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一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條的制作方法
【專利摘要】一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，包括一個(gè)樣品墊、一個(gè)含有膠體金標(biāo)記探針的金標(biāo)墊、一個(gè)纖維素膜、一個(gè)吸水墊組成，纖維素膜上遠(yuǎn)離金標(biāo)墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置檢測線，檢測線由特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體組成，由保藏號為CGMCC?No.9240的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，膠體金標(biāo)記探針為抗原表位不同的特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC?No.9239的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記探針的二抗或鏈球菌G蛋白或金黃色葡萄球菌A蛋白組成。本發(fā)明敏感性及特異性高，總的敏感性可達(dá)83%，特異性為95%。
【專利說明】一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其涉及一種免疫層析試條，具體來說是一種基于檢 測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條。

【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)臟利什曼病或稱黑熱病，是由杜氏利什曼原蟲種團(tuán)（Leishmania donovanicomplex)或嬰兒利什曼原蟲（L. infantum)/恰氏利什曼原蟲（L. chagasi)的原蟲 寄生于人體的淋巴一巨噬細(xì)胞系統(tǒng)所引起的一種寄生蟲病，由媒介白蛉叮咬傳播。該病在 世界范圍內(nèi)流行甚廣，包括亞、歐、非及中、南美洲的61個(gè)國家，每年新發(fā)生的病例數(shù)約有 50萬。在上世紀(jì)60年代以前我國也深受其害，病例曾達(dá)60萬，死亡率極高。準(zhǔn)確檢測感染 和診斷是監(jiān)測工作急需和治療的關(guān)鍵所在，因此，對黑熱病診斷技術(shù)的研究始終受到重視。
[0003] 以骨髓、脾等穿刺物涂片染色鏡檢的方法是黑熱病最古老的診斷方法，迄今仍是 黑熱病診斷的"金標(biāo)準(zhǔn)"。國外報(bào)道顯示骨髓和淋巴結(jié)穿刺物涂片鏡檢敏感性分別為60%? 75%和30%?50%，國內(nèi)報(bào)道以骨髓、淋巴結(jié)、脾穿刺涂片鏡檢檢出率依次為：80?90%、 46?87%、96?98%。由于這種檢測方法對操作人員的技術(shù)要求非常高，在疾病診斷與流 行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用受到限制。
[0004] 免疫學(xué)方法在黑熱病診斷上的應(yīng)用越來越受到重視，常用檢測方法有間接血凝法 (Indirect haemagglutination assay ;IHA)、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)、酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印 潰法（Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay ；EITBA),以及金標(biāo)免疫點(diǎn)印潰 法（Gold-labelled dot blotting;⑶B;俗稱膜法或滲濾法）。但這些方法或費(fèi)時(shí)費(fèi)力、或 需要冷鏈系統(tǒng)保存試劑、或?qū)x器設(shè)備及操作人員的要求較高而不適合現(xiàn)場使用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提出一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，所 述的這種診斷黑熱病的免疫層析試條要解決現(xiàn)有技術(shù)中的診斷黑熱病的準(zhǔn)確率不高，而且 費(fèi)時(shí)費(fèi)力的技術(shù)問題。
[0006] 本發(fā)明提供了一種小鼠雜交瘤細(xì)胞，其保藏號為CGMCC No. 9239。
[0007] 本發(fā)明還提供另外一種小鼠雜交瘤細(xì)胞，其保藏號為CGMCC No. 9240。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種可特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆 抗體，由保藏號為CGMCC No. 9240的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
[0009] 本發(fā)明還提供了另外一種抗原表位不同的可特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛 體蟲體抗原的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No. 9239的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
[0010] 本發(fā)明還提供了一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，包括一個(gè) 樣品墊、一個(gè)緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標(biāo)記探針的金標(biāo)墊、一個(gè)與所述金標(biāo)墊 緊密連接的纖維素膜、一個(gè)緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊，所述纖維素膜上遠(yuǎn) 離金標(biāo)墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置檢測線，其中，所述 的檢測線由特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體組成，由保藏號 為CGMCC No. 9240的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，所述的膠體金標(biāo)記探針為抗原表位不同的特異 性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No. 9239的小 鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記探針的二抗或鏈球菌G蛋白 (SPG)或金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA)組成。
[0011] 本發(fā)明還提供了另外一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，包括 一個(gè)樣品墊、一個(gè)緊密連接于所述樣品墊的含有膠體金標(biāo)記探針的金標(biāo)墊、一個(gè)與所述金 標(biāo)墊緊密連接的纖維素膜、一個(gè)緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊，所述纖維素膜 上遠(yuǎn)離金標(biāo)墊的一端設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置檢測線，其中， 所述的檢測線由特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體組成，由保藏 號為CGMCC No. 9239的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，所述的膠體金標(biāo)記探針為抗原表位不同的特 異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No. 9240的 小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記探針的二抗或鏈球菌G蛋白 (SPG)或金黃色葡萄球菌A蛋白（SPA)組成。
[0012] 進(jìn)一步的，所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記探針的羊抗鼠 IgG組成。
[0013] 進(jìn)一步的，特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體E3C3的 噴涂量為0. 1?8 μ g/cm ;膠體金標(biāo)記探針的特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗 原的單克隆抗體A6A2濃度（以蛋白濃度計(jì)）：0. 2?2mg/20mL;羊抗鼠 IgG的噴涂量為 0· 1 ?4 μ g/cm〇
[0014] 具體的，所述支持檢測線和質(zhì)控線的纖維素膜可為硝酸纖維素膜（NC膜）或醋酸 纖維素膜；所述支持膠體金標(biāo)記探針的金標(biāo)墊為玻璃纖維膜或聚脂膜；所述樣品墊可以是 濾血膜樣品墊，所述的濾血膜是棉籽絨和纖維素的混合物或者玻璃纖維和纖維素的混合 物，適合于全血樣品和血清樣品；所述樣品墊也可以是玻璃纖維或吸水紙樣品墊，適合于血 清樣品；所述吸水墊由吸水材料制備，如吸水紙。
[0015] 具體的，所述纖維素膜寬度控制在2. 5?3. 0mm ;所述吸水墊可寬度為20?40mm， 所述金標(biāo)墊的寬度為5?10mm ;所述樣品墊寬度為20?40mm。
[0016] 進(jìn)一步的，所述免疫層析試條背面可設(shè)置一個(gè)起支撐作用的背板，背板材料的選 擇是多種多樣的，可以是塑料板，如聚氯乙烯板（PVC)等。
[0017] 進(jìn)一步的，可將所述帶有背板的免疫層析試條切成3?5mm寬裝入一個(gè)盒體中，該 盒體對應(yīng)于濾血膜樣品墊的部位設(shè)有加樣孔，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗， 檢測樣品時(shí)將全血或血清加入加樣孔中。
[0018] 利什曼原蟲在黑熱病患者體內(nèi)以無鞭毛體的形式存在，檢測病人血樣中是否含有 利什曼原蟲無鞭毛體循環(huán)抗原，可以作為病人感染利什曼原蟲的指標(biāo)。
[0019] 本發(fā)明將特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體E3C3固定 在纖維膜上形成檢測線，該固相抗原可以捕獲受試者血樣中相應(yīng)的杜氏利什曼原蟲循環(huán)抗 原，在檢測線位置形成抗原抗體復(fù)合物沉淀。
[0020] 本發(fā)明采用特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體A6A2作 為檢測探針，該膠體金標(biāo)記探針附著于金標(biāo)墊上。檢測過程中，復(fù)溶的膠體金標(biāo)記探針可與 受試者血樣中的杜氏利什曼原蟲循環(huán)抗原，結(jié)合，從而當(dāng)受試者血樣中存在杜氏利什曼原 蟲循環(huán)抗原時(shí)在檢測線位置形成色帶。
[0021] 本發(fā)明將與膠體金標(biāo)記探針特異性結(jié)合的抗體固定在纖維素膜上作為質(zhì)控線。膠 體金標(biāo)記探針是特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆小鼠抗體，相應(yīng) 的，質(zhì)控線采用羊抗小鼠 IgG的抗抗體。無論待檢樣品中是否含有杜氏利什曼原蟲循環(huán)抗 原，本發(fā)明的診斷黑熱病中質(zhì)控線位置總能形成色帶，該條色帶是判定檢測過程是否正常 和免疫層析試條是否變質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0022] 與膠體金標(biāo)記探針特異性結(jié)合的質(zhì)控線不限于使用羊抗鼠 IgG，也可采用金黃色 葡萄球菌A蛋白（SPA)，鏈球菌G蛋白（SPG)，或者采用其他動物如兔抗鼠 IgG抗體的單抗 或多抗，同樣能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，這是領(lǐng)域的一般技術(shù)人員都知曉的。
[0023] 本發(fā)明的診斷黑熱病的免疫層析試條適用于從親內(nèi)臟什曼原蟲感染者或黑熱病 患者（患畜）體內(nèi)抽取的全血樣品和血清樣品。對于全血樣品，本發(fā)明的診斷黑熱病的免 疫層析試條中的樣品墊采用濾血膜樣品墊；如果僅僅檢測血清樣品，本發(fā)明的診斷黑熱病 的免疫層析的免疫層析試條中的樣品墊可采用玻璃纖維或吸水紙樣品墊，也可采用濾血膜 樣品墊。
[0024] 本發(fā)明中的細(xì)胞株E3C3,屬于小鼠雜交瘤細(xì)胞，該菌株保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心的地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號（中科院微生物研究所），保藏日期為2014 年5月28號，保藏號為CGMCC No :9240。
[0025] 本發(fā)明中的細(xì)胞株A6A2，屬于小鼠雜交瘤細(xì)胞，該菌株保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)中，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中 心的地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號（中科院微生物研究所），保藏日期為2014 年5月28號，保藏號為CGMCC No :9239。
[0026] 本發(fā)明的免疫層析試條具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1)敏感性及特異性高：實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果 顯示，本發(fā)明的免疫層析試條總的敏感性可達(dá)83%，特異性為95% ; (2)檢測方法簡單、快 速：檢測過程中標(biāo)本處理簡單，血清或全血都可以直接使用，無需處理，不需要專門儀器和 人員培訓(xùn)，非專業(yè)技術(shù)人員按照說明書即可操作，并可迅速觀察結(jié)果，標(biāo)本中的抗體經(jīng)5分 鐘左右的層析后，即可出現(xiàn)肉眼可見的沉淀線，從而為黑熱病人的治療爭取了時(shí)間，很適合 現(xiàn)場和基層使用；（3)本發(fā)明的免疫層析試條可以同時(shí)應(yīng)用與人、畜和野生動物感染的現(xiàn) 場檢測，有助于尋找確定傳染源，在疾病預(yù)防控制工作中有重要意義；(4)制備方法簡單， 成本低廉，易于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將在診斷黑熱病及其相關(guān)疾病的診斷和治療中發(fā) 揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1、診斷黑熱病的免疫層析試條的正面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0028] 圖2、診斷黑熱病的免疫層析試條的縱截面結(jié)構(gòu)示意圖。
[0029] 其中：1為樣品墊；2為金標(biāo)墊；3為纖維素膜；4為吸水墊；5為檢測線；6為質(zhì)控 線；7為背板。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 實(shí)施例1杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的制備
[0031] 杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原按如下方法制備：取本實(shí)驗(yàn)室保種的杜氏利什 曼原蟲801 (MH0M/CN//801/XJ)在NNN培養(yǎng)基中22°C培養(yǎng)的前鞭毛體接種于199培養(yǎng)基 (PH7. 2-7. 4)中于22°C擴(kuò)大培養(yǎng)。前鞭毛體達(dá)到一定密度后，離心收集，轉(zhuǎn)入199培養(yǎng)基 (PH5. 4)中37°C進(jìn)行無鞭毛體的轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化的無鞭毛體40C下3000g離心15分鐘收集無 鞭毛體，棄上清，沉淀同法用PBS洗3次后，按前鞭毛體的壓積量加4倍體積的PBS，在液氮 和37°C水浴中，反復(fù)凍融5次，然后在冰浴中超聲粉碎3次，18000g，4°C離心20min，上清即 為可溶性抗原。用按上述方法制備的抗原免疫BALB/c小鼠，取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0瘤 細(xì)胞融合，獲得的能高效分泌特異抗體的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3次克隆后注射小鼠生產(chǎn)腹水。本 發(fā)明在采用杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞S/P20 細(xì)胞按常規(guī)方法制備雜交瘤時(shí)，篩選到兩株分泌特異性抗杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗 原單克隆抗體細(xì)胞株：
[0032] (1)E3C3(保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCC No. 9240,保藏日期為2014年5月28日），該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒 定為IgGl型，可以與杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原特異性結(jié)合。
[0033] (2)A6A2(保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為 CGMCC No. 9239,保藏日期為2014年5月28日），該雜交瘤細(xì)胞株分泌的單克隆抗體經(jīng)鑒 定為IgGl型，可以與杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原特異性結(jié)合。
[0034] 實(shí)施例2抗杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原單克隆抗體的制備
[0035] 免疫：每只BALB/c小鼠首次腹腔注射100 μ g上述純化的杜氏利什曼原蟲無鞭毛 體可溶性抗原+福氏完全佐劑的混懸液，以后每隔1月注射100 μ g純化的杜氏利什曼原蟲 無鞭毛體可溶性抗原+福氏不完全佐劑的混懸液1次，共2次，并于殺鼠取脾進(jìn)行細(xì)胞融合 的前3d經(jīng)尾靜脈直接注射抗原加強(qiáng)免疫1次。
[0036] 雜交瘤細(xì)胞的產(chǎn)生與篩選：SP2/0瘤細(xì)胞與免疫鼠脾細(xì)胞的融合及雜交瘤細(xì)胞的 克隆按本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。以上述純化的杜氏利什曼原蟲無鞭毛體可溶性抗原和谷胱甘 肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST)蛋白分別包板對雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行常規(guī)ELISA檢測抗體分泌以 篩選雜交瘤細(xì)胞株，對GST和重組融合蛋白均反應(yīng)的克隆其分泌的抗體視為針對GST，所以 只選擇保留僅對杜氏利什曼原蟲無鞭毛體可溶性抗原反應(yīng)的克隆。
[0037] 單克隆抗體（McAb)免疫球蛋白亞類鑒定：經(jīng)濃縮的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液與羊 抗鼠 IgG、IgM、IgA、IgGl、IgG2a、IgG2b和IgG3在1%生理鹽水瓊脂板上進(jìn)行免疫雙擴(kuò)散 以鑒定McAb免疫球蛋白亞類。
[0038] 腹水生產(chǎn)與腹水效價(jià)決定：每只BALB/c小鼠腹腔注射5 X 106雜交瘤細(xì)胞，1周后 隨時(shí)觀察并取腹水。以純化的重組融合蛋白包被酶標(biāo)板，腹水進(jìn)行倍比稀釋，第1稀釋度為 1 : 1000,用常規(guī)ELISA法確定腹水效價(jià)。
[0039] 免疫印跡實(shí)驗(yàn)：取培養(yǎng)杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體和10份四川發(fā)熱病人紅細(xì) 胞經(jīng)處理后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，而后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維薄膜上。轉(zhuǎn)移完畢后硝酸纖維素膜用 含5%脫脂奶粉的？85溶液室溫封閉111，用？85含0.5%1'1^ 〇1^-100(?85-1')洗滌3次，按 1 : 20000稀釋度加入單克隆抗體，4°C過夜，用PBS-T洗滌3次，加入用PBS稀釋（1 : 5000) 的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠抗體室溫?fù)u2h，同法洗滌3次，再用PBS洗滌1次，用二氨 基聯(lián)苯胺（DAB)底物系統(tǒng)（DAB5〇mg，PBS100ml，3〇%H20 210 yL)顯色。
[0040] 制備得到特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體可溶性抗原的單克隆抗體：
[0041] A6A2屬于IgGl亞類，與重組抗原反應(yīng)效價(jià)1:51200,用于標(biāo)記；
[0042] E3C3屬于IgGl亞類，與重組抗原反應(yīng)效價(jià)1:51200,用于包被；
[0043] 抗杜氏利什曼原蟲無鞭毛體可溶性抗原克隆抗體的純化：將含抗杜氏利什曼原蟲 無鞭毛體可溶性抗原單克隆抗體的小鼠腹水，先使用正辛酸一硫酸銨沉淀法抽提，然后再 用G蛋白層析柱（美國GE公司產(chǎn)品）按產(chǎn)品說明書純化單克隆抗體。
[0044] 實(shí)施例3診斷黑熱病的免疫層析試條的制備
[0045] 1.抗杜氏利什曼原蟲可溶性抗原的單克隆抗體由實(shí)施例2制備所得。
[0046] 2.羊抗小鼠 IgG由購買獲得。
[0047] 3.制備免疫膠體金探針及金標(biāo)墊
[0048] 用下述方法制備杜氏利什曼原蟲可溶性抗原的單克隆抗體膠體金探針及金標(biāo) 墊：
[0049] 1)采用檸檬酸鹽還原法制備膠體金顆粒，具體方法為：將HAuC14(滬試牌購于上 海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）配制成〇. 01 %水溶液，取l〇〇mL加熱至沸騰，攪動下準(zhǔn)確加 入1. 6mL的1 %的檸檬酸三鈉水溶液，待液體顏色穩(wěn)定成葡萄酒紅色，得到膠體金溶液。
[0050] 2)確定膠體金偶聯(lián)探針飽和濃度
[0051] 用0. 2M K2C03調(diào)節(jié)步驟1)制備的膠體金溶液的pH值至8. 0,準(zhǔn)備5支潔凈試管， 分別加入lmL膠體金溶液。將步驟1)制備的杜氏利什曼原蟲可溶性抗原的單克隆抗體稀 釋為lmg/mL，分別向4支試管中加入20 μ L、25 μ L、30 μ L、35 μ L，另一支為空白對照，混勻 后于室溫下放置5分鐘，加入10% NaCl水溶液，混勻，靜置10-20分鐘后觀察液體顏色。膠 體金溶液顏色不變時(shí)所含最少量即為穩(wěn)定lmL膠體金溶液所需蛋白的最適濃度，以此為基 礎(chǔ)增加20%蛋白量即為膠體金探針飽和溶液。結(jié)果：維持膠體金溶液顏色不變的蛋白量為 25 μ L，即探針濃度為20 μ g/mL。
[0052] 3)杜氏利什曼原蟲可溶性抗原的單克隆抗體標(biāo)記的免疫膠體金探針及金標(biāo)墊的 制備
[0053] 取50mL膠體金溶液，用0· 2M K2C03調(diào)節(jié)pH值為8. 0,按20μ g/mL加入已純化的杜 氏利什曼原蟲可溶性抗原的單克隆抗體A6A2,得到免疫膠體金探針溶液50mL，攪拌15min， 再加入終濃度為1% BSA，攪拌15min，10000g離心30min，棄上清，用10mM HEPES緩沖液洗 滌沉淀，并將其保存于10mL含15%蔗糖的10mM HEPES緩沖液中，得到杜氏利什曼原蟲可溶 性抗原的單克隆抗體標(biāo)記的膠體金探針溶液。取5mL膠體金探針溶液均勻加在玻璃纖維膜 上，相對濕度40%下干燥1小時(shí)，得到金標(biāo)墊。
[0054] 4、診斷黑熱病的免疫層析試條的制備
[0055] 該試條的制備方法包括以下步驟：
[0056] 1)NC膜的包被
[0057] 檢測線包被：用0. 01M pH7. 4 PBS稀釋實(shí)施例2制備的杜氏利什曼原蟲可溶性抗 原單克隆抗體E3C3至終濃度為2mg/mL，用于包被檢測線；
[0058] 質(zhì)控線的包被：用0· 01M pH7. 4 PBS稀釋羊抗小鼠 IgG至終濃度為0· 5 mg/mL，用 于包被質(zhì)控線；
[0059] BI0D0T公司XZ1000噴膜機(jī)將分別噴于300mm長、25mm寬的硝酸纖維素膜（購自 MILLIP0RE公司）上，噴涂量為10 μ L/cm，形成一條檢測線和一條質(zhì)控線，37°C下干燥1小 時(shí)。
[0060] 2)診斷黑熱病的免疫層析試條的制備
[0061] 用一塊單面涂了不干膠的PVC背板，中間粘貼上處理好的NC膜；NC膜靠近質(zhì)控線 的一端緊密粘貼吸水墊（購于杰一生物公司）；NC膜靠近質(zhì)控線的一端緊密粘貼金標(biāo)墊； 金標(biāo)墊另一端緊密粘貼濾血膜樣品墊（購自杰一生物公司）。得到診斷黑熱病試條母板，切 割成4mm寬，加干燥劑后密封保存。
[0062] 5、診斷黑熱病的免疫層析試劑盒的制備
[0063] 為了方便使用，將步驟4制備的診斷黑熱病的免疫層析的免疫層析試條裝入檢測 盒體中，加干燥劑后密封保存。該檢測盒對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有加樣孔，對應(yīng)于檢測線和 質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
[0064] 實(shí)施例5診斷黑熱病的免疫層析試條的實(shí)驗(yàn)室考核
[0065] 1、檢測方法
[0066] 于實(shí)施例3制備的免疫層析試條的濾血膜樣品墊加入待測血清，1分鐘后加入樣 本稀釋液（PBS) 1滴（約50 μ L)，5分鐘后開始觀察結(jié)果，15分鐘觀察終止。結(jié)果判定：如 果檢測線5和質(zhì)控線6均出現(xiàn)紅色條帶，即判為黑熱病；如果僅有質(zhì)控線6出現(xiàn)紅色條帶， 即判為陰性；如果質(zhì)控線不顯色，即表明試條失效。
[0067] 1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0068] 用本發(fā)明實(shí)施例3制備的診斷黑熱病的免疫層析的免疫層析試條進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室考 核結(jié)果如表2所示。由表2可以看出本發(fā)明的免疫層析試紙的敏感性可達(dá)82. 9%，特異性 可達(dá)95. 3%。上述檢測結(jié)果表明本發(fā)明的免疫層析試條可用于黑熱病的快速檢測。
[0069] 表2本發(fā)明診斷黑熱病的實(shí)驗(yàn)室考核結(jié)果
[0070]

【權(quán)利要求】
1. 一種小鼠雜交瘤細(xì)胞，其保藏號為CGMCC No. 9239。
2. -種小鼠雜交瘤細(xì)胞，其保藏號為CGMCC No. 9240。
3. -種可特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體，由保藏號為 CGMCC No. 9240的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
4. 一種抗原表位不同的可特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗 體，由保藏號為CGMCC No. 9239的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
5. -種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，包括一個(gè)樣品墊、一個(gè)緊密 連接于所述樣品墊的含有膠體金標(biāo)記探針的金標(biāo)墊、一個(gè)與所述金標(biāo)墊緊密連接的纖維 素膜、一個(gè)緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊，所述纖維素膜上遠(yuǎn)離金標(biāo)墊的一端 設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置檢測線，其特征在于：所述的檢測 線由特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體組成，由保藏號為CGMCC No. 9240的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，所述的膠體金標(biāo)記探針為抗原表位不同的特異性結(jié)合杜 氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No. 9239的小鼠雜交瘤 細(xì)胞產(chǎn)生，所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記探針的二抗或鏈球菌G蛋白（SPG)或金 黃色葡萄球菌A蛋白（SPA)組成。
6. 如權(quán)利要求5所述的一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，其特征 在于：所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記探針的羊抗鼠 IgG組成。
7. 如權(quán)利要求5所述的一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，其特征 在于：特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體的噴涂量為〇. 1?8Pg/ cm;膠體金標(biāo)記探針的特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體的濃度 為0· 2?2mg/20mL ;羊抗鼠 IgG的噴涂量為0· 1?4Pg/cm。
8. 如權(quán)利要求5所述的一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，其特征 在于：所述免疫層析試條背面設(shè)置一個(gè)起支撐作用的背板。
9. 如權(quán)利要求5所述的一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，其特征 在于：將所述帶有背板的免疫層析試條裝入一個(gè)盒體中，該盒體對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè)有 加樣孔，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
10. -種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，包括一個(gè)樣品墊、一個(gè)緊 密連接于所述樣品墊的含有膠體金標(biāo)記探針的金標(biāo)墊、一個(gè)與所述金標(biāo)墊緊密連接的纖維 素膜、一個(gè)緊密連接于所述纖維素膜另一端的吸水墊，所述纖維素膜上遠(yuǎn)離金標(biāo)墊的一端 設(shè)置質(zhì)控線，在質(zhì)控線和金標(biāo)墊之間的纖維素膜上設(shè)置檢測線，其特征在于：所述的檢測 線由特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體組成，由保藏號為CGMCC No. 9239的小鼠雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生，所述的膠體金標(biāo)記探針為抗原表位不同的特異性結(jié)合杜 氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體，由保藏號為CGMCC No. 9240的小鼠雜交瘤 細(xì)胞產(chǎn)生，所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記探針的二抗或鏈球菌G蛋白（SPG)或金 黃色葡萄球菌A蛋白（SPA)組成。
11. 如權(quán)利要求10所述的一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，其特 征在于：所述的質(zhì)控線由特異性結(jié)合膠體金標(biāo)記探針的羊抗鼠 IgG組成。
12. 如權(quán)利要求10所述的一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，其 特征在于：特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體的噴涂量為0. 1? 8Pg/cm;膠體金標(biāo)記探針的特異性結(jié)合杜氏利什曼原蟲無鞭毛體蟲體抗原的單克隆抗體 A6A2的濃度為0· 2?2mg/20mL ;羊抗鼠 IgG的噴涂量為0· 1?4Pg/cm。
13. 如權(quán)利要求10所述的一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，其特 征在于：所述免疫層析試條背面設(shè)置一個(gè)起支撐作用的背板。
14. 如權(quán)利要求13所述的一種基于檢測循環(huán)抗原的診斷黑熱病的免疫層析試條，其特 征在于：將所述帶有背板的免疫層析試條裝入一個(gè)盒體中，該盒體對應(yīng)于樣品墊的部位設(shè) 有加樣孔，對應(yīng)于檢測線和質(zhì)控線的部位設(shè)有觀測窗。
【文檔編號】G01N33/577GK104142400SQ201410355940
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月24日
【發(fā)明者】汪俊云, 楊玥濤, 石鋒, 高春花, 楊益, 周曉農(nóng) 申請人:中國疾病預(yù)防控制中心寄生蟲病預(yù)防控制所