用于早期糖尿病診斷的多肽標志物的制作方法【專利摘要】本發明提供了用于早期糖尿病診斷的多肽標志物，首先選擇人外周血高豐度蛋白HSA建立體外模擬糖基化模型，優化條件下酶切，將酶切后的空白對照組樣品進行18O標記，與采用16O平行處理的反應組樣品1:1(v/v)混合，進行HPLC/ESI-TOF?MS檢測。通過對HSA肽段的定量分析，找到最不易被葡萄糖修飾的肽段如SEQ?ID?NO.1所示，作為內標肽段，將易發生糖基化修飾的肽段與內標肽段峰面積之比用以衡量葡萄糖敏感肽的糖基化修飾程度，通過蛋白質組學方法最終發現3條肽段FKDLGEENFK、LDELRDEGK和KVPQVSTPTLVEVSR可作為生物標志物用于糖尿病的早期診斷。【專利說明】用于早期糖尿病診斷的多肽標志物【
技術領域：
】[0001]本發明涉及生物【
技術領域：
】，具體地，涉及用于檢測早期糖尿病的多肽標志物及其應用。【
背景技術：
】[0002]糖尿病是一組以慢性血葡萄糖(簡稱血糖)水平增高為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌和(或)作用缺陷所引起。目前，醫學上將空腹血糖和糖化血紅蛋白水平作為臨床診斷糖尿病的直接標準。但對于糖尿病前期的人群來講，血糖水平并不會明顯率先表現出居高不下的狀態，而是由于肌體對血糖水平調節能力的下降，表現為血糖水平的忽高忽低。糖化血紅蛋白的測定則通常反映人相對長期(8-12周)的血糖狀況。通常情況下一旦空腹血糖和糖化血紅蛋白的水平達到了病理值，則“患有糖尿病”的結論不太可能出現逆轉。雖然胰島素及其它藥物在很大程度上使糖尿病及其并發癥得到了有效的控制，但目前糖尿病尚不能完全治愈，因此早期診斷對于糖尿病的治療起著至關重要的作用。[0003]目前，醫學上將空腹血糖和糖化血紅蛋白的水平定義為臨床診斷糖尿病的直接標準。空腹血糖大于等于7.0mmol/L或者糖化血紅蛋白水平大于等于6.5%即可診斷為糖尿病。盡管這一標準是現行權威的診斷標準，但由于性別、年齡，家族病史等不同個體差異的影響，單次空腹糖或糖化血紅蛋白水平偏高并不能百分之百的準確預測所有的糖尿病病例，尤其在該疾病的早期階段。在這種情況下，其它生物標志物的發現和研究應用于糖尿病的早期診斷越來越受到人們的重視。生物標志物可用于監測一個生理或者病理的過程，也可以用于跟蹤一個藥理反應，一個理想的生物標志物能夠鑒定疾病發展的程度、也可有效提高疾病預警的準確性，還可指導疾病的治療，甚至可以幫助研究人員洞悉疾病的發病機制。[0004]人的血漿蛋白來源于各種組織或細胞的分泌或者泄漏，已有研究表明血漿蛋白的動態變化反映了人的生理或病理狀態的變化，因此血漿蛋白質組的變化能很好地指示機體生理或病理狀況。血漿蛋白執行著人體的許多生物功能，在人類健康與疾病中有著重要的意義，人類的很多疾病都會引起血漿中蛋白質性質和含量的改變。由于血漿取材容易，且血漿中蛋白具有許多重要的生理功能，血清中某種蛋白濃度的變化往往預示某些疾病的發生。因此，監測血清蛋白濃度對于疾病的早期診斷、病因的闡明及藥物療效的監測方面都具有重要的意義。早期發現的某種蛋白在表達數量、水平及修飾狀態上出現的差異，很有可能作為疾病診斷的重要生物標志物。[0005]在蛋白質組學中，最常用的鑒定蛋白的方法之一是基于二維凝膠電泳(two-dimensionalgelelectrophoresis,2DE)技術和質譜聯用，通常在一塊膠上可以使幾千個蛋白得到分離，由于其第一維是等電聚焦，采用PH梯度根據蛋白質等電點的不同使之分離，第二維是聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據蛋白質分子量的大小進行分離，故可直接反映不同蛋白質的等電點和分子量的信息，而且也能反映蛋白質異構體和翻譯后修飾等變化。由于2DE是在蛋白水平上進行定量，該技術存在自身難以克服的缺陷，故人們轉向在肽段水平上進行定性和定量，進而實現蛋白的定量。基于質譜技術的定量方法大體上可以分為兩種，一種是無標記定量技術，另外一種是同位素標記定量技術。基于同位素標記定量技術主要包括體內代謝標記和化學標記兩種。體內代謝標記指生物體的外界培養環境中某一種元素或者氨基酸被某一同位素所取代，這樣在生物體生長的過程中，同位素逐漸取代自身的天然元素或氨基酸，在蛋白水平或肽段水平上形成質量差。代謝標記主要包括細菌或細胞的15N標記法和細胞培養中氨基酸穩定同位素標記法(StableIsotopeLabelingbyAminoacidsinCellculture,SILAC)。[0006]目前絕大多數生物標志物均處于蛋白水平，常見的檢測手段為酶聯免疫吸附法(ELISA)0酶具有較高的催化效率，因此ELISA法具有較高的靈敏度，但該方法需要預先知道生物標志物及其相應的特異性抗體，在實際應用中存在一定的挑戰。鑒于此，近年來以質譜為基礎的定量蛋白質組學的方法越來越多被應用與生物標志物的尋找。然而，與蛋白類生物標志物相比，肽類生物標志物可能更便于采用質譜進行檢測，其原因在于，蛋白在體內可能經歷多種翻譯后修飾，如:磷酸化、糖基化、乙酰化等等。每一種翻譯后修飾都可能改變蛋白的分子質量，從而導致質譜這一基于對分子量進行測定的儀器在檢測上的困難。相反，若采用多肽作為生物標志物則不存在這個問題。[0007]近年來，糖尿病及其并發癥的生物標志物逐漸成為研究的熱點之一，目前已經有許多糖尿病生物標志物被廣泛報道，例如C反應蛋白、丙氨酸轉氨酶、甘油三酯等。這些生物標志物的發現和檢測為早期糖尿病及其并發癥的發現和治療提供了有利依據。但在一般情況下，分析過程中的需要添加內標物使得待測物質得以準確定量。但是內標物的尋找也常常成為分析方法的難點之一，主要因為對內標的選擇有諸多要求，如:內標物添加至樣品中能完全溶解、不與待測組分發生反應，且內標物與待測組分在色譜保留時間上應盡可能接近。若能解決內標肽段溶解性差且容易與其他肽段存在相互反應的問題，對于下一步篩選葡萄糖敏感肽段的糖尿病多肽標志物，用于糖尿病的早期診斷具有重要意義。【
發明內容】[0008]本發明的第一個目的在于提供一種人外周血蛋白HAS中對葡糖糖不敏感的內標肽段。[0009]本發明的第二個目的在于提供用于糖尿病早期診斷的多肽標志物。[0010]本發明的第三個目的在于提供一種基于質譜技術的早期糖尿病診斷試劑盒。[0011]本發明提供的用于檢測早期糖尿病的內標多肽，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.1所述的氨基酸序列，m/z=977.4。[0012]本發明提供了上述內標多肽在制備早期糖尿病診斷試劑盒中的應用。[0013]本發明提供了一種篩選上述內標多肽的方法，包括以下步驟:[0014](I)體外糖基化樣品的制備，將無菌HSA于50mMpH7.4的PBS緩沖液中配成生理濃度的溶液，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應體系作為空白對照；[0015]所述HSA的生理濃度為40mM/mL。[0016](2)胰酶消化，將蛋白樣品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3緩沖液中，向每200μg經糖基化的HSA與空白對照HSA樣品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT(二硫蘇糖醇)溶液進行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封閉氨基酸側鏈的活潑基團，于黑暗處反應lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;[0017](3)180標記，將凍干后的肽段樣品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次凍干備用；向未經修飾的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分別用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶=I~125:l，w/w)，在37°C水浴中標記8~24小時；[0018](4)對樣品分別進行HPLC/ES1-TOFMS定量分析和HPLC/ES1-1onTrapMS定性分析；[0019](5)數據分析與內標肽段的選擇，Agilent公司MassHunter軟件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的數據特征，提取參數:保留時間8.00-45.0Omin;質荷比m/Z300-1800;信噪比閾值S/N5;譜峰數目1000X1000;選中肽同位素分布；PeakPair軟件被用于挑選相應肽段的160/180峰對，并計算出160/180峰面積的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面積的比值小于1，則說明未經修飾的HSA來源的肽段被消耗，該肽段擁有易被修飾的糖基化位點，經過糖基化過程，生成了帶有糖鏈修飾的新肽段；若160/180峰面積的比值等于1，則說明該肽段經過與葡萄糖共育并未被消耗，不存在對葡萄糖敏感的糖基化位點；在TOFMS數據中，發現I個葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7均可在每一次質譜檢測中穩定地被檢測到，質譜信號達到105，肽段的160/180峰面積比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，選擇該肽段為內標肽段。[0020]優選地，步驟(2)中，HSA:胰蛋白酶的質量比=50:1，于37°C水浴孵育20h。[0021]優選地，步驟(3)中，肽段樣品溶于50mMpH6.0的KH2PO4溶液中后再次凍干備用；HSA:胰蛋白酶=50:1，在37°C水浴中標記20小時[0022]進一步地，步驟(3)還包括在標記完成后，殘余的胰蛋白酶需經滅活處理，將樣品在沸水中煮10分鐘，再按照體積比加入5%的甲酸。[0023]更進一步地，步驟(3)中標記體系尿素濃度控制在2M以下。[0024]在本發明的一個實施例中，步驟(4)中樣品定量分析采用AgilentllOO系列高效液相色譜儀串聯ES1-TOF(Agilent6210)進行。[0025]優選地，在HPLC/ES1-TOFMS分析之前，樣品需經過離心處理，離心條件為17，OOOXgj15min。[0026]其中，步驟(4)所述的HPLC/ES1-TOFMS定量分析的液相色譜條件為:色譜柱為GraceC18柱,300人，2.1mmX150mm;流速0.2mL/min;進樣量10μg;所用流動相為:A相為含0.1%甲酸的水溶液；B相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫條件為:3%B，O—8min;3-40%B,8—35min;40-95%B,35—40min;95%B,40—43min以及95_3%Bfrom43—45min;Postrun為IOmin；ES1-TOFMS條件為:以氮氣作為干燥氣和霧化氣，干燥氣流速10L/min;干燥氣溫度為350°C;霧化器壓力為35psi;采用正離子模式；毛細管電壓為-3.5kV;毛細管出口電壓160V;錐孔電壓60V；MS掃描范圍為m/z300-1800；[0027]另外，步驟(4)中，對于樣品的定性分析，采用HPLC/ES1-1onTrapMS方法分析，樣品定性分析的液相色譜條件和質譜ESI離子源條件與上述HPLC/ES1-TOF分析的條件相同；MS掃描范圍為m/z300-1800;最大累積時間100ms，MS譜圖平均2次；目標質量數900，化合物穩定性100%，阱深100%；MS/MS才有優選方法；隔離寬度4;母離子數2;母離子強度絕對閾值100000，相對閾值0.1%;動態排除2次并在0.5min釋放；MS/MS碎裂電壓1.2V；MS/MS譜圖平均2次。[0028]本發明還提供了一種與上述內標多肽聯合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標志物，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列，m/z=614.8。[0029]本發明提供了具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列的多肽在制備糖尿病早期診斷試劑盒中的應用。[0030]本發明提供了一種與上述內標多肽聯合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標志物，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.5所述的氨基酸序列，m/z=537.7。[0031]本發明提供了具有SEQIDN0.5所述的氨基酸序列的多肽在制備糖尿病早期診斷試劑盒中的應用。[0032]本發明提供了一種與上述內標多肽聯合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標志物，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.11所述的氨基酸序列，m/z=820.5。[0033]本發明提供了具有SEQIDN0.11所述的氨基酸序列的多肽在制備糖尿病早期診斷試劑盒中的應用。[0034]本發明提供一種用于診斷早期糖尿病的試劑盒，其工作程序為:(1)采集血液以及獲得血漿；(2)將血漿樣本按照進行酶切，酶切條件為:向例血漿樣品中加入16μL含8Μ尿素的IOmMDTT溶液進行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA溶液甲基化封閉氨基酸側鏈的活潑基團，于黑暗處反應lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;(3)HPLC-ES1-TOFMS檢測多肽樣品；(4)讀取生物標志物肽段(FKDLGEENFK、LDELRDEGK和/或KVPQVSTPTLVEVSR)與內標肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的質譜峰面積，分別計算生物標志物肽段和內標肽段質譜峰面積的比值；(5)考察比值所處的范圍，判斷糖尿病發生的風險程度，對早期糖尿病進行診斷:若肽段FKDLGEENFK(m/z=614.8)與內標肽段離子(m/z=977.4)峰面積之比在0.012-0.026之間，則有樣品來源的宿主有較大的罹患糖尿病的風險；若比值在0.034-0.121之間，則有潛在的罹患糖尿病的風險；若比值在0.115-0.330之間，則說明宿主罹患糖尿病的風險較小。若LDELRDEGK(m/z=537.7)與內標肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)峰面積之比值在0.075-0.609之間，則樣品來源的宿主有較大的罹患糖尿病的風險。KVPQVSTPTLVEVSR(m/z=820.5)與內標肽段AAFTECCQAADKAACLLPK(m/z=977.4)的比值中，若比值在0.010-0.031之間，則有較大的罹患糖尿病的風險；若比值在0.021-0.100之間，則有潛在的罹患糖尿病的風險；若比值在0.070-0.289之間，則說明樣品來源的宿主罹患糖尿病的風險較小。[0035]本發明還提供了一種體外模型篩選糖尿病多肽標志物的方法，包括以下步驟:[0036](1)體外糖基化樣品的制備，將無菌HSA于50mMpH7.4的PBS緩沖液中配成生理濃度的溶液40mM/mL，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應體系作為空白對照；[0037](2)胰酶消化，將蛋白樣品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3緩沖液中，向每200μg經糖基化的HSA與空白對照HSA樣品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT(二硫蘇糖醇)溶液進行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA(碘乙酰胺)溶液甲基化封閉氨基酸側鏈的活潑基團，于黑暗處反應lh，再加入溶于pH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;[0038](3)180標記，將凍干后的肽段樣品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次凍干備用；向未經修飾的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分別用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶=1~125:1，w/w)，在37°C水浴中標記8~24小時，標記完成后，殘余的胰蛋白酶需經滅活處理，將樣品在沸水中煮10分鐘，再加入5%的甲酸(v/v)；在HPLC-MS進行分析之前，樣品需經過高速離心處理(17，OOOXg,15min)，以確保無不溶物進到HPLC-MS分析系統里。體系尿素濃度控制在2M以下；[0039](4)HPLC/ES1-TOFMS方法對樣品進行定量分析，和用HPLC/ES1-1onTrapMS方法對樣品進行定性分析；[0040](5)數據分析與內標肽段的選擇，Agilent公司MassHunter軟件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的數據特征，提取參數:保留時間8.00-45.0Omin;質荷比m/Z300-1800;信噪比閾值S/N5;譜峰數目1000X1000;選中肽同位素分布；PeakPair軟件被用于挑選相應肽段的160/180峰對，并計算出160/180峰面積的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面積的比值小于1，則說明未經修飾的HSA來源的肽段被消耗，該肽段擁有易被修飾的糖基化位點，經過糖基化過程，生成了帶有糖鏈修飾的新肽段；若160/180峰面積的比值等于1，則說明該肽段經過與葡萄糖共育并未被消耗，不存在對葡萄糖敏感的糖基化位點；在TOFMS數據中，發現I個葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7均可在每一次質譜檢測中穩定地被檢測到，質譜信號達到105，肽段的160/180峰面積比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，選擇該肽段為內標肽段；[0041](6)分別考察濃度為6.0mM,24.9mM、49.8mM以及249.0mM的葡萄糖溶液，在不同孵育時間10天、20天和30天下HSA糖基化修飾的濃度依賴性，以內標肽段的單同位素峰面積為標準，用其他3反應時間延長或葡萄糖溶液濃度變大而下調的肽段單同位素峰面積之t匕，選擇具有質譜信號強度、肽段離子在每次質譜檢測中均可被穩定的捕捉到，且在HPLC/ES1-TOFMS和HPLC/ES1-1onTrapMS檢測中同時滿足相同的保留時間和質荷比的誤差在可接受范圍內，其中ΔRt=±0.2min,—級質譜Δm/z=±0.3,側重于表現糖基化修飾具有時間依賴性和濃度依賴性的離子，篩選得到易被修飾的葡萄糖敏感肽段。[0042]上述方法中，在本發明的實施例中，樣品HPLC/ES1-TOFMS定量分析采用AgilentllOO系列高效液相色譜儀串聯ES1-T0FMS(Agilent6210)進行，樣品定性分析采用均AgilentllOO系列高效液相色譜儀串聯ES1-1onTrapMSD。[0043]HPLC/ES1-TOFMS分析液相色譜條件為:色譜柱為GraceC18柱(300A，2.1mmX150mm);流速0.2mL/min;進樣量IOyg;所用流動相為:A相為含0.1%甲酸的水溶液相為含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脫條件為:3%B，0—8min;3-40%B，8—35min;40-95%B,35—40min;95%B,40—43min以及95_3%Bfrom43—45min;Postrun為IOmin；ES1-TOFMS條件為:以氮氣作為干燥氣和霧化氣(干燥氣流速10L/min;干燥氣溫度為350°C;霧化器壓力為35psi);采用正離子模式；毛細管電壓為-3.5kV;毛細管出口電壓160V;錐孔電壓60V；MS掃描范圍為m/z300-1800amu；[0044]HPLC/ES1-1onTrapMS分析，樣品定性分析的液相色譜條件和質譜ESI離子源條件與上述HPLC/ES1-TOF分析的條件相同；MS掃描范圍為m/z300-1800;最大累積時間100ms,MS譜圖平均2次；目標質量數900，化合物穩定性100%，阱深100%；MS/MS才有優選方法；隔離寬度4;母離子數2;母離子強度絕對閾值100000，相對閾值0.1%;動態排除2次并在0.5min釋放；MS/MS碎裂電壓1.2V；MS/MS譜圖平均2次。[0045]在過往的研究中，研究者們的傳統觀點普遍是認為功能性蛋白為低豐度蛋白，因而生物標志物也會來自低豐度蛋白，因而研究思路也往往偏離了本發明的方向。而本發明的主要創新之處在于選擇了高豐度蛋白作為研究對象，研究發現，糖基化反應屬于非酶催化的化學反應，不具有選擇性。因此外周血高豐度蛋白有更高的概率被葡萄糖所修飾，而修飾的程度則反映體內尚未代謝掉的葡萄糖的水平，且血糖的改變也會在蛋白上得到體現，因而可以比測量血糖水平更敏銳的發現罹患糖尿病的趨勢，同時規避了低豐度蛋白在檢測上的困難，包括難以達到準確定量等不利因素。[0046]本發明篩選并驗證得到了一組有效、典型葡萄糖敏感肽段，這既彌補了單一生物標志物特異性不高、準確性欠佳等問題，又創新性的提出了用HSA自身酶切得到葡萄糖不敏感肽段作為內標，以葡萄糖敏感肽段和內標肽段峰面積之比作為糖基化修飾程度指標，這一新思路巧妙地解決了臨床樣品中存在較大個體差異，而使得相對定量存在較大困難的問題。本發明提出了定量肽類生物標志物作為臨床糖尿病早期診斷的新策略，獲得了預防和監測糖尿病的相關指標。這對于糖尿病的早期診斷和有效干預有重大意義和光明的前景。【專利附圖】【附圖說明】[0047]圖1為不同胰蛋白酶與HSA的比例對酶解效率的影響圖。[0048]圖2為不同酶解時間對酶解效率的影響圖。[0049]圖3為18O標記與未標記肽段單獨分析或l:l(v/v)混合分析質譜圖:圖3A為HSA酶切所得肽段m/z=537.7經18O標記后的質譜圖。其中1^111/2=537.7)為未標記18O原子的肽段的單同位素峰；1:011/2=538.7)為標記一個18O原子的肽段的單同位素峰；I2(m/z=539.7)為標記一個18O原子的肽段的單同位素峰。圖3Β1:1(v/v)混合分析時所得肽段(m/z=614.8，z=2)的16O-18O質譜峰對，18O標記與未標記肽段的單同位素峰其質量數相差4Da。圖3B顯示的是HSA肽段(m/z=614.8,z=2)在18O標記和未標記樣品1:1(v/v)混合分析時的質譜圖。其160/180峰面積的比值，按照簡化后的方法僅計算單同位素的峰面積，應為m/z=614.8的峰面積比上m/z=616.8的峰面積等于0.81。[0050]圖4不同尿素濃度對標記比例的影響圖，其中圖4A可被穩定檢測到的57個酶切后HSA肽段，在不同尿素濃度下標記比例的平均值；圖4B標記比例值最低的4個肽段，其標記效率對尿素濃度的變化趨勢。[0051]圖5標記緩沖液pH值、濃度以及酶切終止方式對標記比例的影響圖，其中圖5A標記緩沖液PH值對標記比例的影響；圖5B為KH2PO4-K2HPO4濃度對4個標記比例最低的肽段的影響；圖5C為使用甲酸終止酶解對后續標記步驟標記比例的影響。[0052]圖6標記時間對標記效率的影響。[0053]圖7為優化條件下57個可被穩定檢測的HSA肽段標記效率的分布情況。[0054]圖8不同孵育時間與不同葡萄糖濃度下的葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK的160/180相對峰面積比例。[0055]圖9為比較的方法示意圖，其中比例I是與葡萄糖共育的葡萄糖敏感肽段與內標肽段的峰面積之比，這一比值越小說明糖基化的程度越高；比例2是對照組葡萄糖敏感肽段與內標肽段的峰面積之比，這一比例用于校正不同肽段之間由于其它因素導致的差異，如離子化效率等；而最終衡量一個葡萄糖敏感肽段的變化的比例為比例I與比例2之比。[0056]圖10為HSA與不同濃度葡萄糖溶液發生糖基化反應的情況，圖1OA為HSA肽段與葡萄糖溶液共育10天后各肽段的160/180峰面積之比；圖1OB為HSA肽段與葡萄糖溶液共育20天后各肽段的160/180峰面積之比；圖1OC為HSA肽段與葡萄糖溶液共育30天后各肽段的160/180峰面積之比。[0057]圖11軟件模擬內標肽段與葡萄糖敏感肽段在HSA空間結構中的位置圖。[0058]圖12為混合血漿樣品中葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK在不同孵育時間與不同葡萄糖濃度下的160/180相對峰面積比例。[0059]圖13HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段FKDLGEENFK，其中圖13A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段FKDLGEENFK在不同孵育時間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖13B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時間被修飾的情況；圖13C為肽段FKDLGEENFK在不同孵育時間下與不同濃度葡萄糖共育后經HPLC-MS檢測的質譜峰圖。[0060]圖14是肽段ETYGEMADCCAK與6.0mM葡萄糖共孵育10天的質譜圖。[0061]圖15HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段YLYEIAR，其中，其中圖15A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段YLYEIAR在不同孵育時間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖15B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段YLYEIAR在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時間被修飾的情況；圖15C為肽段YLYEIAR在不同孵育時間下與不同濃度葡萄糖共育后經HPLC-MS檢測的質譜峰圖。[0062]圖16HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段LDELRDEGK，其中圖16A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段LDELRDEGK在不同孵育時間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖16B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段LDELRDEGK在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時間被修飾的情況；圖16C為肽段LDELRDEGK在不同孵育時間下與不同濃度葡萄糖共育后經HPLC-MS檢測的質譜峰圖。[0063]圖17HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段LSQRFPK，其中圖17A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中目標肽段在不同孵育時間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖17B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中目標肽段在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時間被修飾的情況；圖17C為肽段LSQRFPK在不同孵育時間下與不同濃度葡萄糖共育后經HPLC-MS檢測的質譜峰圖。[0064]圖18HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段LVTDLTK，其中圖18A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段LVTDLTK在不同孵育時間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖18B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段LVTDLTK在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時間被修飾的情況；圖18C為肽段LVTDLTK在不同孵育時間下與不同濃度葡萄糖共育后經HPLC-MS檢測的質譜峰圖。[0065]圖19HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段DVFLGMFLYEYAR，其中圖19A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段DVFLGMFLYEYAR在不同孵育時間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況；圖19B為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段DVFLGMFLYEYAR在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時間被修飾的情況；圖19C為肽段DVFLGMFLYEYAR在不同孵育時間下與不同濃度葡萄糖共育后經HPLC-MS檢測的質譜峰圖。[0066]圖20HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段RHPDYSVVLLLR。[0067]圖21為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段CCAAADPHECYAK在不同孵育時間下被不同濃度葡萄糖修飾的情況。[0068]圖22A為HPLC-MS檢測混合血漿樣本中肽段CCAAADPHECYAK在濃度葡萄糖存在下于不同孵育時間被修飾的情況。圖22B為肽段CCAAADPHECYAK在不同孵育時間下與不同濃度葡萄糖共育后經HPLC-MS檢測的質譜峰圖。圖22CHPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段KVPQVSTPTLVEVSR。[0069]圖23HPLC-MS檢測混合血漿樣品體外模型中的肽段CCTESLVNR。[0070]圖24為糖尿病肽類生物標志物臨床驗證實驗流程圖。[0071]圖25臨床樣品中內標肽段離子m/z=977.4峰面積信息的獲得。[0072]圖26臨床樣品不同組別中檢測目標肽段FKDLGEENFK。[0073]圖27臨床樣品不同組別中檢測目標肽段YLYEIAR。[0074]圖28臨床樣品不同組別中檢測目標肽段LDELRDEGK。[0075]圖29臨床樣品不同組別中檢測目標肽段LVTDLTK。[0076]圖30HPLC-MS無法實現T2DM臨床樣品中肽段DVFLGMFLYEYAR的檢測。[0077]圖31臨床樣品不同組別中檢測目標肽段KVPQVSTPTLVEVSR。[0078]圖32糖尿病肽類生物標志物候選物在HSA上空間位置。【具體實施方式】[0079]以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。[0080]若未特別指明，實施例中所用的生物化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的儀器耗材均為市售；若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。[0081]實施例1體外建立基于HAS單一蛋白篩選葡萄糖敏感肽段的模擬體內糖基化模型[0082]1、體外糖基化樣品的制備[0083]體外糖基化樣品的制備基本可依據文獻報道的方法【Sattarahmady,N.,etal.,Formationofthemoltenglobule-likestateduringprolongedglycationofhumanserumalbumin.[J].BiochimBiophysActa,2007.1770(6):p.933-42]D將未經修飾的人血清白蛋白(HAS)(純度≥96%，購自北京拜爾迪生物技術有限公司)于50mMPBS(pH7.4)緩沖液中配成生理濃度的溶液(40mM/mL)，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10天、20天和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415。4個葡萄糖濃度分別依據生理葡萄糖濃度(~12.05%糖基化位點覆蓋率)、理論50%糖基化位點覆蓋率、理論100%糖基化位點覆蓋率以及葡萄糖過量5倍而設計。每個濃度和孵育時間下分別制備三個平行樣品，以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應體系作為空白對照。所有溶液事先均經過無菌處理，方法如下:在超凈工作臺中，使用0.2μm無菌針頭式過濾器(PALL,Φ13mm,Supor親水性聚醚砜膜)過濾除菌，將樣品轉入經無菌處理的離心管中，密封。且共育過程中，使用對二甲苯作為抑菌劑對溶液進行液封。孵育結束后的樣品，經冷凍干燥后儲存于_80°C冰箱中備用。[0084]2、胰蛋白酶消化條件的考察及優化[0085]實現完全酶解及保持酶解效率的穩定性是本發明的基礎，有必要對酶解條件進行優化，主要針對以下兩個方面。[0086]2.1考察最佳的HSA與胰蛋白酶比例[0087]為了了解最適宜的酶解時胰蛋白酶與HSA的比例,在固定了酶解時間為24h(保證充分酶解)的前提下，分別采用了trypsin:HSA=1:125、1:100、1:50、1:25以及1:10(w/w)五個條件進行測試，結果如圖1所示:[0088]在HSA酶解后進行HPLC/ES1-TOF分析時，隨機選擇了不同保留時間的肽段峰面積計算蛋白的酶解效率，在對比胰酶用量對酶切進行的影響時，每個比例下的進樣均選擇相同的肽段。在圖1中，橫坐標為胰蛋白酶用量從少到多的5個比例，縱坐標為胰蛋白酶與HSA不同比例下,HSA酶解效率與trypsin:HSA=l:50(w/w)時酶解效率的比值。從圖1所示的結果來看，隨著胰蛋白酶用量的增加，酶解效率從trypsin:HSA=1:125至1:50(w/w)逐漸增加，當胰蛋白酶的用量超過trypsin:HSA=l:50(w/w)時,酶解效率不隨胰酶用量的增多而提高，因此過多的胰酶使用量只能帶來胰酶的浪費。經過考察，最佳的胰蛋白酶與HSA比例為I:50(w/w)ο[0089]2.2考察最佳的酶解時間[0090]將HSA變性、封閉，加入胰酶之后在37°C水浴孵育，按設計的時間點取樣，進樣至HPLC/ES1-TOFMS，按照肽段的峰面積計算酶解效率，情況如圖2所示。[0091]圖2的橫坐標表示不同取樣時間點,縱坐標為不同酶解時間下,HSA酶解效率與酶解16小時酶解效率的比值。從圖2所示的結果來看，隨著酶解時間的延長，酶解效率從0.5h至16h逐漸增加，當酶解時間超過16h以后，無論孵育時間延長多久，酶解效率不再隨時間的延長而提高，而是穩定在一個平衡的狀態。但是，最終的實驗方案將酶解時間定為20h，這是為了確保HSA得到充分的酶解。[0092]3,18O標記條件的考察及優化[0093]用分步法分別實現蛋白的酶解和酶解后肽段的18O標記。在第一步的酶解過程中，需要引入尿素作為變性劑，使得蛋白結構變松散，有利于酶切位點的識別，而尿素會滯留在反應體系內，對接下來的18O標記過程具有一定的干擾作用。因此需考察標記反應時體系內的尿素濃度對標記效率的影響。標記緩沖液的條件也需要被考察，包括緩沖液的PH值及其濃度。PH值直接關系到催化標記反應的胰酶的活性，因此pH值的選擇可能對標記效率有很大影響。此外，標記時間對18O標記效率也具有一定影響，時間過短達不到最大標記比例；時間過長亦不會對提高標記效率起到有利作用。最終，還要對優化條件在完成的18O標記的標記質量進行評估，以確定可達到穩定且高效率的標記。[0094]不同的肽段由于其氨基酸序列不同，會有空間結構上的差異，以至于被胰酶催化進行18O標記的活性也不同，因此不同種類的肽段的標記效率也存在差異。但盡管如此，標記作為一個可逆反應，不同肽段在達到標記平衡時所能獲得的最大標記比例是相同的。其原因在于，當達到標記平衡時，標記比例不再取決于胰酶催化的活性，而只與H218O純度有關。對于本發明使用的97%的!12180而言，達到標記平衡時所標記上2個18O的最大比例為:97%X97%=94.09%。標記的速率不同，到達最大標記比例所用的時間就不同。[0095]肽段經過18O標記后，由于無法實現完全標記因而存在三種類型的肽段:未標記上18O原子的肽段、標記上一個18O原子的肽段和標記上兩個18O原子的肽段，如圖3A所示。在本發明中，標記比例指的是標記上兩個18O原子的肽段占總肽段的百分比；而相對標記效率指的是標記比例與理論最大標記效率的相對比值。于是在本發明中，標記效率被定義為相對標記比例。為了簡化計算，擬采用單同位素峰的峰面積來計算標記比例，計算方法如下:【權利要求】1.一種用于早期糖尿病診斷的內標多肽，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.1所述的氨基酸序列。2.權利要求1所述的內標多肽在制備早期糖尿病診斷試劑盒中的應用。3.一種篩選權利要求1所述內標多肽的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)體外糖基化樣品的制備，將無菌HSA于50mMpH7.4的PBS緩沖液中配成生理濃度的溶液，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應體系作為空白對照；(2)胰酶消化，蛋白樣品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3緩沖液中，向每200μg經糖基化的HSA與空白對照HSA樣品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT溶液進行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA溶液甲基化封閉氨基酸側鏈的活潑基團，于黑暗處反應lh，再加入溶于PH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;(3)180標記，將凍干后的肽段樣品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后凍干備用；向未經修飾的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分別用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶，HSA:胰蛋白酶質量比=1~125:1，在37°C水浴中標記8~24小時；(4)HPLC/ES1-T0FMS方法對樣品進行定量分析和用HPLC/ES1-1onTrapMS方法對樣品進行定性分析；(5)數據分析與內標肽段的選擇,Agilent公司MassHunter軟件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的數據特征，提取參數:保留時間8.00-45.0Omin;質荷比m/z300_1800；信噪比閾值S/N5;譜峰數目1000X1000;選中肽同位素分布；PeakPair軟件被用于挑選相應肽段的160/180峰對，并計算出160/180峰面積的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面積的比值小于1，則說明未經修飾的HSA來源的肽段被消耗，該肽段擁有易被修飾的糖基化位點，經過糖基化過程，生成了帶有糖鏈修飾的新肽段；若160/180峰面積的比值等于1，則說明該肽段經過與葡萄糖共育并未被消耗，不存在對葡萄糖敏感的糖基化位點；在--MS數據中，發現I個葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7min均可在每一次質譜檢測中穩定地被檢測到，質譜信號達到105，肽段的160/180峰面積比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，選擇該肽段為內標肽段。4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)還包括在標記完成后，殘余的胰蛋白酶需經滅活處理，將樣品在沸水中煮10分鐘，再按照體積比加入5%的甲酸。5.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)中標記體系尿素濃度控制在2M以下。6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，在HPLC/ES1-TOFMS分析之前，樣品需經過離心處理，離心條件為17,OOOXg,15min。7.一種與權利要求1所述內標多肽聯合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標志物，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.2所述的氨基酸序列。8.一種與權利要求1所述內標多肽聯合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標志物，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.5所述的氨基酸序列。9.一種與權利要求1所述內標多肽聯合使用用于檢測早期糖尿病的多肽標志物，其特征在于，其來源于人血清白蛋白，具有SEQIDN0.11所述的氨基酸序列。10.一種體外模型篩選糖尿病多肽標志物的方法，其特征在于，包括以下步驟:(1)體外糖基化樣品的制備，將無菌HSA于50mMpH7.4的PBS緩沖液中配成生理濃度的溶液，分別與4種不同濃度的D-葡萄糖在37°C水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA與D-葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:41.5、1:83和1:415;以同樣條件下不添加D-葡萄糖溶液的反應體系作為空白對照；(2)胰酶消化，將蛋白樣品溶于50mMpH8.3的NH4HCO3緩沖液中，向每200μg經糖基化的HSA與空白對照HSA樣品中加入20μL含8M尿素的IOmMDTT溶液進行變性，于37°C水浴孵育4h，再加入50mMIAA溶液甲基化封閉氨基酸側鏈的活潑基團，于黑暗處反應lh，再加入溶于PH8.3的NH4HCO3緩沖液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的質量比=10~125:1，于37°C水浴孵育8~20h;(3)180標記，將凍干后的肽段樣品溶于50~150mMpH4.0~7.0的KH2PO4溶液中后再次凍干備用；向未經修飾的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分別用H218O和H216O溶解的胰蛋白酶(HSA:胰蛋白酶質量比=1~125:1，在37°C水浴中標記8~24小時；(4)HPLC/ES1-TOFMS方法對樣品進行定量分析，和用HPLC/ES1-1onTrapMS方法對樣品進行定性分析；(5)數據分析與內標肽段的選擇,Agilent公司MassHunter軟件的MFE算法用于提取HPLC/ES1-TOFMS的數據特征，提取參數:保留時間8.00-45.0Omin;質荷比m/z300_1800；信噪比閾值S/N5;譜峰數目1000X1000;選中肽同位素分布；PeakPair軟件被用于挑選相應肽段的160/180峰對，并計算出160/180峰面積的比值用于肽段的定量分析，若160/180峰面積的比值小于1，則說明未經修飾的HSA來源的肽段被消耗，該肽段擁有易被修飾的糖基化位點，經過糖基化過程，生成了帶有糖鏈修飾的新肽段；若160/180峰面積的比值等于1，則說明該肽段經過與葡萄糖共育并未被消耗，不存在對葡萄糖敏感的糖基化位點；在--MS數據中，發現I個葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4，Rt=28.7均可在每一次質譜檢測中穩定地被檢測到，質譜信號達到105，肽段的160/180峰面積比例最接近I，且SD值最小0.961±0.077，選擇該肽段為內標肽段；(6)分別考察濃度為6.0mM,24.9mM、49.8mM以及249.0mM的葡萄糖溶液，在不同孵育時間10天、20天和30天下HSA糖基化修飾的濃度依賴性，以內標肽段的單同位素峰面積為標準，用其他3反應時間延長或葡萄糖溶液濃度變大而下調的肽段單同位素峰面積之t匕，選擇具有質譜信號強度、肽段離子在每次質譜檢測中均可被穩定的捕捉到，且在HPLC/ES1-TOFMS和HPLC/ES1-1onTrapMS檢測中同時滿足相同的保留時間和質荷比的誤差在可接受范圍內，其中ΔRt=±0.2min,—級質譜Δm/z=±0.3,側重于表現糖基化修飾具有時間依賴性和濃度依賴性的離子，篩選得到易被修飾的葡萄糖敏感肽段。【文檔編號】G01N30/02GK103897035SQ201410090215【公開日】2014年7月2日申請日期:2014年3月12日優先權日:2013年9月4日【發明者】鄧玉林,張玫申請人:北京理工大學
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