沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法【專利摘要】沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，涉及微型藻的分離。提供一種用于穩定同位素測定的沿岸水體泥質或泥沙質沉積物表層的底棲微型藻類樣品的提取方法。采集沉積物，在沉積物表層鋪設第一層沙層，在第一層沙層表面覆上篩絹，篩絹上再鋪設第二層沙層，從上到下形成“第二層沙層-篩絹-第一層沙層-沉積物層”的四層結構，在第二層沙層上噴灑過濾海水濕潤沙表面，蓋上透光外罩并放在有光的環境中；收集篩絹上的沙至海水中并攪拌，使底棲微型藻類充分懸浮，待沙沉淀后，導出上層水液，經篩絹過濾攔截可能的細沙顆粒，然后將濾液過濾至GF/F膜上，即得沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類，可用于碳、氮穩定同位素的測定。【專利說明】沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法【
技術領域：
】[0001]本發明涉及微型藻的分離，尤其是涉及一種用于穩定同位素測定的沿岸水體泥質或泥沙質沉積物表層的底棲微型藻類樣品的提取方法，主要用于提取具有運動能力的羽紋硅藻和具鞭毛的甲藻等藻類，通過該技術可以提取環境中含量較低的微型藻類，用于穩定同位素測定以及用于底棲微型藻類的進一步純化、培養的粗樣品需求。【
背景技術：
】[0002]在沿岸海洋生態系統中，初級生產者是支持食物網正常流轉的物質基礎或有機碳的來源。在這些初級生產者中，底棲微型藻類在河口、潟湖、潮灘等沿岸淺水系統的營養貢獻得到廣泛的關注(MillerDC,GeiderRJ,MacIntyreHL.Microphytobenthos:theecologicalroleofthe“secretgarden，，ofunvegetated,shallow-watermarinehabitats.11.Roleinsedimentstabilityandshallow-waterfoodwebs.Estuaries,1996,19:202-212;AnselIA,GibsonR,BarnesM.Theroleofbenthicmicroalgaeinneriticecosystems.0ceanographyandmarinebiology:anannualreview,1999，37:47-86)。許多研究表明，在近岸的海草床生態系統和鹽沼濕地，底棲微型藻類在食物網的營養動態中扮演著重要的角色(MoncreiffCA,SullivanMJ.Trophicimportanceofepiphyticalgaeinsubtropicalseagrassbeds:evidencefrommultiplestableisotopeanalyses.MarineEcology-ProgressSeries,2001，215:93-106)。[0003]在食物網研究中，穩定同位素示蹤技術是用于追溯消費者有機碳源及確定其營養級的有效工作。在底質為泥質或泥沙質沉積物的沿岸淺水系統，卻很少人關注底棲微型藻類在食物網營養動態中的作用。這主要是由于泥質或泥沙質水質渾濁，傳統的方法很難獲取純凈、無污染的底棲微型藻類樣品。有研究表明，在無植被覆蓋的沿岸淺水系統底棲微型藻類生物量和生產力高(MacIntyreHL,GeiderRJ,MillerDC.Microphytobenthos:theecologicalroleofthe“secretgarden^ofunvegetated,shallow-watermarinehabitats.1.Distribution,abundanceandprimaryproduction.Estuaries,2006,19:186-201)。許多研究也顯示，底棲微型藻類可能是消費者重要的碳源，如棲息在沉積物中的多毛類，小型甲殼動物以及植食性螺和濾食性雙殼類等軟體動物(KangCK,KimJB,LeeKS,KimJB,LeePY,HongJS.TrophicimportanceofbenthicmicroalgaetomacrozoobenthosincoastalbaysystemsinKorea:dualstableCandNisotopeanalyses.MarineEcologyProgressSeries,2003,259:79-92;YokoyamaH,IshihiY.FeedingofthebivalveTheoralubricaonbenthicmicroalgae:1sotopicevidence.MarineEcologyProgressSeries,2003，255:303-309)。魚類胃含物的分析結果顯示，底棲微型藻類是鯔魚，羅非魚等雜食性魚類的重要食物來源(黃良敏，張雅芝，潘佳佳，等.廈門東海域魚類食物網研究.臺灣海峽，2008，27:64-73;LinHJ,KaoWY,WangYT.Analysesofstomachcontentsandstableisotopesrevealfoodsourcesofestuarinedetritivorousfishintropical/subtropicalTaiwan.Estuarine,CoastalandShelfScience,2007，73:527-537)。因此，在利用穩定同位素技術研究沿岸系統的食物網動態時，底棲微型藻類的作用不容忽視，這對充分理解沿岸生態系統結構和功能具有重要的意義。【
發明內容】[0004]本發明的目的是提供一種用于穩定同位素測定的沿岸水體泥質或泥沙質沉積物表層的底棲微型藻類樣品的提取方法。[0005]本發明包括以下步驟:[0006]I)采集沉積物，在沉積物表層鋪設第一層沙層，在第一層沙層表面覆上篩絹，篩絹上再鋪設第二層沙層，從上到下形成“第二層沙層-篩絹-第一層沙層-沉積物層”的四層結構，在第二層沙層上噴灑過濾海水濕潤沙表面，蓋上透光外罩并放在有光的環境中；[0007]2)收集篩絹上的沙至海水中并攪拌，使底棲微型藻類充分懸浮，待沙沉淀后，導出上層水液，經篩絹過濾攔截可能的細沙顆粒，然后將濾液過濾至GF/F膜上，即得沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類，可用于碳、氮穩定同位素的測定。[0008]在步驟I)中，所述沉積物的厚度可為I?2cm，沉積物的表面積最好在0.04m2以上，保證可以在環境較低的藻密度下提取足夠用于穩定同位素分析的樣品；所述沉積物的表面最好完整，沒有被擾動和翻轉；[0009]所述第一層沙層的厚度最好是0.5mm,第一層沙層的沙顆粒粒徑最好是0.5?1mm，第一層沙層的沙可采用石英砂，所述沙最好預先在馬弗爐550°C灼燒4h以去除其中的有機質，然后將灼燒過的沙子濾洗，烘干；[0010]所述篩絹的孔徑可為63μm;篩絹是用于阻止棲息沉積物中的底棲動物進入沙層，但又能讓底棲微型藻類自由進出沙層，由于底棲微型藻類個體小，粒徑大多在63μm以下，因此所述的篩絹篩絹孔徑最好是63μm左右的孔徑；[0011]所述第二層沙層的厚度可為0.5cm;[0012]所述過濾海水可取自采樣區域的海水且需經過0.22μm的微孔濾膜過濾(無菌水)；[0013]所述透光外罩可米用玻璃外罩或亞克力外罩等；[0014]所述有光的環境可以是現場或實驗室，但以現場為最佳，可以避免運輸過程中可能的污染和干擾。[0015]在步驟2)中，所述海水可采用經0.22μm濾膜過濾的海水；所述篩絹可采用孔徑為63μm的篩絹；所述GF/F膜可采用預先在馬弗爐550°C灼燒過的GF/F膜，GF/F膜可采用玻璃纖維膜等，GF/F膜最好經酸化、水洗去酸和烘干。[0016]所述收集篩絹上的沙的容器最好是玻璃容器，且經過酸泡、用超純水洗凈、烘干；所述攪拌用的棒最好是玻璃棒，且經過酸泡、用超純水洗凈、烘干。[0017]本發明的意義在于獲取一種提取泥、泥沙質沉積物表層底棲微型藻類的分離技術，通過該方法獲得比較純凈，少有機碎屑干擾的底棲微型藻類樣品用于碳、氮穩定同位素測定。[0018]本發明旨在獲得可以用于碳、氮穩定同位素測定的底棲微型藻類樣品。本發明的原理是利用底棲微型藻類大多是具有一定運動能力的羽紋硅藻和具鞭毛的甲藻等藻類，可在沉積物表面上下移動。本發明是根據底棲微型藻類的趨光特性而設計的提取方法。本發明簡單有效，提取的底棲微型藻類純度較高，有機碎屑少。通過本發明獲得的底棲微型藻類還可以進一步用于單個藻種的純化培養。【專利附圖】【附圖說明】[0019]圖1為鋪設沙層后整個技術框架的示意圖。[0020]圖2為利用該方法獲取的底棲微型藻類。【具體實施方式】[0021]下面結合附圖對本發明作進一步說明。[0022]用箱氏采樣器采集沉積物，用鏟子采集表層Icm的沉積物I于搪瓷盆2中。沉積物表層鋪灑0.2?0.5cm厚的第一沙層4，細沙的粒徑在0.5?1mm，且須預先在馬弗爐550°C灼燒，水洗和烘干。第一沙層4表面覆上孔徑為63μm的篩絹5。篩絹5上再鋪設0.5cm厚的第二沙層6，從上到下形成“沙-篩絹-沙-沉積物”的四層結構(參見圖1)。在第二沙層6表面噴灑過濾海水濕潤沙表面。在搪瓷盆2上蓋上一個方形的亞克力外框3。[0023]5h后，收集篩絹上的沙至過濾海水(0.22μm)中并攪拌，使底棲微型藻類充分懸浮。約Imin后，導出上層水液，經63μm的篩絹過濾去除細沙后，將濾液過濾至經預先在馬弗爐550°C灼燒過的GF/F膜上，所得的樣品即為底棲微型藻類。將取0.5μI過濾液在顯微鏡下檢查，所得的底棲微型藻類為羽紋硅藻(參見圖2)。[0024]實施例1:表層沉積物葉綠素a含量的測定[0025]在某潟湖的內湖(NI?N5)、外湖(Wl?W4)設置站位，用重力式沉積物采樣器(參見中國專利CN201335783Y)采集沉積物樣品。用切去針頭端的50ml針筒采集采樣管中的樣品，在保溫箱中避光保存。帶回實驗室后，利用洗凈的竹片分層，每層1cm，共將沉積物分成3層。葉綠素a的濃度采用熒光法測量。在裝有樣品的IOml離心管內加90%丙酮研磨，經超聲、萃取、冷凍離心、定容，在HitachiF2500型熒光光度計上測定，整個過程盡量避光。計算公式為:葉綠素a濃度(μg/g)=FdX(Rb-Ra)Xr/(r-1)Xv/M。其中為萃取液定容體積(ml);M為樣品質量(g);&和Ra為樣品酸化前后的熒光值；Fd和r分別為由標準曲線而得到的換算因子和純葉綠素a的酸化比。結果表明(參見表I)，沉積物葉綠素a的含量基本隨著沉積物深度的增加逐漸降低，表層Icm的沉積物平均葉綠素a含量最高(4.03μg/g),遠高于I?2cm和2?3cm的沉積物的葉綠素a含量(1.47μg/g和0.87μg/g)。因此，在采集表層沉積物分離底棲微型藻類時，采集的表層沉積物的厚度至少Icm以上，最好在I?2cm左右。[0026]表I沉積物葉綠素a含量[0027]【權利要求】1.沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于包括以下步驟:1)采集沉積物，在沉積物表層鋪設第一層沙層，在第一層沙層表面覆上篩絹，篩絹上再鋪設第二層沙層，從上到下形成“第二層沙層-篩絹-第一層沙層-沉積物層”的四層結構，在第二層沙層上噴灑過濾海水濕潤沙表面，蓋上透光外罩并放在有光的環境中；2)收集篩絹上的沙至海水中并攪拌，使底棲微型藻類充分懸浮，待沙沉淀后，導出上層水液，經篩絹過濾攔截可能的細沙顆粒，然后將濾液過濾至GF/F膜上，即得沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類，可用于碳、氮穩定同位素的測定。2.如權利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述沉積物的厚度為I?2cm，沉積物的表面積在0.04m2以上。3.如權利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述第一層沙層的厚度為0.5mm，第一層沙層的沙顆粒粒徑最好是0.5?1mm，第一層沙層的沙可采用石英砂，所述沙最好預先在馬弗爐550°C灼燒4h以去除其中的有機質，然后將灼燒過的沙子濾洗，烘干。4.如權利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)和2)中，所述篩絹的孔徑為63μm。5.如權利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述第二層沙層的厚度為0.5cm。6.如權利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述過濾海水取自采樣區域的海水且需經過0.22μm的微孔濾膜過濾。7.如權利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟I)中，所述透光外罩米用玻璃外罩或亞克力外罩。8.如權利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟2)中，所述海水采用經0.22μm濾膜過濾的海水。9.如權利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟2)中，所述GF/F膜采用預先在馬弗爐550°C灼燒過的GF/F膜，GF/F膜可采用玻璃纖維膜，GF/F膜最好經酸化、水洗去酸和烘干。10.如權利要求1所述沿岸水體沉積物表層底棲微型藻類的提取方法，其特征在于在步驟2)中，所述收集篩絹上的沙的容器是玻璃容器，且經過酸泡、用超純水洗凈、烘干；所述攪拌用的棒最好是玻璃棒，且經過酸泡、用超純水洗凈、烘干。【文檔編號】G01N1/34GK103884537SQ201410136307【公開日】2014年6月25日申請日期:2014年4月4日優先權日:2014年4月4日【發明者】鄭新慶,藍文陸,林榮澄申請人:國家海洋局第三海洋研究所
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