專利名稱：馬立克氏病病毒和禽網狀內皮組織增生病病毒快速聯檢試紙條的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測馬立克氏病和禽網狀內皮組織增生病的器具，特別是涉及一種一步法快速檢測馬立克氏病病毒和禽網狀內皮組織增生病病毒的聯檢膠體金試紙條。
背景技術：
馬立克氏病(Marek，s disease, MD)是由馬立克氏病病毒(Marek，s diseasevirus, MDV)引起的一種禽類高度接觸性、傳染性、淋巴組織增生性腫瘤病，主要危害雞，鵪鶉、山雞也有發病。該病可引起內臟器官、肌肉和外周神經的淋巴細胞瘤的神經腫大。臨床上MD發病雞群表現為生長不均勻、極度消瘦、死亡等癥狀，最常見的病變是神經損害和多種實質臟器的淋巴腫瘤，以肝臟、脾臟腫瘤最為多見，因神經損害導致的不對稱性進行性麻痹，最終可引起單個或多個肢體的完全性麻痹。MDV屬于皰疹病毒科，有三種不同血清型，不同血清型毒株既含有共同抗原，也含有特異性抗原。I型MDV感染能引起腫瘤，II型和III型MDV毒株無致病性，可用于疫苗株。禽網狀內皮組織增生病(Reticuloendotheliosis，RE)是由禽網狀內皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus, REV)引起雞、鴨、鵝、火雞及其他禽類以網狀細胞增生為主要特征的一組綜合征，包括急性網狀細胞增生病、矮小綜合征和淋巴組織及其它組織的慢性腫瘤增生性疾病。REV屬于反轉錄病毒科，是另外一種可引起禽類腫瘤的病毒，雖然不同毒株的致病力不太相同，但都具有相似的抗原性，即屬于同一血清型。RE是禽類最重要的免疫抑制性和腫瘤性疾病之一。作為能誘發禽類腫瘤及免疫抑制疾病最重要的兩種病毒，MDV和REV已在世界范圍內對養禽業造成了巨大損失。近年來，免疫抑制性病毒共感染的報道越來越多，不同臨床癥狀的雞群中MDV和REV共感染的現象已經相當普遍，在疑似MD腫瘤的病例中，至少有三分之一的病例可以同時分離到MDV和REV。MDV和REV單獨感染雞均可導致腫瘤病變，二者協同作用會導致更加明顯的腫瘤病變。盡管MDV和REV誘導產生淋巴瘤的機制不同，但腫瘤在組織臟器的分布卻非常相似。此外，國外已有多項研究證實，MDV和REV在CEF細胞共培養數代后會發生體外重組。更加令人擔憂的是，我國學者已從發病雞群中分離到含有REV病毒基因組片段的MDV自然重組毒株，這種重組增加了 MDV在感染雞群中的水平傳播能力。由于臨床癥狀和剖檢病變非常相似，再加上MDV和REV的共感染普遍存在，增加了這兩種家禽病毒性腫瘤病的臨床診斷尤其是鑒別診斷的難度，一些傳統的診斷方法很難將其準確、快速地區分開來，給臨床診斷及防制工作帶來了困難。目前，臨床上最常用鑒別診斷方法是病毒分離培養、血清學檢測、分子生物學方法等。病毒分離鑒定不但對臨床診斷很有價值，對流行病學及病原學研究亦至關重要，但該方法檢測周期長，約需I 2個月，同時細胞培養的操作要求高，局限性較大。血清學方法如ELISA等主要用于檢測羽毛囊上皮、溶細胞感染的淋巴細胞組織及細胞培養物等樣品。此類方法檢測成本相對較高，并且由于部分病例中的REV感染呈“一過性”特征、病毒血癥時間較短，病毒含量低，導致檢出率較低。分子生物學方法如PCR、熒光定量PCR和LAMP等技術主要是用于病毒核酸的檢測，這些技術雖然能比較準確的鑒別診斷MDV和REV，但操作復雜，需要特定的試劑及昂貴的儀器設備，操作要求高，難以適合生產一線或疫病現場快速鑒別診斷的需要。因此，急需研究一種快速鑒別檢測MDV和REV的新技術，這對于MD和RE的有效防控具有重要的現實意義。
發明內容
本發明要解決的技術問題是:提供一種簡便、準確、結果直觀、肉眼可判的一步法快速檢測馬立克氏病病毒和禽網狀內皮組織增生病病毒的試紙條，該試紙條特異性強、靈敏度高、操作簡便、檢測快速、成本低廉，并且可以同時檢測兩種病毒。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:
一種一步法快速檢測馬立克氏病病毒MDV和禽網狀內皮組織增生病病毒REV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層由樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，所述纖維素膜層上標記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對照印跡，以及分別含有MDV抗體和REV抗體的檢測印跡，所述MDV抗體和REV抗體分別為抗MDV和抗REV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標抗體纖維層上附著有與檢測印跡對應的以膠體金標記的抗MDV和抗REV的多克隆抗體或單克隆抗體。所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成；所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。所述支撐層由不吸水的硬質塑膠片或硬紙條制成；所述吸水層用吸水紙制成；所述金標抗體纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。在所述樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水層上敷設有保護膜，且在樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上偏向樣品吸附纖維層一側0.3 0.7cm處印制有樣品標記線，檢測印跡與對照印跡的排列組合為“ I I I ”、“/ / /”、“ + + + ”、 “丁丁丁”、“ |_ p’中的一種。所述膠體金標記的抗MDV和抗REV的單克隆抗體是通過以下方法制備的:
將篩選獲得的抗MDV和抗REV的單克隆細胞株分別進行擴大培養，用PBS洗滌2遍后1000 r/min離心10 min，收集細胞，以每只I X IO6 2X IO6個細胞的量分別對經產母鼠進行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清，分別獲得抗MDV和抗REV的單克隆抗體腹水；
用檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5 2 % (wt)檸檬酸三鈉溶液，反應后獲得直徑為15 20 nm的膠體金溶膠；以0.lmol/L的K2CO3溶液調節膠體金溶膠的pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將所述抗MDV的單克隆抗體腹水或抗REV的單克隆抗體腹水分別加入膠體金溶膠中，印跡10 min后，加20 % (wt)的PEG-10000至PEG-10000的終濃度為0.05 %(wt), 4°C下、1500 3000 r/min離心20 min,除去未結合的膠體金顆粒,在4°C、15000 r/min條件下離心I h，棄上清液，獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分別分離純化金標蛋白，得到膠體金印跡的抗MDV單抗和抗REV單抗。所述抗MDV和抗REV的單克隆抗體細胞株是由以下方法分別制備的:
分別用原核表達MDV囊膜糖蛋白gB的重組質粒PET-28a-gB和REV囊膜糖蛋白gp90的重組質粒PET-28a-gp90，轉化大腸桿菌BL-21并挑選陽性克隆菌株；搖菌培養后用IPTG誘導蛋白表達，菌液上清經超聲波裂解后過鎳柱純化，分別得到純化的MDV gB表達蛋白和REV gp90表達蛋白；
將純化的gB表達蛋白和gp90表達蛋白分別以20 30 u g/只的劑量用福氏佐劑乳化，制備免疫原免疫6周齡Balb/c系小鼠兩組,每組免疫三次,每次間隔15 30 d ;最后一次加強免疫后3 4 d，分別將兩組免疫鼠眼球放血，拉頸處死后置于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，無菌摘取免疫鼠的脾臟，剪碎并經100目尼龍網過濾，用GNK洗液混懸脾細胞，1000 r/min離心10 min,收集脾細胞；將每組收集的免疫鼠的I X IO8個脾細胞分別與2 X IO7 5 X IO7個NSO骨髓瘤細胞混合，再用GNK洗液混懸稀釋至總體積為40 ml，1000 r/min離心10 min，棄上清，分別將兩種混合細胞沉淀置于37°C水浴中，在I min內分別緩緩加入0.7 1.0 mL pH值為8.5 9.0的PEG-1500，邊加邊輕輕搖晃，然后再分別緩慢加入GNK洗液15 ml，37°C水浴5 min，最后補足GNK洗液至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min，棄上清；將兩種細胞沉淀分別重懸于1640/HAT選擇培養基中，最后以200 ML/孔分別鋪板至96孔培養板，置于37°C、5%的CO2培養箱中培養7 10 d，雜交瘤的培養上清分別用間接免疫熒光試驗檢測，挑選熒光較強的細胞克隆，分別用有限稀釋法連續進行三次細胞亞克隆，最后分別篩選獲得特異性抗MDV和抗REV的單抗雜交瘤細胞株。所述GNK洗液是由以下方法制備的:稱取NaCl 24 g、KCl 1.2 g、Na2HPO4 12H20
10.68 g、NaH2PO4 2H20 2.34 g、葡萄糖6 g、苯酹紅0.03 g,混合后加雙蒸水至3000 ml,115。。滅菌 15 min。
本發明的有益效果:
(I)本發明根據ELISA的基本原理，用免疫層析試紙檢測病毒，利用微孔濾膜的滲濾濃縮和毛細管作用，將抗原-抗體反應由ELISA的傳統液相環境轉到固相濾膜上快速進行，并采用膠體金印跡代替酶印跡，憑肉眼直接觀察膠體金的顯色狀況，即時獲得檢測結果，因此該方法比ELISA等血清學方法更為簡便、快速。(2)檢測特異性強，敏感性高。該檢測試紙條以膠體金印跡高親和力的特異性單抗或多抗為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金標對單抗或多抗特異性和親和力(結合力)影響很小，且具有較高的印跡率。(3)操作簡便，快速。使用本發明的試紙條時，可以一次同時進行MDV和REV病毒的快速檢測，大大節省檢測時間和檢測費用，提高了工作效率。使用時只需將測試端插入待檢樣品液中30 s左右,在I 5 min內即可判定檢測結果。(4)結果顯示直觀、準確。試紙條以顯示兩條棕紅色的檢測印跡Tl和T2以及一條對照印跡C作為檢測的陽性和質控印跡，即在纖維素膜上顯示三條棕紅色印跡T1、T2和C，表示MDV和REV均在被檢測樣品液中被檢出，結果為雙陽性；在纖維素膜上顯示一條棕紅色的檢測印跡Tl或T2以及一條對照印跡C，表示只有相對應的MDV或REV的一種病毒在被檢測樣品液中被檢出，結果為單陽性；在纖維素膜上只顯示一條棕紅色對照印跡C，表示兩種病毒均在被檢測樣品液中未檢出，結果為陰性。結果判定直觀、準確，簡單明了，不易出現假陰性和假陽性的誤判。(5)減少投資和檢測成本。使用該試紙條，不需另配其它儀器、設備和試劑，節省大量儀器、設備和附加試劑費用，專業和非專業人士均可隨時隨地進行現場檢測，無需支付專家診斷檢查費或送樣品去診斷室的路費，節省檢測成本。使用該試紙條檢測每份樣品僅需人民幣3 5元，比用通常的儀器分析(每份樣品300元左右)和進口 ELISA試劑盒(每份樣品30元左右)的檢測費大幅下降。(6)應用范圍廣，便于普遍推廣應用。本發明操作簡單，成“一步式”或“傻瓜式”操作，而且方便攜帶和保存，能滿足不同層次人員的需要，包括專業化驗、海關檢疫、衛生防疫、質量監測、畜產品加工、集約化養殖和個體養殖等，具有廣闊的市場前景和較好的經濟、社會效益。
圖1為本發明試紙條的俯視結構示意圖。圖2為圖1試紙條的側面結構示意圖。圖中，I為支撐層，2為樣品吸附纖維層，3為金標抗體纖維層，4為纖維素膜層，5為吸水層，6-1為MDV檢測印跡，6-2為REV檢測印跡，7為對照印跡，8-1為測試端保護膜，8-2為手柄端保護膜，9為印跡線。
具體實施例方式實施例1:一種一步法快速檢測馬立克氏病病毒MDV和禽網狀內皮組織增生病病毒REV的試紙條，參見圖1、圖2。支撐層I以塑膠薄片條制成，樣品吸附纖維層2以玻璃棉制成，金標抗體纖維 層3為附著有膠體金標記的抗MDV、抗REV的兩種單克隆抗體的玻璃棉制成的混合金標抗體，纖維素膜層4為硝酸纖維素制成，吸水層5由吸水濾紙制成，將編號
2、3、4、5各層依次粘貼在支撐層I上，彼此拼接的交界處纖維互相交叉滲透。在纖維素膜層
4上設有抗MDV和抗REV的兩種多克隆抗體IgG溶液分別標記的MDV檢測印跡6_1和REV檢測印跡6-2 (代號分別為Tl和T2)，以及以羊(或兔)抗小鼠IgG溶液標記的對照印跡7(代號C);兩檢測印跡與對照印跡的排列形式為“ |||”。測試端保護膜8-1覆蓋在樣品吸附纖維層2和金標抗體纖維層3上面，為白色；測試端保護膜8-1上偏向于樣品吸附纖維層2的一側0.5 cm處印有印跡線9，印跡線9的右端印有箭頭及MAX字樣，吸水層5上覆蓋有其它顏色(如黃色或藍色)的手柄端保護膜8-2。用于對照印跡的羊(或兔)抗小鼠IgG抗體，及用于檢測印跡和金標抗體纖維層的抗MDV和抗REV的多克隆抗體和單克隆抗體的制備方法如下:
(I)羊(或兔)抗小鼠IgG的制備
以飽和硫酸銨法提取小鼠血清中的IgG:取I份血清加2份PBS液(pH 7.2)混勻，再加等體積的飽和硫酸銨液混勻，置4°C冰箱內2 h，在4°C、10000 r/min離心15 min，棄上清液；以適量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，加飽和硫酸銨液至其最終濃度為33%，置4°C冰箱內
2h，在4。。、10000 r/min條件下離心15 min，棄上清液，以少量PBS液(pH7.2)溶解沉淀，置4°C冰箱內用PBS液(pH7.2)過夜透析，換液2 3次，在4°C、10000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，以紫外分光光度計測定其蛋白濃度。按50 y g/kg 100 U g/kg體重的劑量經皮下或肌肉注射純化的IgG抗體至陰性健康羊或家兔3 4次，末次免疫20 d后靜脈采血，以ELISA測定其血清抗體效價在1:2000以上，心臟采血或頸動脈放血，分離制備高免血清。以飽和硫酸銨法提取羊(或兔)抗小鼠的IgG (其提取方法與上述提取小鼠血清IgG相同，不再重述)，用于標記本發明試紙條的對照印跡。(2)抗MDV和抗REV單克隆抗體細胞株的制備
分別用原核表達MDV囊膜糖蛋白gB的PET-28a-gB重組質粒和REV囊膜糖蛋白gp90的PET-28a-gp90重組質粒，轉化大腸桿菌BL-21，挑取兩種陽性克隆菌株，分別接種于5 mLLB液體培養基中，37°C振蕩培養過夜。取5 mL培養物轉接于100 mL LB液體培養基中，37°C培養約3 h，達到對數生長期，即OD6tltl約0.8 1.2，按照每毫升培養基加入10 u L、100 mmol/L的IPTG至終濃度為1.0 mmol/L分別進行誘導表達，28°C條件下緩慢振蕩培養4 5 h。在4°C、5000 r/min條件下分別離心15 20 min,棄上清,按I g濕重菌體/2 5 ml平衡緩沖液的比例充分懸浮菌體沉淀。用超聲波裂解儀分別裂解兩種菌體，直至云霧狀的菌液變得比較清亮，4°C、15000 rpm離心15 min，分別收集上清液備用。將兩種上清液分別上樣至用平衡緩沖液(NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L、咪唑
5mmol/L, pH 8.0)平衡的鎳離子親和層析柱,再依次分別用含30 mmol/L、50 mmol/L、75mmol/L咪唑的洗脫緩 沖液(NaCl 500 mmol/L、PB 20 mmol/L，pH7.4)進行分階段洗脫，分別收集兩種蛋白的各階段洗脫液。將兩種各階段洗脫峰分別進行SDS-PAGE分析，電泳完畢后用考馬斯亮藍G2250 (甲醇:水:冰乙酸=4.5:4.5: I)室溫染色2 h，用脫色液(40%甲醇、10%冰乙酸)脫色至背景清晰，觀察結果表明:兩種重組菌經IPTG誘導后均有明顯的與各自預期大小相符的目的蛋白條帶，說明MDV的gB蛋白和REV的gp90蛋白在疋coli中均獲得了大量表達，經親和層析的重復洗脫液中，兩種蛋白均在前兩次的洗脫液中含量較大，此后洗脫液中含量迅速減少，電泳與濃度測定結果一致，表明各自洗脫液中的gB表達蛋白和gp90表達蛋白純度較高，可滿足兩種單抗制備免疫原的需要。將純化gB表達蛋白和gp90表達蛋白分別以20 30 U g/只的劑量用福氏佐劑乳化制備免疫原，免疫6周齡Balb/c系小鼠兩組,每組免疫三次,每次間隔15-30 d ;最后一次加強免疫后3 4 d，分別將gB蛋白和gp90蛋白免疫鼠眼球放血，拉頸處死，于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，無菌分別摘取兩組免疫鼠的脾臟，剪碎并經100目尼龍網過濾，用 GNK 洗液(NaCl 24g、KCl 1.2g,Na2HPO4 12H20 10.68 g,NaH2PO4 2H20 2.34 g、葡萄糖6 g、苯酚紅0.03 g，混合后加雙蒸水至3000 ml，115°C滅菌15 min)混懸脾細胞，1000r/min離心10 min，收集脾細胞；將各自收集的兩種免疫鼠的I X IO8個脾細胞與2 X IO7 5X IO7個的NSO骨髓瘤細胞混合，再用GNK洗液混懸稀釋至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min,棄上清,分別將兩種混合的細胞沉淀置于37°C水浴中，在I min內緩緩加入
0.7 1.0 mL的PEG-1500(pH 8.5 9.0)，邊加邊輕輕搖動，然后再分別緩慢加入GNK洗液15 ml, 37。。水浴5 min后補加GNK洗液至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min棄上清，將兩種細胞沉淀重懸于1640/HAT選擇培養基中，最后以200 ML/孔分別鋪板至96孔細胞培養板，置于37°C、5%的CO2培養箱中培養7 10 d，用間接免疫熒光試驗分別檢測細胞培養上清，挑選熒光較強的細胞克隆，分別用有限稀釋法連續進行三次細胞亞克隆，最后分別篩選獲得特異性抗MDV和抗REV的單抗雜交瘤細胞株。
(3)抗MDV和抗REV金標單克隆抗體和金標單克隆抗體纖維膜的制備
將篩選獲得的抗MDV和抗REV的單克隆細胞株分別進行擴大培養，用PBS洗滌2遍后1000 r/min離心10 min，收集細胞，以每只I X IO6 2 X IO6個細胞量分別對經產母鼠(母鼠至少一周前腹腔注射滅菌弗氏不完全佐劑)進行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清，分別獲得抗MDV和抗REV的單克隆抗體腹水。以檸檬酸鈉還原法制備金溶膠，即在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05%(wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5% 2%(wt)檸檬酸三鈉溶液，反應后獲得直徑15 nm左右的膠體金。以0.1 mol/L的K2CO3溶液調膠體金的pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將待印跡的抗MDV和抗REV的單抗腹水分別加入pH8.5 9.5的金溶膠中，印跡10 min 后，加 20%(wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 終濃度達到 0.05%，4°C、1500 3000 r/min條件下分別離心20 min,除去未結合的膠體金顆粒,4°C、15000 r/min條件下再次分別離心I h，棄上清液，獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物，用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分別分離純化金標蛋白，獲得膠體金印跡的抗MDV單抗和抗REV單抗。將1:100 1:500稀釋的膠體金印跡的上述兩種單克隆抗體分別吸附于精制玻璃棉(尼龍纖維或聚酯纖維)中，4°C下低溫真空干燥，即分別制得抗MDV和抗REV的金標單克隆抗體纖維膜。(4)抗MDV和抗REV的多克隆抗體的制備
用差速離心或蔗糖密度梯度離心的方法分別對MDV CEF細胞毒和REV CEF細胞毒進行濃縮、純化，甲醛滅活后用福氏佐劑乳化，分別制備免疫原，單獨多次分別免疫接種抗體陰性健康羊或兔兩組。末次免疫20 d后靜脈采血，分別以IFA檢測兩組免疫動物血清中抗MDV和抗REV的抗體水平，效價達到1:2000以上時，心臟采血或頸動脈放血，分別分離制備抗MDV和抗REV的高免血清，以飽和硫酸銨法提取血清中IgG抗體(方法與提取小鼠血清IgG相同，不重述)。(5)試紙條的檢測操作方法
a、檢測樣品液的制備采集病例雞的全血，以抗凝劑生理鹽水作1:10 1:50倍稀釋，低速離心分離血液淋巴細胞懸液待檢；若取病雞的組織(如羽髓、肝臟、脾臟、胸腺、法氏囊等)則將其剪碎、研磨，以生理鹽水制成1:2 1:5的待檢測樣品懸液，置4°C澄清或離心收集上清液備用。b、檢測操作將試紙條測試端插入待檢測樣品上清中，插入深度不超過印跡線(MAX)，約30 s后取出試紙條，水平放置約I 5 min,同時觀察結果。C、結果判斷如果在試紙條纖維素膜上只顯示出一條棕紅色對照印跡C，表示檢測結果呈陰性，說明在被檢樣品液中MDV和REV均未檢測出；如果檢測試紙條上的纖維素膜上出現棕紅色的對照印跡C和兩條檢測印跡Tl和T2，表示檢測結果呈雙陽性，即在待檢樣品中同時檢測出MDV和REV ;如果檢測試紙條上的纖維素膜上出現棕紅色的對照印跡C和一條檢測印跡Tl或T2，表示檢測結果呈單陽性，即在待檢樣品中檢測出MDV或REV ;如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作有誤。(6)本發明試紙條的靈敏性、特異性試驗
a、靈敏性試驗。將MDV的CEF細胞培養液用PBS (PH7.4)或雙蒸水分別配制成不同病毒滴度的 病毒溶液(100 PFU/mL、50 PFU/mL、25 PFU/mL、12.5 PFU/mL)，將REV 的CEF細胞培養液用PBS (PH7.4)或雙蒸水分別配制不同病毒滴度的溶液(105_°TCID5Q/mL、104_° TCID50/mLUO3 0 TCID50/mLU02 0 TCID50/mLUOL° TCID5(l/mL)，兩種病毒液按 1:1 的比例混合均勻，將試紙條測試端插入混合病毒液中，插入深度不超過印跡線(MAX)，約30 s后取出試紙條，水平放置約I 5 min,同時觀察結果。插入MDV的100 PFU/mL、50PFU/mL和REV的105_°TCID50/mL,IO4 0 TCID5(l/mL兩種混合病毒液中的試紙條均出現棕紅色的對照印跡C和兩條檢測印跡Tl和T2，即檢測結果為雙陽性；插入MDV 25 PFU/mL和REV IO3 0 TCID5(l/mL的混合病毒液中的試紙條出現棕紅色的對照印跡C，但檢測印跡Tl和T2的棕紅色均較弱，即檢測結果為雙弱陽性；插入MDV 12.5 PFU/mL和REV IO2 0 TCID5(l/mL的混合病毒液的試紙條只顯示出一條棕紅色對照印跡C，即檢測結果為陰性。由此可見，該試紙條對MDV和REV均具有較高的靈敏度，檢測MDV和REV的最低病毒滴度分別為25 PFU/mL和103_° TCID5(l/mL。b、特異性試驗。用本發明的試紙條檢測其他家禽免疫抑制病病毒如禽白血病病毒(ALV)和雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的病毒培養液，結果顯示該試紙條的檢測結果均為雙陰性，說明該試紙條用于檢測MDV和REV具有良好的特異性，可用于MD和RE的快速檢測。(7)上述試紙條的測試原理
當該試紙條測試端(樣品吸附帶)插入待檢測樣品溶液后，待檢溶液通過層析作用帶動待檢病雞病料中的MDV和/或REV病毒粒子及金標抗體纖維膜中的金標MDV和REV抗體一起向纖維素膜層擴散，并最終滲入手柄端吸水層中，擴散過程中待檢MDV和/或REV可與相對應的金標單抗相結合,進而與纖維素膜上檢測印跡中的抗MDV和/或抗REV的多抗IgG結合，從而顯示出棕紅色的檢測印跡Tl和/或T2 ;而對照印跡中的羊或(兔)抗小鼠IgG則可與金標MDV單抗和金標REV單抗結合，形成棕紅色對照印跡C。如果待檢樣品液中沒有MDV和REV，試紙條只顯示出一條棕紅色對照印跡C ;如果纖維素膜上沒有任何棕紅色印跡顯示，則表明試紙條已失效或操作失誤。實施例2:馬立克氏 病病毒和禽網狀內皮組織增生病病毒的快速檢測試紙條，其結構、制備方法與實施例1基本相同，不同之處在于:由尼龍纖維制成的金標抗體纖維層3上附著以膠體金標記的抗MDV和抗REV的混合金標多克隆抗體；在硝酸纖維素制成的纖維素膜層4上分別設有以抗MDV和抗REV單克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測印跡Tl和T2，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液噴涂的對照印跡C。其它包括檢測樣品制備、操作方法和結果判定等均與實施例1相同，不重述。實施例3:馬立克氏病病毒和禽網狀內皮組織增生病病毒的快速檢測試紙條，其結構、制備方法與實施例1基本相同，不同之處在于:由聚酯纖維制成的金標抗體纖維層3上附著有抗MDV和抗REV的混合金標單克隆抗體；在聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上分別設有以抗MDV和抗REV多克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測印跡Tl和T2，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液噴涂的對照印跡C。其它包括檢測樣品制備、操作方法和結果判定等均與實施例1相同。實施例4:馬立克氏病病毒和禽網狀內皮組織增生病病毒的快速檢測試紙條，與實施例3基本相同，不同之處在于:
由尼龍纖維制成的金標抗體纖維層3上附著抗MDV和抗REV的混合金標多克隆抗體；聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上分別設有以抗MDV和抗REV單克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測印跡Tl和T2，以羊(兔)抗小鼠IgG溶液噴涂的對照印跡C。
實施例5:馬立克氏病病毒和禽網狀內皮組織增生病病毒的快速檢測試紙條，與實施例3基本相同，不同之處在于:
由尼龍纖維制成的金標抗體纖維層3上附著有抗MDV和抗REV的混合金標單克隆抗體；在聚偏二氟乙烯制成的纖維素膜層4上分別設有識別另一表位的抗MDV和抗REV單克隆抗體IgG溶液噴涂的檢測印跡Tl和T2，以羊(兔)抗鼠IgG溶液標記出對照印跡C，檢測印跡與對照印跡的排列組合為“/ / /”、“ + + + ”、“1~^”、“丁丁 丁”、“ h h h”中的任意一種。實施例6:試紙條結構和實施例1基本相同，不同之處在于:
支撐層I由不吸水的硬紙條制成，樣品吸附纖維層2由尼龍纖維制成，纖維素膜層4采用純纖維素膜制成。實施例7:試紙條結構和實施例1基本相同，不同之處在于:
樣品吸附纖維層2由聚酯纖維膜制成，纖維素膜層4為羧化纖維素膜制成。實施例8:試紙條結構和實施例1基本相同，不同之處在于:樣品吸附纖維層2用尼龍纖維制成，纖維素膜層4采用聚偏二氟乙烯(PVDF)纖維膜制成。實施例9:紙條結構和實施例1基本相同，不同之處在于:
樣品吸附纖維層2采用 聚酯纖維膜，纖維素膜層4采用純纖維素膜。
權利要求
1.一種一步法快速檢測馬立克氏病病毒MDV和禽網狀內皮組織增生病病毒REV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，所述吸附層由樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成，其特征在于:所述纖維素膜層上標記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對照印跡，以及標記的MDV抗體、REV抗體的檢測印跡，所述MDV抗體、REV抗體為抗MDV、抗REV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標抗體纖維層上附著有與檢測印跡對應的以膠體金標記的抗MDV和抗REV的多克隆抗體或單克隆抗體。
2.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述纖維素膜層由硝酸纖維素膜、純纖維素膜、羧化纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜制成。
3.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述樣品吸附纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。
4.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述支撐層由不吸水的硬質塑膠片或硬紙條制成；所述吸水層用吸水紙制成。
5.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:所述金標抗體纖維層由玻璃棉、尼龍纖維或聚酯纖維制成。
6.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:在所述樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水層上敷設有保護膜 ，且在樣品吸附纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上偏向樣品吸附纖維層一側0.3 0.7 cm處印制有樣品標記線。
7.根據權利要求1所述的試紙條，其特征在于:檢測印跡與對照印跡的排列為“I II ”、“/ / /，，、“十十+，，、“丄丄丄”、“丁丁 丁，，、“ 1-1-卜”中的一種。
8.根據權利要求1 7任一項所述的試紙條，其特征在于:所述膠體金標記的抗MDV和抗REV的單克隆抗體是通過以下方法制備的: 將篩選獲得的抗MDV和抗REV的單克隆細胞株分別進行擴大培養，用PBS洗滌2遍后1000 r/min離心10 min，收集細胞，以每只I X IO6 2X IO6個的細胞量分別對經產母鼠進行腹腔注射，10 20 d后采集小鼠腹水，4000 r/min離心10 min后取上清，分別獲得抗MDV和抗REV的單克隆抗體腹水； 用檸檬酸鈉還原法制備金溶膠:在50 100 mL沸騰的0.01% 0.05% (wt)氯金酸水溶液中加入2 4 mL的0.5 2 %(wt)檸檬酸三鈉溶液，反應后獲得直徑為15 20 nm的膠體金溶膠；以0.lmol/L的K2CO3溶液調節膠體金溶膠的pH值至8.5 9.5，以1:1000 1:1300的印跡比將抗MDV和抗REV的單克隆抗體腹水分別加入膠體金溶膠中，印跡10 min后，加 20 % (wt)的 PEG-10000 至 PEG-10000 的終濃度為 0.05 % (wt)，4°C下、1500 3000r/min離心20 min,除去未結合的膠體金顆粒,在4°C下、15000 r/min再次分別離心I h,棄上清液，獲得初步純化的金標抗體蛋白混合物；然后用丙烯葡聚糖S-400柱層析，分別分離純化金標蛋白，得到膠體金印跡的抗MDV和抗REV的單克隆抗體。
9.根據權利要求8所述的試紙條，其特征在于:所述抗MDV和抗REV的單克隆抗體細胞株是由以下方法分別制備的: 分別用原核表達MDV囊膜糖蛋白gB的重組質粒PET-28a-gB和REV囊膜糖蛋白gp90的重組質粒PET-28a-gp90轉化大腸桿菌BL-21，挑選陽性克隆菌株；搖菌培養后用IPTG誘導蛋白表達，菌液上清經超聲波裂解后過鎳柱純化，分別得到純化的MDV gB表達蛋白和REVgp90表達蛋白；將純化的MDV gB表達蛋白和REV gp90表達蛋白分別以20 30 Ug/只的劑量用福氏佐劑乳化，制備免疫原免疫6周齡Balb/c系小鼠兩組，每組免疫三次，每次間隔15 30d ;最后一次加強免疫后3 4 d，分別將兩組免疫鼠眼球放血，拉頸處死后置于75% (V)的酒精溶液中浸泡5 10 min，無菌摘取免疫鼠的脾臟，剪碎并經100目尼龍網過濾，用GNK洗液混懸脾細胞，1000 r/min離心10 min,收集脾細胞；將每組收集的免疫鼠的I X IO8個脾細胞分別與2X IO7 5X IO7個NSO骨髓瘤細胞混合，再用GNK洗液混懸稀釋至總體積為40 ml, 1000 r/min離心10 min,棄上清,分別將兩種混合細胞沉淀置于37°C水浴中，在Imin內分別緩緩加入0.7 1.0 mL pH值為8.5 9.0的PEG-1500，邊加邊輕輕搖晃，然后再分別緩慢加入GNK洗液15 ml，37°C水浴5 min，最后補足GNK洗液至總體積為40 ml,.1000 r/min離心10 min,棄上清；將兩種細胞沉淀分別重懸于1640/HAT選擇培養基中，最后以200 ML/孔分別鋪板至96孔培養板，置于37°C、5%的CO2培養箱中培養7 10 d，將雜交瘤的培養上清分別用間接免疫熒光試驗檢測，挑選熒光較強的細胞克隆，分別用有限稀釋法連續進行三次細胞亞克隆，最后分別篩選獲得特異性的抗MDV和抗REV的單抗雜交瘤細胞株。
10.根據權利要求9所述的試紙條，其特征在于:所述GNK洗液是由以下方法制備的:稱取 NaCl 24 g、KCl 1.2 g、Na2HPO4 12H20 10.68 g、NaH2PO4 2H20 2.34 g、葡萄糖 6 g、苯酹紅0.03 g,混合后加雙蒸水至3000 ml,115°C滅菌15 min。
全文摘要
發明公開一種一步法快速檢測馬立克氏病病毒MDV和禽網狀內皮組織增生病病毒REV的試紙條，包括不吸水的支撐層、附著在支撐層上的吸附層，吸附層由樣品吸附纖維層、金標抗體纖維層、纖維素膜層及吸水層依次拼接而成；纖維素膜層上標記有抗羊IgG或抗小鼠IgG的對照印跡，以及含有抗MDV和抗REV的抗體檢測印跡；所述抗MDV和抗REV的抗體為抗MDV和抗REV的單克隆抗體或多克隆抗體；所述金標抗體纖維層上附著有與檢測印跡對應的以膠體金標記的抗MDV和抗REV的混合多克隆抗體或單克隆抗體。該試紙條檢測的特異性強、敏感性高，操作簡便，檢測快速，結果直觀，適用于MDV和REV病毒的現場快速聯合檢測，亦可用于兩種病毒的單獨感染或混合感染的鑒別診斷。該試紙條應用范圍廣，便于推廣應用。
文檔編號G01N33/569GK103217527SQ201310133790
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者羅俊, 滕蔓, 張改平, 崔治中, 鄧瑞廣, 江國托, 柴書軍, 趙鵬, 邢廣旭, 李學伍, 喬松林, 程娜, 郝慧芳, 李青梅, 金前躍 申請人:河南省農業科學院
專業數控銑床產品供應商
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