。
6. -種制備高特異性的抗Lp(a)多克隆抗血清的抗原，其特征在于：所述抗原含有Seq ID No. 1所示序列；所述抗原為提純的克隆表達的融合蛋白；所述克隆表達包括采用Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為插入片段構建質粒，將所述質粒進行轉化和融合蛋白表達，然 后提純獲得抗原。
7. 根據權利要求6所述的抗原，其特征在于：所述Seq ID No. 2所示序列的DNA片段為 PCR擴增的產物，所述PCR擴增包括采用Seq ID No. 3所示序列和Seq ID No. 4所示序列的 引物，以LPA基因為模板進行PCR擴增。
8. 根據權利要求5所述的抗Lp (a)多克隆抗血清或者權利要求6或7所述的抗原在 Lp (a)檢測中的應用。
9. 一種檢測Lp (a)濃度的方法，其特征在于：所述方法包括采用權利要求5所述的抗 Lp (a)多克隆抗血清，進行酶聯免疫法、放射免疫法、熒光免疫測定法和免疫比濁法中的至 少一種。
10. -種用于Lp (a)檢測的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有權利要求5所述的 抗Lp (a)多克隆抗血清。
【文檔編號】G01N33/68GK104059144SQ201410085889
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年3月10日 優先權日:2014年3月10日
【發明者】謝桂華, 柴寶玲 申請人:深圳市寶凱侖科技有限公司
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