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檢測(cè)羥基自由基的比率型熒光探針及合成方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)羥基自由基的比率型熒光探針及合成方法和用途，該比率型熒光探針是將蛋白質(zhì)包裹具有熒光的BSA-AuNCs（金納米簇）和對(duì)羥基自由基有特定響應(yīng)的有機(jī)分子HPF（2-[6-(4’-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on-9-yl]benzoicacid）共價(jià)鍵和在一起，從而形成比率型熒光探針。此探針無羥基自由基的條件下僅BSA-AuNCs會(huì)發(fā)射出參比熒光，當(dāng)環(huán)境中存在羥基自由基時(shí)，探針上的HPF會(huì)與羥基自由基發(fā)生反應(yīng)，生成熒光產(chǎn)物，發(fā)射出羥基自由基的響應(yīng)熒光。由于參比熒光的存在，可以有效的降低由于激光光源穩(wěn)定性，激光強(qiáng)度，探針濃度，光學(xué)對(duì)焦，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化等原因引起的測(cè)定誤差，能夠更準(zhǔn)確的測(cè)定羥基自由基的濃度。
【專利說明】檢測(cè)羥基自由基的比率型熒光探針及合成方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)及臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)羥基自由基的比率型熒光探針及合成方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]活性氧是生物體生命代謝不可避免的副產(chǎn)物，它在機(jī)體的先天性免疫、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞的增生、分化、凋亡等方面有重要的作用，但是同時(shí)，活性氧自由基對(duì)生物機(jī)體也存在著氧化損傷，使組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞性修飾，損傷正常組織細(xì)胞的形態(tài)和功能(文獻(xiàn)
1:Chen X.，.Probing oxidative stress: Small molecule fluorescent sensors ofmetal ions, reactive oxygen species, and thiols，Coord.Chem.Rev.,2011,40:4783-4804)。 [0003]羥基自由基是目前已知活性氧中對(duì)生物體毒性最強(qiáng)、危害最大的一種自由基，它能夠造成細(xì)胞中DNA、脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)等分子過度氧化，而造成細(xì)胞傷害。相關(guān)研究證據(jù)顯示，這些損傷可進(jìn)一步造成多種退化性疾病、老化、突變以及癌癥的形成(Tang，B.，Probing Hydroxyl Radicals and Their Imaging in Living Cells by Use of FAM -DNA-Au Nanoparticles, Chem.Eur.J.,2008, 14，522-528)，因此，對(duì)羥基自由基的測(cè)定尤為重要。
[0004]羥基自由基的壽命短，含量低，對(duì)其的檢測(cè)是化學(xué)分析和生命科學(xué)分析領(lǐng)域最困難的問題之一。目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的檢測(cè)羥基自由基的方法主要有電子自旋共振法(Yim，Μ.B.，Copper, zinc superoxide dismutase catalyzes hydroxyl radicalproduction from hydrogen peroxide, Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.，1990，87，5006-5010)，電化學(xué)法(Li，L，An Electrochemical Strategy for Fast Monitoring of?OH Released from Live Cells at Electroactive FcHT-Functional Surface Amplifiedby Au Nanoparticles, Chem.Commun.，2013，49，1279-1281 )，以及焚光法(Czili，Η.，Applicability of coumarin for detecting and measuring hydroxyl radicalsgenerated by photoexcitation of TiO2 nanoparticles, App1.Catal.B.，2008，81，295-302)等。熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、重現(xiàn)性高、線性范圍寬、方法簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，且與激光共聚焦顯微技術(shù)結(jié)合后，可以實(shí)現(xiàn)活體細(xì)胞和組織內(nèi)目標(biāo)物的“實(shí)時(shí)、定量、可見”的檢測(cè)。目前已報(bào)道用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)羥基自由基的探針多為單發(fā)射型，不能有效避免測(cè)定環(huán)境所引起的誤差。
[0005]比率型熒光探針測(cè)定時(shí)包含兩個(gè)熒光信號(hào)峰，其中一個(gè)作為參比熒光型號(hào)，另一個(gè)作為對(duì)待測(cè)物有響應(yīng)的響應(yīng)熒光信號(hào)，根據(jù)兩個(gè)熒光信號(hào)的光強(qiáng)度比值度待測(cè)物進(jìn)行定量，由于參比熒光的存在，在測(cè)定的過程中可以有效的避免復(fù)雜環(huán)境變化所引起的誤差(A.Zhu.Carbon-Dot-Based Dual-Emission Nanohybrid Produces a RatiometricFluorescent Sensor for In Vivo Imaging of Cellular Copper 1ns， Angew.Chem.1nt.Ed.,2012,51: 7185—7189)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種對(duì)細(xì)胞滲透性好，毒副作用小，適用于生物體內(nèi)羥基自由基檢測(cè)的比率型熒光探針。
[0007]本發(fā)明的目的之二是提供一種工藝簡(jiǎn)單的該熒光探針的合成方法。
[0008]本發(fā)明的目的之三是提供該熒光探針的用途。
[0009]本發(fā)明提出的一種檢測(cè)羥基自由基的比率型熒光探針，以牛血清蛋白為還原劑和保護(hù)劑，制備具有熒光的BSA-AuNCs (金納米簇)中，使牛血清蛋白上的胺基和對(duì)羥基自由基有特定響應(yīng)的有機(jī)分子 HPF(2-[6- (4，-Hydroxy) phenoxy-3H-xanthen-3-on_9-yl]benzoicacid)的羧基反應(yīng)，產(chǎn)生共價(jià)鍵，從而形成比率型熒光探針。
[0010]本發(fā)明提出的一種檢測(cè)羥基自由基的比率型熒光探針的合成方法，具體步驟如下:
(1)在37°C和充分磁力攪拌的條件下，將5體積，濃度為10 mM的氯金酸水溶液加入到5體積、質(zhì)量濃度為50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5體積濃度為I M的NaOH溶液，持續(xù)反應(yīng)12 h ;用透析膜(MWC0: 3500)將反應(yīng)得到的產(chǎn)物在超純水中透析24h,得到BSA-AuNCs溶液；
(2)室溫條件下，將體積為10μ L濃度為5 mM的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入催化劑0.0400 g 1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和0.0400 g N-羥基琥珀酰亞胺活化，再加入步驟(I)得到的AuNCs溶液反應(yīng)10 h ;所得產(chǎn)物在pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中透析，得到比率型熒光探針溶液。
[0011]本發(fā)明提出的比率型熒光探針用于化學(xué)體系、化學(xué)模擬生物體系中羥基自由基的檢測(cè)，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的羥基自由基的熒光成像檢測(cè)，以及臨床醫(yī)學(xué)上組織和器官中羥基自由基的檢測(cè)。
[0012]本發(fā)明提出的比率型熒光探針對(duì)羥基自由基的識(shí)別是基于有機(jī)分子HPF對(duì)羥基自由基的特殊響應(yīng)。在沒有羥基自由基的情況下，比率型熒光探針中只BSA-AuNCs會(huì)發(fā)射出熒光；當(dāng)有羥基自由基存在時(shí)，羥基自由基會(huì)切斷HPF中的對(duì)苯酚基，生成熒光素類熒光物質(zhì)，成為雙發(fā)射比率型熒光探針。
[0013]本發(fā)明提出的比率型熒光探針通常加入含有細(xì)胞及組織的適當(dāng)緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試，其線性范圍為0μΜ-150μΜ。
[0014]本發(fā)明提出的比率型熒光探針結(jié)合激光共聚焦顯微技術(shù)被實(shí)際應(yīng)用于Hela細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下的羥基自由基的細(xì)胞成像。
[0015]本發(fā)明的熒光探針有如下優(yōu)點(diǎn):
(I)作為比率型熒光探針，由于參比熒光的存在，可以有效的降低由于激光光源穩(wěn)定性，激光強(qiáng)度，探針濃度，光學(xué)對(duì)焦，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化等原因引起的測(cè)定誤差，能夠更準(zhǔn)確的測(cè)定羥基自由基的濃度。
[0016](2)合成方法簡(jiǎn)單，在室溫下即可，不需要嚴(yán)格的合成條件；
(3)對(duì)羥基自由基有良好的選擇性，其它活性氧物質(zhì)幾乎不會(huì)產(chǎn)生干擾熒光信號(hào)。
[0017](4)參比熒光的存在可以有效避免由測(cè)定環(huán)境的變化而引起的誤差。
[0018](5)探針的細(xì)胞毒性低，生物兼容性好。[0019](6)探針的熒光激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm,對(duì)于活性組織和細(xì)胞的損傷小。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明的比率型熒光探針與不同濃度的羥基自由基作用后體系的熒光發(fā)射圖譜，其橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)(Wavelength/nm)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度(FL)。
[0021]圖2是本發(fā)明的比率型熒光探針與不同濃度的羥基自由基作用的線性關(guān)系，橫坐標(biāo)為’OH的濃度0-0Η]/μ M)，縱坐標(biāo)為熒光比率探針的熒光強(qiáng)度比率值(15。。_56(|/158(|_69(|)。
[0022]圖3是本發(fā)明的比率型熒光探針對(duì)羥基自由基（.0Η)與過氧化氫(H2O2),超氧陰離子自由基(02_)，次氯酸根(C10_)，脂過氧自由基(R00_)，過氧亞硝基陰離子(0N00_ )，單線態(tài)氧(1O2),—氧化氮(NO)，次硝酸(HNO)的熒光響應(yīng)，橫坐標(biāo)為各種活性自由基物質(zhì)，縱坐標(biāo)為比率熒光探針中響應(yīng)熒光與參比熒光的熒光光強(qiáng)度比率值(Ι5Μ-56(Ι/Ι5._)。
[0023]圖4是本發(fā)明的比率型熒光探針對(duì)細(xì)胞的MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。加入不同倍數(shù)于的原細(xì)胞探針溶液濃度的探針與細(xì)胞共培養(yǎng)后，細(xì)胞的存活率。
[0024]圖5是本發(fā)明的比率型熒光探針研究宮頸癌細(xì)胞(Hela)的激光共聚焦顯微成像的灰度圖，(a)是未產(chǎn)生_0H前，探針在細(xì)胞里的成像，(b)和(c)是引起氧化應(yīng)激20 min和40 min后，探針在細(xì)胞里的成像。
[0025]圖6是本發(fā)明的比率型熒光探針測(cè)定羥基自由基的機(jī)理示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面具體實(shí)施例是結(jié)合技術(shù)方案和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受下列實(shí)施例的嚴(yán)格限定。
[0027]實(shí)施例1:羥基自由基的比率型熒光探針的合成
1.在37°C和充分磁力攪拌的條件下，將5 mL濃度為10 mM的氯金酸水溶液加入到5 5 mL質(zhì)量濃度為50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5 mL濃度為I M的NaOH溶液，持續(xù)反應(yīng)12 h;用透析膜(MWC0: 3500)將反應(yīng)得到的產(chǎn)物在超純水中透析，得到BSA-AuNCs 溶液；
2.室溫條件下，將體積為10μ L濃度為5 mM的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH為
7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入0.0040g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和0.0040gN-羥基琥珀酰亞胺活化HPF中的羧基，再加入400 μ L上述BSA-AuNCs溶液反應(yīng)10 h ;所得產(chǎn)物在3000 mL pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中透析4 h，得到比率型熒光探針溶液。
[0028]實(shí)施例2:比率探針與_0H反應(yīng)后熒光性質(zhì)的測(cè)定
1.羥基自由基的產(chǎn)生方法:
本發(fā)明中的羥基自由基是利用芬頓反應(yīng)來產(chǎn)生，其根據(jù)如下反應(yīng):
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)羥基自由基的比率型熒光探針，其特征在于:以牛血清蛋白為還原劑和保護(hù)劑，制備具有熒光的BSA-AuNCs (金納米簇)，使牛血清蛋白上的胺基和對(duì)羥基自由基有特定響應(yīng)的有機(jī)分子 HPF (2_[6_(4，-Hydroxy)phenoxy-3H-xanthen-3-on_9-yl]benzoicacid)的羧基反應(yīng)，產(chǎn)生共價(jià)鍵，從而形成比率型熒光探針。
2.一種如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)羥基自由基的比率型熒光探針的合成方法，其特征在于具體步驟如下: (1)在37°C和充分磁力攪拌的條件下，將5體積濃度為10 mM的氯金酸水溶液加入到5體積質(zhì)量濃度為50 mg/ mL的牛血清白蛋白水溶液，再加入0.5體積濃度為I M的NaOH溶液，持續(xù)反應(yīng)12 h ;用透析膜(MWC0: 3500)將反應(yīng)得到的產(chǎn)物在超純水中透析，得到 BSA-AuNCs 溶液； (2)室溫條件下，將一定量5mM的HPF的二甲基甲酰胺溶液加入到pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，加入適量催化劑1- (3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺活化，再加入步驟(I)所述BSA-AuNCs溶液反應(yīng)10 h ;所得產(chǎn)物在pH為7.4的磷酸鹽緩沖溶液中透析，得到比率型熒光探針溶液。
3.—種如權(quán)利要求1所述的檢測(cè)羥基自由基的比率型熒光探針的用途，其特征在于將比率型熒光探針用于化學(xué)體系、化學(xué)模擬生物體系中羥基自由基的檢測(cè)，生物活細(xì)胞和活組織內(nèi)的羥基自由基的熒光成像檢測(cè)，以及臨床醫(yī)學(xué)上組織和器官中羥基自由基的檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01Q60/22GK103760145SQ201410038820
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】莊梅, 田陽(yáng) 申請(qǐng)人:同濟(jì)大學(xué)