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研究腦內源性神經干細胞遷移、增殖、分化的方法
【專利摘要】一種研究腦內源性神經干細胞遷移、增殖、分化的方法：1）對動物腦切片進行5溴脫氧尿嘧啶和雙腎上腺皮質激素、5溴脫氧尿嘧啶和神經元核心抗原、5溴脫氧尿嘧啶和膠質細胞源性神經營養因子雙標免疫熒光染色，以及唾液酸化神經細胞粘附因子單標免疫熒光染色；2）使用GraphPad?Prism6.0軟件統計分析數據并繪圖，5溴脫氧尿嘧啶陽性細胞為單因素多組數據使用one-way方差分析；所述動物腦切片經過以下處理：在腦右側紋狀體內立體定位注射6-羥多巴溶液后，在側腦室注射PSA特異性裂解酶原液，再腹腔注射5溴脫氧尿嘧啶溶液。本發明為研究腦內源性神經干細胞遷移影響提供了一種有效的研究方法。
【專利說明】研究腦內源性神經干細胞遷移、增殖、分化的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基礎醫學領域，具體地本發明涉及一種研究腦內神經干細胞的遷移、增值、分化等影響的方法。
【背景技術】
[0002]帕金森病(Parkinson’ s disease,PD)是一種常見的以黑質紋狀體通路病變為主要特征的中樞神經系統進行性退變性疾病。目前ro的發病機制尚未明確，是多種機制協同作用的結果。臨床上的療法都不能從根本上阻止ro病人黑質紋狀體通路的進行性退變，近來越來越多的人認為啟動腦內源性神經干細胞參與腦損傷修復很可能發展成為一個嶄新的治療腦損傷的策略。這一治療策略尤其適用于修復慢性腦損傷疾病-帕金森病。
[0003]目前經典藥物治療如口服左旋多巴(L-dopa)在初期可以減輕或緩解癥狀，但并不能延緩病程的進展，且長期使用有明顯的副作用，即L-dopa誘導的運動障礙。外科手術如深部腦刺激下丘腦核也只能暫時減輕或緩解癥狀。這些療法都不能從根本上阻止H)病人黑質紋狀體通路的進行性退變，啟動腦內源性神經干細胞參與ro腦損傷修復是一個嶄新的治療慢性腦損傷的策略。
[0004]神經發生就是指神經元發育的整個過程，從一個前體細胞分裂開始，一直到新的神經元成熟、整合并具有功能的過程。神經前體細胞能自我更新，但多處于靜止狀態。當CNS受損或變性時，細胞微環境發生改變，NSCs被激活，發生增殖、遷移、分化、整合，促進神經元再生及損傷部位腦組織結構和功能的恢復。成年腦有兩個神經生發區，在那里神經再生比較活躍:一個是側腦室傍邊的腦室管膜下區(SVZ);—個是海馬的粒細胞下區(SGZ)。這兩個部位神經干細胞所產生的未成熟的神經細胞(NeuiOblast)有各自的傳統遷移通路，SVZ所產生的未成熟神經細胞形成細胞簇，沿著嘴側遷移流(RMS)遷移到嗅球、分化成中間神經元；SGZ所產生的未成熟神經細胞則遷移到海馬齒狀回的粒細胞層，分化成中間神經元加入到神經回路中。揭示這些細胞遷移的分子機制和規律將會給引導這些細胞向腦損傷區遷移提供重要的理論依據。大量研究發現這兩種細胞的共同特點是細胞表面均表達很高水平的唾液酸化神經細胞粘附因子。當這些細胞到達目的地、分化成成熟中間神經元后，細胞表面的PSA表達就會消失，提示PSA-NCAM在未成熟神經細胞定向遷移中起重要的作用。有實驗表明如果將Endo-N注射到側腦室，傳統遷移通路RMS就會遭到破壞，SVZ所產生的未成熟神經細胞則向其他腦組織包括紋狀體異位遷移明顯增多。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種研究腦內源性神經干細胞遷移、增殖、分化的方法，為研究腦內源性神經干細胞遷移、增殖、分化等影響提供一種有效的方法。
[0006]為實現上述目的，本發明提供的研究腦內源性神經干細胞遷移、增殖、分化的方法:
[0007]I)對動物腦切片進行BrdU (5溴脫氧尿嘧啶)和DCX (雙腎上腺皮質激素)、BrdU和NeuN (神經元核心抗原)、BrdU和GFAP (膠質細胞源性神經營養因子)雙標免疫熒光染色，以及PSA-NCAM (唾液酸化神經細胞粘附因子)單標免疫熒光染色；
[0008]2)使用GraphPad Prism6.0軟件統計分析數據并繪圖，BrdU陽性細胞為單因素多組數據使用one-way ANOVA分析。
[0009]所述的方法中，動物腦切片經過以下處理:在腦右側紋狀體內立體定位注射6-0HDA (6-羥多巴胺)溶液后，在側腦室注射Endo-N (PSA特異性裂解酶)原液，再腹腔注射BrdU溶液。
[0010]所述的方法中，動物腦切片是指動物左右腦切片。
[0011 ] 所述的方法中，所述動物腦切片中包括有對照組腦切片。
[0012]所述的方法中，所述對照組腦切片是立體定位注射6-0HDA溶液后，在側腦室注射PBS緩沖液，再腹腔注射BrdU溶液。
[0013]所述的方法中，所述動物腦切片腹腔注射BrdU溶液是連續注射數天。
[0014]所述的方法中，所述統計分析數據的結果用平均值土標準誤差(Mean土SEM)表示，以p〈0.05作為在統計學差異的界限。
[0015]本發明的方法可以用于研究神經干細胞的遷移特點，分析6-0HDA損傷的紋狀體中的遷移來的細胞的分化能力，為進一步深入研究如何啟動腦內源性神經干細胞遷移、增殖、分化等影響奠定了重要的工作基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發明一個實施例的方法研究路線。
[0017]圖2是本發明一個實施例對C57BL/6J小鼠側腦室注射Endo-N去除PSA后，PSA-NCAM的免疫熒光染色結果；其中:圖a為對照組，圖b為實驗組，切片為矢狀位切片，圖中虛線表示的是RMS。LV,側腦室；0B，嗅球；RMS，嘴側遷移流。比例尺，250 μ Μ。
[0018]圖3是本發明一個實施例6-0HDA注射13天后BrdU+細胞的免疫熒光染色結果；其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實驗組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實驗組右腦紋狀體矢狀位切片。圖c是圖b的虛線框的放大的矢狀位切片共聚焦圖，圖f是圖e的虛線框的放大，圖g是單因素多組數據的方差分析結果圖，對照小鼠n=5，實驗組小鼠n=5，*p〈0.05有統計學意義。
[0019]圖4是本發明一個實施例的6-0HDA注射13天后BrdU/DCX+雙標細胞的免疫熒光染色結果；其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實驗組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實驗組右腦紋狀體矢狀位切片。小鼠腦矢狀位切片紋狀體共聚焦圖圖f為放大圖c的虛線框的激光共聚焦正交投影圖，顯示的雙標細胞為BrdU/DCX+細胞；圖c比例尺500 μ M，圖e比例尺25 μ Μ。
[0020]圖5是本發明的一個實施例的6-0HDA注射23天后BrdU+細胞的免疫熒光染色結果矢狀位切片共聚焦圖。其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實驗組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實驗組右腦紋狀體矢狀位切片。圖c是圖b的虛線框的放大，圖f是圖e的虛線框的放大。圖g是單因素多組數據的方差分析結果圖。(對照小鼠n=5，實驗組小鼠n=5，*p〈0.05#p<0.05有統計學意義)
[0021 ] 圖6是本發明的一個實施例的6-0HDA注射23天后BrdU/GFAP+雙標細胞的免疫熒光染色結果。其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實驗組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實驗組右腦紋狀體矢狀位切片。小鼠腦矢狀位切片紋狀體共聚焦圖圖f為放大圖c的虛線框的激光共聚焦正交投影圖，顯示的雙標細胞為BrdU/GFAP+細胞，圖c比例尺100 μ M，圖e比例尺25 μ M0
[0022]圖7是本發明的一個實施例的6-0HDA注射23天后BrdU/NeuN+雙標細胞的免疫熒光染色結果。其中:a為對照組左腦紋狀體矢狀位切片，b為對照組右腦紋狀體矢狀位切片、d為實驗組左腦紋狀體矢狀位切片、e為實驗組右腦紋狀體矢狀位切片。小鼠腦矢狀位切片紋狀體共聚焦圖圖f為放大圖c的虛線框的激光共聚焦正交投影圖，顯示的雙標細胞為BrdU/NeuN+細胞，圖c比例尺100 μ M，圖e比例尺25 μ M0
【具體實施方式】
[0023]在此對本發明說明書中涉及的若干英文縮略語作一說明，后文中提到的英文縮略語均按此說明理解:
[0024]PD (Parkinson，s disease)帕金森病；
[0025]AD (Alzheimer disease)阿爾茲海默病；
[0026]DA (dopamine)多巴胺；
[0027]L-DOPA (Ievodopa)左旋多巴；
[0028]PB (phosphate buffer)憐酸緩沖液；
[0029]PBS (phosphate buffered saline)憐酸緩沖鹽溶液；
[0030]SN (Substantia nigra)黑質；
[0031]TH (tyrosine hydroxylase)酪氨酸輕化酶；
[0032]6-OHDA (6_Hydroxydopamine) 6_ 輕多巴；
[0033]Endo-N (endoneuraminidase) PSA 特異性裂解酶；
[0034]EGF (epidermal growth factor)表皮生長因子；
[0035]BDNF (brain derived neurotrophin factor)腦源性神經營養因子；
[0036]GFAP (glial fibrillary acidic protein)膠質源纖維酸性蛋白；
[0037]SGZ (subgranular zone)顆粒下層；
[0038]SVZ (subventricular zone)室管膜下區；
[0039]RMS (rostral migratory stream)嘴側遷移流；
[0040]NSCs (neural stem cells)神經干細胞；
[0041]NPCs (neural precursor cells)神經前體細胞；
[0042]DW (distilled water)蒸懼水；
[0043]NeuN (neuron special protein)神經兀核心抗原；
[0044]DCX (doublecortin)雙腎上腺皮質激素；
[0045]BrdU (5-bromo_2，-deoxyuridine) 5 溴脫氧尿啼唳；
[0046]NGS (normal goat serum)正常山羊血清；
[0047]ANOVA (analysis of Variance)方差分析；
[0048]PFA (paraformaldehyde)多聚甲醒；
[0049]PSA-NCAM (Polysialic acid-neural cell adhesion molecular)唾液酸化神經細胞粘附因子；
[0050]GDNF (glial cell derived neurotrophic factor)膠質細胞源性神經營養因子。
[0051]本發明的一個實施例是通過紋狀體單側注射6-0HDA來制備慢性腦損傷模型。由于紋狀體是黑質多巴胺能神經元的主要靶區，注射于其中的6-0HDA可被前者的末梢吸收，通過逆軸突轉運至黑質內的神經元胞體，在經單胺氧化酶轉化成自由基，可選擇性地破壞這些神經元而出現類似H)的癥狀。由于6-0HDA必須通過逆軸突轉運才能到達中腦黑質，因此多巴胺能神經元的死亡是一種間接的、漸進的過程。跟黑質直接毀損法相比，這種損傷過程更接近于人類H)發病的臨床特點，在手術操作上紋狀體較黑質更易于解剖定位。本發明更感興趣的是在局部損傷的紋狀體靠近svz區，將Endo-N原液注射到側腦室去除PSA后，細胞間的同嗜性黏附作用增加，因此，本發明觀察了它對傳統遷移通路RMS的作用情況。DCX主要表達于遷移中的神經干細胞胞體和前導突起上，常用于標記遷移中神經干細胞。因此，同時觀察了 BrdU和DCX雙標細胞的情況，分析紋狀體中的BrdU陽性細胞數量。也觀察了遷移而來的神經干細胞的分化能力。這將為進一步深入研究如何啟動腦內源性神經干細胞遷移、增殖、分化等影響奠定部分重要的工作基礎。
[0052]本發明的目的:
[0053](I)用Endo-N去除PSA能否增加SVZ區神經干細胞異位遷移到6-0HDA損傷的紋狀體；
[0054](2)研究異位遷移的神經干細胞的分化能力，進而為研究帕金森病的病理提供部分基礎。
[0055]本發明采用的腦組織冰凍切片，可以使用以下方法制得:
[0056](I)選取C57BL/6J實驗用雄性小鼠分為四組，每組五只動物，全部在腦右側紋狀體內，立體定位注射2 μ 16-0HDA溶液。
[0057](2) 6-0HDA立體定位注射3天后，實驗組小鼠側腦室注射5 μ IEndo-N原液，對照組注射相同體積的PBS緩沖液。
[0058](3)在6-0HDA注射后,第8天開始,每天兩次，分別對4組共20只動物按50mg/kg腹腔注射BrdU溶液，連續注射3天。
[0059](4)分別在6-0HDA注射后第13天、第23天灌殺取材，固定脫水包埋。用冰凍切片機對實驗小鼠全腦進行矢狀切片，切片厚度為35 μ m。
[0060](5)對四組全部動物左右腦切片，進行fcdU和DCX、BrdU和NeuNJrdU和GFAP雙標免疫熒光染色，以及PSA-NCAM單標免疫熒光染色。
[0061](6)使用GraphPad Prism6.0軟件統計分析數據并繪圖，BrdU陽性細胞為單因素多組數據使用one-way ANOVA分析。
[0062]制得的腦組織冰凍切片中:
[0063]I)實驗組動物遷移流RMS中，有少量PSA-NCAM陽性細胞，對照組動物遷移流RMS中，有大量的PSA-NCAM陽性細胞。
[0064]2)實驗組動物紋狀體中有大量BrdU陽性細胞，存在BrdU和DCX、BrdU和NeuN、BrdU和GFAP雙標細胞。對照組動物紋狀體有少量BrdU陽性細胞，未發現BrdU和DCX、BrdU和NeuN、BrdU和GFAP雙標細胞。
[0065]由此可以得知:[0066]I)用Endo-N去除PSA后，有大量神經干細胞異位遷移到6-0HDA損傷的紋狀體，這些神經干細胞可能來自于SVZ區。
[0067]2)遷移來的神經干細胞具有分化能力，可以分化為神經元和膠質細胞。
[0068]以下舉一個具體實施例作詳細說明。
[0069]一、實驗材料
[0070]1、實驗動物
[0071 ] 本實施例所用的動物為C57BL/6J小鼠，雄性，8_10周，體重22_26g，由首都醫科大學動物部提供。每天十二小時光照與十二小時黑暗交替環境，攝食飲水自由，飼養條件為SPF 級。
[0072]二、實驗方法
[0073]1、小鼠腦立體定位注射與BrdU的腹腔注射標記
[0074]I) 6-0HDA的立體定位注射
[0075]將實驗小鼠分為四組(A、B、C、D)，每組五只動物(見圖1)，全部在大腦右側紋狀體內，立體定位注射 6-0HDA 溶液(5mg/ml6-0HDA, 0.2% 的維 C，0.9%NaCl)。
[0076]2)步驟如下:
[0077](I)小鼠稱重，用Equitisin按3ml/kg體重，腹腔注射麻醉，將麻醉好的小鼠腹面向下，在下方墊一塊泡沫，并固定于腦立體定位儀上。
[0078](2)頭部備皮，常規碘酒酒精消毒后，取正中矢狀切口，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離，直至暴露顱骨，根據小鼠腦立體定位圖譜確定紋狀體注射位點坐標。選用的注射位點坐標為，前鹵前(AP) +0.5mm，正中線右旁開(ML) +1.9mm，硬腦膜下(DV) -2.65mm,門齒棒低于耳間線(TB) -1mm。
[0079](3)在手術顯微鏡下，立體定位上述注射位點，用牙科鉆余在相應的顱骨處，小心鉆開一小孔，不要用力過大，避免損傷大腦實質，用小鑷子輕輕挑開硬腦膜。
[0080](4)用Hamilton微量注射器，緩緩注入2μ 16-0HDA(5yg/y I)溶液(圖1)，每注射I μ I留針lmin，注射完畢后留針十分鐘，防止液體溢出，最后慢慢退出Hamilton微量注射器。
[0081](5)用碘酒和酒精擦拭傷口消毒抗菌后，縫合皮膚，將動物放置于溫暖環境中，蘇醒后給予食物和水。
[0082]2、Endo-N原液的立體定位注射
[0083]6-0HDA立體定位注射3天后，實驗組(B、D)小鼠側腦室注射5 μ I Endo-N原液(lU/μ 1)，對照組(A、C)注射相同體積的0.0lMPBS緩沖液(見圖1)。步驟如下:
[0084](I)小鼠稱重，用Equitisin按3ml/kg體重，腹腔注射麻醉，將麻醉好的小鼠腹面向下，在下方墊一塊泡沫，并固定于腦立體定位儀上。
[0085](2)小鼠頭部酒精消毒后，取正中矢狀切口，切開皮膚及皮下組織，鈍性分離，直至暴露顱骨，根據小鼠腦立體定位圖譜確定側腦室注射位點坐標。選用的注射位點坐標為，前齒(AP) +Omm,正中線右旁開(ML) +0.9mm,硬腦膜下(DV) -2.3mm,門齒棒低于耳間線
(TB) -1mnin
[0086](3)在手術顯微鏡下，立體定位上述注射位點，用牙科鉆余在相應的顱骨處，小心鉆開一小孔，不要用力過大，避免損傷大腦實質，用小鑷子輕輕挑開硬腦膜。[0087](4)用Hamilton微量注射器，緩緩注入5μ I Endo-N原液(IU/μ I)或0.0lM的PBS (見圖1)，每注射Iy I留針3min，注射完畢后留針十分鐘，防止溢出，最后慢慢退出微
量注射器。
[0088](5)用碘酒和酒精擦拭傷口消毒抗菌后，縫合皮膚，將動物放置于溫暖環境中，蘇醒后給予食物和水。
[0089]3、BrdU的腹腔注射標記
[0090]在6-0HDA注射后，第8天開始，每天兩次，間隔4小時，分別對4組共20只動物按50mg/kg腹腔注射BrdU溶液，連續注射3天(見圖1)。具體步驟:
[0091](I)用Iml的注射器，配合4號針頭進行小鼠腹腔注射
[0092](2)注射時右手持注射器，左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下。這樣腹腔中的器官就會自然倒向胸部，防止注射器刺入時損傷大腸、小腸等器官。進針的動作要輕柔，防止刺傷腹部器官。尤其是對于體重較小的小鼠，腹腔注射時針頭可以在腹部皮下穿行一小段距離，最好是從腹部一側進針，穿過腹中線后在腹部的另一側進入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉針頭，防止漏液。
[0093]4、取材與固定
[0094]A、B組在6-0HDA注射后第13天灌殺取材，C、D組在6-0HDA注射后第23天灌殺取材(圖1)。
[0095](I)調試清洗灌注泵:用0.0lM PBS沖洗管道，排凈管道中的氣泡，待管道中充滿PBS時，關機備用。
[0096](2)小鼠稱重，用Equitisin按3ml/kg體重，腹腔注射麻醉。
[0097](3)將小鼠腹面向上妥善固定于蠟盤上，用止血鉗提起劍突處皮膚，剪開皮膚及皮下組織，繼而向兩側剪開，直至腋中線，充分暴露胸腹腔交界處及膈肌。再從劍突處剪開膈肌，向兩側分離，充分暴露胸腔和心臟。注意向上輕輕挑著剪，防止損傷內臟引起大量出血；
[0098](4)游離心臟，分離心包膜，將灌注針插入左心室，用止血鉗固定。剪開右心耳，打開灌注泵。灌注0.0lM PBS0盡快暴露腹腔，輕輕按摩腹腔內肝臟，以幫助血液的快速排空，待動物肝臟明顯發白時，關閉灌注泵，將灌注管移至4%的多聚甲醛溶液中，盛多聚甲醛溶液的燒杯事先放入冰塊中。打開灌注泵，灌注多聚甲醛，前1/3量快速灌注，后2/3量緩慢灌注，動物四肢抽動僵直后，繼續灌注多聚甲醛IOOml左右。
[0099](5)灌注完畢后，用咬骨鉗剝離顱骨及硬腦膜，去除小腦簾、大腦幕。放入4%的多聚甲醛溶液中繼續固定，4°C保存24小時后取出腦組織，放入30%的蔗糖溶液中4°C保存至標本沉底。
[0100]5、小鼠腦組織冰凍切片
[0101](I)將脫水完成后的腦組織從30%的蔗糖溶液中取出，用少量的0.0lM的PBS沖洗，用OCT包埋做好標記，放入-40°C低溫冰箱過夜。
[0102](2)冰凍切片機預冷，安裝固定刀片，待溫度穩定在_20°C時，凍出冰臺，準備小毛
筆一只，備用。
[0103](3)取出包埋塊，置于冰凍切片機，參考小鼠腦立體定位圖譜，按標記從左腦開始至右腦對全腦進行矢狀切片，切片厚度為35 μ m。[0104](4)全腦連續切片，左右腦分別分成5個孔放置，這樣每孔均為一套連續切片。在小鼠左腦切到皮質下Iml時留片，按順序放到放置左腦切片的孔中。在小鼠左腦嗅球和第三腦室不見時，開始留右腦切片。并按順序放到放置右腦切片的孔中。所有切片放入盛有防凍液的24孔板中，4°C保存。
[0105]6、小鼠腦矢狀切片免疫熒光化學染色，
[0106]四組全部動物左右腦連續矢狀位腦切片，進行了 BrdU的免疫熒光染色。A組和B組(6-0HDA注射后第13天灌殺)，同時還進行了 PSA-NCAM免疫熒光染色、BrdU和DCX雙標免疫熒光染色。C組和D組出-OHDA注射后第23天灌殺)動物，右腦部分切片同時還進行了 BrdU和NeuN雙標免疫熒光染色，BrdU和GFAP雙標免疫熒光染色。
[0107]I) BrdU的免疫熒光染色
[0108](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0109](2)切片放入 2N-HCL 中，37°C下，孵育 40min
[0110](3)用 0.1M Borate buffer 漂洗 3 次，5min/次；
[0111](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/次；
[0112](5) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0113](6) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為大鼠抗BrdU單克隆抗體1:300 ；
[0114](7)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次
[0115](8) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為CyTM3-conjugated-山羊抗大鼠 1:200 ；
[0116](9)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次
[0117](10)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡.[0118](11)顯微鏡下觀察，共聚焦拍照，應注意熒光物質均易發生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0119]2) BrdU和DCX雙標免疫熒光染色
[0120](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0121](2)切片放入 2N-HCL 中，37°C下，孵育 40min ；
[0122](3)用 0.1M Borate buffer 漂洗 3 次，5min/次；
[0123](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0124](5) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0125](6) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為大鼠抗BrdU單克隆抗體1:300 ;兔抗Doublecortin (DCX) 1:500 ；
[0126](7)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0127](8) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為Alexa FluorR488_ 山羊抗兔 1:200 ；Cy?3-conjugated-山羊抗大鼠 1:200 ；
[0128](9)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0129](10)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡；[0130](11)顯微鏡下觀察，共聚焦拍照；應注意熒光物質均易發生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0131]3) PSA-NCAM免疫熒光染色。
[0132](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0133](2) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0134](3) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為小鼠抗PSA-NCAM單克隆抗體1:350 ;
[0135](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0136](5) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為DyLightTM488-山羊抗小鼠 1:200 ；
[0137](6)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0138](7)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡；
[0139](8)顯微鏡下觀察激光，共聚焦拍照，應注意:熒光物質均易發生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0140]4 ) BrdU和NeuN雙標免疫熒光染色
[0141](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0142](2)切片放入 2N-HCL 中，37°C下，孵育 40min ；
[0143](3)用 0.1M Borate buffer 漂洗 3 次，5min/次；
[0144](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0145](5) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0146](6) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為小鼠抗NeuN單克隆抗體1:300 ;大鼠抗BrdU單克隆抗體1:300 ；
[0147](7)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0148](8) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為DyLightTM488-山羊抗小鼠 1:200 ；CyTM3-conjugated-山羊抗大鼠 1:200;
[0149](9)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次;
[0150](10)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡.[0151](11)顯微鏡下觀察，激光共聚焦拍照，應注意:熒光物質均易發生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0152]5 ) BrdU和GFAP雙標免疫熒光染色
[0153](I)切片在0.0lM的PBS中漂洗3次，5min/次；
[0154](2)切片放入 2N-HCL 中，37°C下，孵育 40min ；
[0155](3)用 0.1M Borate buffer 漂洗 3 次，5min/次；
[0156](4)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次
[0157](5) 10% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX-100)封閉。孵育 lh, RT ；
[0158](6) 5%的NGS溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋抗體，孵育室溫過夜。比例為兔抗GFAP多克隆抗體1:1000 ;大鼠抗BrdU單克隆抗體1:300 ；[0159](7)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0160](8) 二抗 5% 的 NGS 溶液(l%BSA+0.25%TritionX_100)稀釋，孵育室溫 lh。比例為 DyLightTM549-山羊抗兔 1:200 ；CyTM3-conjugated-山羊抗大鼠 1:200 ;
[0161](9)在 0.0lM 的 PBS 中漂洗 3 次，IOmin/ 次；
[0162](10)將切片裱到載玻片上晾干，滴一滴突光封片劑(Fluorescent MountingMedium)于組織切片上，蓋上蓋玻片，讓切片接觸封片液，盡量避免氣泡。
[0163](11)顯微鏡下觀察激光，共聚焦拍照，應注意:熒光物質均易發生淬滅，染色后的樣品宜避光保存。
[0164]7、統計學處理
[0165]數據使用GraphPad Prism6.0軟件統計分析并繪圖，單因素多組數據使用one-wayANOVA分析，其結果用平均值土標準誤(Mean土SEM)表示。以p〈0.05作為在統計學差異的界限。
[0166]本實施例選取了 A組和B組的小鼠右腦含RMS的腦矢狀位切片進行了成神經細胞(Neuroblasts)的特有的蛋白PSA-NCAM的染色，結果用Endo-N原液(IU/μ I)處理，在6-0HDA注射13天后灌殺的實驗組小鼠(B組)的RMS中基本不表達PSA-NCAM。而用等量的PBS處理的對照組小鼠(Α組)的RMS中高表達PSA-NCAM (見圖2)。
[0167]在Endo-N原液(IU/μ I)處理的實驗組B組小鼠(在6-0HDA注射13天后灌殺)的紋狀體中，含中有大量的BrdU陽性細胞(見圖3)
[0168]本實施例選取了 A組和B組的小鼠左右腦一整套連續矢狀位切片進行了 BrdU的免疫熒光染色，用倒置熒光顯微鏡觀察全部腦切片，選取含有紋狀體紋理和視神經束同時純在的矢狀切片，進行BrdU陽性細胞的統計并進行統計學比較。分為以下各組:Control-left 組和 Contorl-right 組的(原始數據見表 I )Endo-N_left 組和 Endo-N-right組(原始數據見表2)。使用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，可觀察到Control-left組(圖3a) BrdU 陽性細胞很少，Contorl-right 組(圖 3b)和 Endo-N-1eft 組(圖 3d) BrdU 陽性細胞不多，Endo-N-right組(圖3e)有大量BrdU陽性細胞。四組數據使用one-way ANOVA分析，其結果用平均值土標準誤(Mean土SEM)表示。以p〈0.05作為在統計學差異的界限(圖3g)。結果Endo-N-right組與其他三組均有統計學差異。
[0169]在Endo-N原液(IU/μ I)處理的實驗組B組小鼠(在6-0HDA注射13天后灌殺)的紋狀體中，含有少量BrdU/DCX+雙標細胞(見圖4)。本實施例選取了 A組和B組的小鼠右腦一套連續矢狀位切片進行了 BrdU/DCX+雙標免疫熒光染色，用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，在B組的Endo-N-right (試驗組右腦紋狀體矢狀切片)組，發現少量BrdU/DCX+雙標細胞(圖4c)，在A組的Contorl-right (對照組右腦紋狀體矢狀切片)組沒有發現明顯標記物。本實施命例選取了一個BrdU/DCX+雙標細胞進行了共聚焦正交投影(圖4f)。
[0170]在Endo-N原液(IU/μ I)處理的實驗組D組小鼠(在6-0HDA注射23天后灌殺)的紋狀體中，含有大量的BrdU陽性細胞(見圖5)。本實施例選取了 C組和D組的小鼠左右腦一整套連續矢狀位切片進行了 BrdU的免疫熒光染色，用倒置熒光顯微鏡觀察全部腦切片，選取含有紋狀體紋理和視神經束同時純在的矢狀切片，進行BrdU陽性細胞的統計并進行統計學比較。分為以下各組:Control-left組和Contorl-right組的(原始數據見表
3)Endo-N-1eft組和Endo-N-right組(原始數據見表4)。使用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，可觀察到Control-left組(圖5a) BrdU陽性細胞很少，Contorl-right組(圖5b)和Endo-N-1eft組(圖5d) BrdU陽性細胞不多，Endo-N-right組(圖5e)有大量fcdU陽性細胞。四組數據使用one-wayANOVA分析，其結果用平均值土標準誤(Mean土SEM)表示。以p〈0.05作為在統計學差異的界限(圖5g)。結果Endo-N-right組與其他三組均有統計學差異。Endo-N-1eft組與Control-left組也有統計學差異。
[0171 ] 在Endo-N原液(IU/ μ I)處理的實驗組D組小鼠(在6-0HDA注射23天后灌殺)的紋狀體中，含有少量BrdU/GFAP+雙標細胞(見圖6)。本實施例選取了 C組和D組的小鼠右腦一套連續矢狀位切片進行了 BrdU/GFAP+雙標免疫熒光染色，用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，在D組的Endo-N-right (試驗組右腦紋狀體矢狀切片)組，發現少量BrdU/GFAP+雙標細胞(圖6c)，在C組的Contorl-right (對照組右腦紋狀體矢狀切片)組沒有發現明顯標記物。本實施例選取了一個BrdU/GFAP+雙標細胞進行了共聚焦正交投影(圖6f)。
[0172]在Endo-N原液(IU/ μ I)處理的實驗組D組小鼠(在6-0HDA注射23天后灌殺)的紋狀體中，含有少量BrdU/NeuN+雙標細胞(見圖7)。本實施例選取了 C組和D組的小鼠右腦一套連續矢狀位切片進行了 BrdU/NeuN+雙標免疫熒光染色，用雙光子激光共聚焦顯微鏡拍照，在D組的Endo-N-right (試驗組右腦紋狀體矢狀切片)組，發現少量BrdU/NeuN+雙標細胞(圖7c)，在C組的Contorl-right (對照組右腦紋狀體矢狀切片)組沒有發現明顯標記物。本實施例選取了一個BrdU/NeuN+雙標細胞進行了共聚焦正交投影(圖7f)。
[0173]本發明的方法中，6-0HDA是一種神經毒素可以選擇性損傷多巴胺能神經元。當把6-0HDA直接注射黑質后，小鼠中腦黑質中的富含單胺氧化酶的DA能神經元會吸收它，并在單胺氧化酶作用下轉化成神經毒素，如自由基和醌類對神經元造成損害。對于神經解剖學而言，黑質傳出的纖維主要形成了黑質紋狀體投射，也就是投射纖維自黑質發出后，沿黑質背內側上行經下丘腦外側、內囊內側到達紋狀體的尾狀核頭部和殼核頭部。當6-0HDA注射至小鼠紋狀體后，被多巴胺能神經元末梢通過軸突逆轉運輸至黑質部細胞體內，通過破壞多巴胺能神經元的抗氧化系統，使線粒體功能、膜的穩定性和DNA完整性受到了破壞，最終導致黑質紋狀體多巴胺系統的功能減退而產生慢性腦損傷癥狀。因此，使用6-0HDA制備H)動物模型的靶點主要有黑質致密部、紋狀體及內側前腦束，最常用的方法為單側注射6-0HDA至黑質或內側前腦束，促使多巴胺能神經元在較短時間內快速死亡，這樣制備了 H)急性損傷模型，不易模擬早期H)病理表現。而慢性損傷模型大可以直接注射6-0HDA至紋狀體內而導致黑質多巴胺能神經元的退行性病變，這種方法可以在一周到幾周的時間內緩慢產生神經元變性，符合ro進行性退變的病程。本發明中就是采用腦立體定位小鼠單側紋狀體內注射6-0HDA制造慢性腦損傷。
[0174]2010 年 Daniela Battista 和 Urs Rutishauser 使用 Endo-N (PSA 的特異性裂解酶)去除PAS后，他們發現傳統遷移通路RMS遭到破壞，SVZ所產生的未成熟神經細胞則向其他腦組織包括紋狀體異位遷移明顯增多。本發明在實驗動物的紋狀體中也觀察到了相同的結果，同時還發現小鼠右側6-0HDA損傷的紋狀體中有大量的BrdU陽性細胞，與紋狀體未損傷的同只實驗小鼠的左側比較，這一現象尤為明顯。因此通過本發明的方法可以考慮到，6-0HDA損傷造成的局部炎性對神經干細胞的吸引性遷移作用是明顯的。使用Endo-N有效的去除PAS后，失去了粘附力的神經干細胞在svz區和RMS啟始區的大量聚集為向紋狀體遷移提供了前提。這一結果提示人們使用Endo-N去除PSA將成為一個有效的啟動內源性神經干細胞治療慢性腦損傷的途徑。
[0175]大量研究發現腦室管膜下區的神經干細胞在遷移過程中表面均表達很高水平的PSA-NCAM。當這些細胞到達目的地、分化成成熟中間神經元后，細胞表面的PSA表達就會消失，提示PSA-NCAM在未成熟神經細胞定向遷移中起重要的作用，同時也有人證明PSA-NCAM有抑制神經干細胞分化的作用。因此，本發明可以對遷移到紋狀體的神經干細胞的分化能力進行研究。并在做了染色后得到了喜人的結果，這類遷移而來的神經干細胞已分化成為成熟的神經元和星形膠質細胞。神經膠質細胞是人類中樞神經系統中的一類神經細胞，它們并不像神經元那樣傳導電沖動，長期以來被認為只起支持作用。直到近些年來，人們才開始認識到神經膠質細胞(尤其是星形膠質細胞)在大腦中的調節作用并和大腦認知能力有關。本發明的研究結果進一步提示遷移的神經干細胞的分化能力，為進一步實驗提供了細胞基礎。
[0176]表1:對照組(A組)的小鼠腦紋狀體BrdU+數量
[0177]
【權利要求】
1.一種研究腦內源性神經干細胞遷移、增殖、分化的方法: 1)對動物腦切片進行5溴脫氧尿嘧啶和雙腎上腺皮質激素、5溴脫氧尿嘧啶和神經元核心抗原、5溴脫氧尿嘧啶和膠質細胞源性神經營養因子雙標免疫熒光染色，以及唾液酸化神經細胞粘附因子單標免疫熒光染色； 2)使用GraphPadPrism6.0軟件統計分析數據并繪圖，5溴脫氧尿喃唳陽性細胞為單因素多組數據使用one-way方差分析。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述動物腦切片經過以下處理: 在腦右側紋狀體內立體定位注射6-羥多巴胺溶液后，在側腦室注射PSA特異性裂解酶原液，再腹腔注射5溴脫氧尿嘧啶溶液。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述動物腦切片是動物左右腦切片。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述動物腦切片中包括有對照組腦切片。
5.根據權利要求1或4所述的方法，其中，所述對照組腦切片是立體定位注射6-羥多巴胺溶液后，在側腦室注射磷酸緩沖鹽溶液緩沖液，再腹腔注射5溴脫氧尿嘧啶溶液。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，所述動物腦切片腹腔注射5溴脫氧尿嘧啶溶液是連續注射數天。
7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述統計分析數據的結果用平均值土標準誤差表示，以p〈0.05作為在統計學差異的界限。
【文檔編號】G01N33/533GK103940985SQ201410140961
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月10日 優先權日:2014年4月10日
【發明者】段維明, 張永鑫, 楊春 申請人:首都醫科大學