一種用于檢測鉛的電化學傳感器及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】一種用于檢測鉛的電化學傳感器，包括一在三電極系統中用作工作電極的玻碳電極，玻碳電極的檢測端表面修飾有多壁碳納米管，多壁碳納米管上沉積有納米金粒子，巰基修飾的捕獲探針連接在納米金粒子上，前述電化學傳感器還包括適體探針，適體探針與巰基修飾的捕獲探針通過互補配對形成雙鏈結構。本發明采用適體探針，可包裹鉛離子，從而使適體探針與捕獲探針分離，在分離的過程中產生可供檢測的電化學信號從而達到檢測水體中鉛離子含量的目的，具有靈敏度高、選擇性好、穩定性好等優勢。
【專利說明】—種用于檢測鉛的電化學傳感器及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及電化學傳感器【技術領域】，尤其涉及一種用于檢測鉛的電化學傳感器及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002]目前，測定環境中的污染物的方法主要有色譜法、紫外分光法、同步熒光光譜法、分光光度法、導數光度法、流動注射分析法等。這些方法都存在前處理復雜、耗時長、樣品基體效應大、分析周期長等缺陷，對儀器和工作人員的操作水平均具有較高的要求，很難在中小型企業中推廣應用。例如:采用分光光度法檢測污染物時，由于對底物濁度的要求和光干擾物質的影響，限制了其精確性和使用范圍；而采用液相和氣相色譜法檢測，檢測前需要對樣品進行分離，分離過程通常需要預處理，操作步驟比較繁瑣和耗時，檢測儀器相對昂貴，且不便攜帶，不能進行實時檢測。
[0003]電化學生物傳感器是基于生物有機成分(如酶、抗體、核酸、細胞、微生物等)，對待檢物質進行專一的識別，產生的信號經過信號傳導器轉變為電信號、光信號，進而定量檢測出待測物質的一項新技術。運用電化學生物傳感器來檢測環境中的重金屬、病原微生物、有害有機物具有特異性強、檢測靈敏度高、檢測效率高、成本低廉的特點，因此成為了環境保護工作中的一個研究熱點。
[0004]目前，科研人員通過利用各種新型材料修飾電化學傳感器以提高電化學生物傳感器的穩定性、重復性以及結構的可靠性。制作電化學DNA傳感器的關鍵是如何高效地在金上固定DNA探針，并保持其的活性是傳感器能夠檢測的前提。通常DNA探針在金表面固定的方法有通過修飾DNA探針與不修飾DNA探針直接固定兩種方法。這些方法均存在固定不牢固、固定中使用各種親和物質影響DNA的活性、以及容易使用到對環境有害的物質等缺陷。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種制作簡單、穩定性好、靈敏度高、檢測精度高、抗干擾的能力強的電化學傳感器，還相應提供一種電化學生物傳感器的制備方法，以便通過一種工藝簡單、制作迅速的制備方法使固定的DNA探針具有更好的穩定性和高活性的保持；在此基礎上，還提供一種前述電化學傳感器的應用，能夠以簡化操作、快速響應、高檢測精度及較強抗干擾性等特點實現對水體中鉛的高效檢測。
[0006]為解決上述技術問題，提供了一種用于檢測鉛的電化學傳感器，包括一在三電極系統中用作工作電極的玻碳電極，玻碳電極的檢測端表面修飾有多壁碳納米管，多壁碳納米管上沉積有納米金粒子，納米金粒子上連接有巰基修飾的捕獲探針。
[0007]前述的電化學傳感器還包括適體探針，適體探針可與巰基修飾的捕獲探針通過互補配對形成雙鏈結構。當電化學傳感器用于檢測水體中的鉛離子時，將適體探針滴加到前述的玻碳電極上，使適體探針與捕獲探針發生配對反應形成雙螺旋結構，然后將具有適體探針的玻碳電極插入到含有鉛離子的水體中，由于鉛離子對適體探針的親和力強于捕獲探針，適體探針與捕獲探針分離，DNA雙螺旋結構發生裂解，從而產生可供檢測的電化學信號。
[0008]進一步的，巰基修飾的捕獲探針優選為具有SEQ ID N0.1前述的核苷酸序列；適體探針優選為具有SEQ ID N0.2前述的核苷酸序列。
[0009]進一步的，本發明的電化學傳感器還包括信號指示劑，信號指示劑鑲嵌在前述巰基修飾的捕獲探針與適體探針形成的雙鏈結構中，可以放大電化學信號。信號指示劑優選為亞甲基藍；亞甲基藍濃度為0.1?0.5mM時，效果更佳。
[0010]作為本發明的同一技術構思，本發明還提供了上述的用于檢測鉛的電化學傳感器的制備方法，包括以下步驟:
[0011]S1、將多壁碳納米管進行羧化處理得到羧化多壁碳納米管；
[0012]S2、將前述羧化多壁碳納米管配置成懸浮液，然后滴加到玻碳電極的檢測端表面得到多壁碳納米管修飾的玻碳電極；
[0013]S3、將納米金粒子沉積在前述多壁碳納米管修飾的玻碳電極的檢測端表面得到納米金/多壁碳納米管修飾的玻碳電極；
[0014]S4、將納米金/多壁碳納米管修飾的玻碳電極插入巰基修飾的捕獲探針中，前述巰基修飾的捕獲探針通過靜電吸附在納米金上；然后插入巰基乙醇溶液中，使巰基乙醇封閉未被吸附的納米金；
[0015]S5、按照捕獲探針的氨基酸序列，配置與之互補的適體探針探針溶液，完成電化學傳感器的制備。
[0016]進一步的，步驟SI中的前述羧化處理步驟為:將多壁碳納米管浸入過氧化氫與濃硫酸的混合溶液中超聲2.5小時以上，然后洗滌至中性、過濾、真空干燥得到前述羧化多壁碳納米管。前述的過氧化氫與濃硫酸的混合溶液中過氧化氫和濃硫酸的體積比優選為I: 2?4，進一步的優選為1: 3。
[0017]進一步的，前述步驟S2中羧化多壁碳納米管分散在N，N—二甲基甲酰胺中制成懸浮液。
[0018]作為本發明的同一技術構思，本發明還提供了一種采用前述的電化學傳感器或采用前述制備方法制得的電化學傳感器在檢測鉛離子中的應用，包括以下步驟:
[0019]將適體探針滴加到電化學傳感器的玻碳電極的反應端表面進行充分反應，待反應完成后將待測溶液滴加在玻碳電極表面，待充分反應后接入三電極系統的電解池中檢測電流值，根據鉛離子的濃度與電流值建立線性回歸方程:
[0020]Y= - (7.660±0.363) - (1.035±0.03118) x
[0021]其中，Y為對鉛離子檢測時的電流平均值，單位為A ； X為待測溶液中鉛離子的濃度值的自然對數，單位為M ;檢測下限為4.3X 10_15M。
[0022]進一步的，前述應用方法還包括亞甲基藍的添加步驟，適體探針在玻碳電極反應端充分反應后，再將亞甲基藍滴加在玻碳電極反應端表面進行充分反應，待反應完成后再進行待測溶液的檢測，可提高電化學傳感器的靈敏度。進一步的，電解池中的電解質溶液優選為ρΗ5.0?9.0的Tris-HCl緩沖液。
[0023]本發明的創新點在于:
[0024]本發明采用多壁碳納米管和納米金顆粒修飾玻碳電極，多壁碳納米管與納米金顆粒在玻碳電極反應端表面形成復合材料，顯著提高了電化學傳感器的靈敏度和檢測性能。其中多壁碳納米管因為具有高電子傳導性，提供大比表面積，保持生物活性等優點，是一種優秀的生物分子載體和信號傳遞媒介，可以改善電化學傳感器的靈敏度；納米金顆粒對生物分子有很好的親和能力和生物相容性，并且沉積在多壁碳納米管形成了更大的比表面積，為生物分子提供了更多吸附位點，能夠顯著提高生物傳感器和待測溶液間電子的轉移速度，快速獲得穩定的響應電流。
[0025]其次，本發明利用適體探針可與鉛離子形成化學結構穩定的G-四聚體巰基的特性，將捕獲探針通過巰基吸附在納米金粒子的位點上，待捕獲探針完全吸附在納米金的位點上后，如果納米金上還存在為被吸附的位點，則加入巰基乙醇，封閉納米金粒子上未被巰基吸附的位點。接著加入適體探針，使適體探針與捕獲探針進行互補配對形成DNA雙螺旋結構，亞甲基藍鑲嵌在DNA雙螺旋結構的縫隙中。當被檢測的水體中有鉛離子存在時，由于鉛離子與適體探針的結合力更強，使適體探針與捕獲探針分離，DNA雙螺旋結構裂解，適體探針便與鉛離子形成化學結構穩定的G-四聚體，同時亞甲基藍從DNA雙螺旋結構中分離出來。適體探針和捕獲探針在裂解的過程中產生了電流變化，同時亞甲基藍的分離擴大了電流的變化。由于電流變化的大小與裂解的程度有關，而裂解的程度又與鉛離子的濃度有關，本發明根據電流變化的原理制備電化學傳感器，可有效檢測水體中鉛離子的濃度。
[0026]與現有技術相比，本發明的優點在于:
[0027](I)本發明提供的用于檢測鉛的電化學傳感器，綜合了多壁碳納米管、納米金、亞甲基藍以及DNA各自的性質，具有高靈敏、快速響應、高檢測精度及較強抗干擾性等特性。
[0028](2)本發明提供的一種電化學傳感器在檢測鉛離子中的應用，操作簡便，高效，檢測成本低，為水體中鉛的監測和控制過程提供一種有效的分子生物學檢測方法。
[0029]除了上面所描述的目的、特征和優點之外，本發明還有其它的目的、特征和優點。下面將參照圖，對本發明作進一步詳細的說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]構成本申請的一部分的附圖用來提供對本發明的進一步理解，本發明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。
[0031]圖1為實施例1的電化學傳感器的結構及制備流程圖。
[0032]圖2為實施例1的多壁碳納米管修飾的玻碳電極檢測端表面的掃描電鏡圖。
[0033]圖3為實施例1的納米金/多壁碳納米管修飾的玻碳電極檢測端表面的掃描電鏡圖。
[0034]圖4為用差分脈沖伏安法檢測不同濃度的鉛得到的電流變化曲線圖。
[0035]圖5為鉛含量與電流變化的線性回歸圖。
[0036]圖6為電化學傳感器的選擇性對比圖。
【具體實施方式】
[0037]以下結合附圖對本發明的實施例進行詳細說明，但是本發明可以由權利要求限定和覆蓋的多種不同方式實施。
[0038]以下實施例中所米用的材料和儀器均為市售，其中CHI760B電化學系統購于上海辰華儀器公司。[0039]實施例1
[0040]參見圖1，一種用于檢測鉛離子的電化學傳感器，包括一在三電極系統中用作工作電極的玻碳電極、適體探針和亞甲基藍。玻碳電極的檢測端表面修飾有多壁碳納米管，多壁碳納米管上沉積有納米金粒子，納米金粒子上連接有巰基修飾的捕獲探針。當電化學傳感器用于檢測鉛離子時，適體探針與巰基修飾的捕獲探針通過互補配對形成雙鏈結構，亞甲基藍(濃度為0.1mM)鑲嵌在巰基修飾的捕獲探針與適體探針形成的雙鏈結構中。
[0041]亞甲基藍濃度還可以為0.1?0.5mM。
[0042]在本發明中捕獲探針和適體探針可以是任一可形成互補配對的氨基酸序列，為了獲得更強的電化學檢測信號，實施例1的捕獲探針為具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列，具體為:
[0043]5， -CACCCACCCAC-SH-3，；
[0044]適體探針優選為具有SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列，具體為:
[0045]5， -GGGTGGGTGGGTGGGT-3，；
[0046]其中適體探針上的3’端的“GTGGGT”與捕獲探針5’端的“CACCCA”進行互補配對。
[0047]實施例2
[0048]實施例1的電化學傳感器的制備方法。
[0049]將玻碳電極表面拋光，然后用水沖洗玻碳電極表面，再依次用硝酸、丙酮、水進行超聲清洗，最后再用濃度為IOmM Tris-HCl緩沖液(Tris-HCl緩沖液中含有1.0M的KCl)沖洗，自然晾干，然后用于電化學傳感器的制備，具體的制備方法為:
[0050]S1、將多壁碳納米管進行羧化處理得到羧化多壁碳納米管；具體步驟為:
[0051]將多壁碳納米管浸入過氧化氫與濃硫酸(濃硫酸的質量分數為98% )的體積比為I: 3的混合溶液中(過氧化氫和濃硫酸的體積比還可以為1: 2?4)，在溫度為50°C下超聲2.5h (超聲時間可以是2.5h以上)，然后分別用超純水與無水乙醇清洗至中性，抽濾，在溫度為60°C中真空干燥24h。
[0052]S2、將羧化多壁碳納米管懸浮液放入N，N- 二甲基甲酰胺中制備成濃度為1.0mg/HiL的懸浮液，然后將前述懸浮液滴加到玻碳電極的檢測端表面，在常溫下風干得到多壁碳納米管修飾的玻碳電極。
[0053]S3、采用電化學沉積法將納米金粒子沉積在前述多壁碳納米管修飾的玻碳電極檢測端表面得到納米金/多壁碳納米管修飾的玻碳電極。
[0054]前述電化學沉積法中，電沉積法的初始電位為0V，采樣間隔為0.ls，沉積時間為60s。
[0055]S4、將納米金/多壁碳納米管修飾的玻碳電極插入濃度為1.0 μ M的巰基修飾的捕獲探針中(捕獲探針為具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列)，捕獲探針通過化學反應和靜電吸附在納米金上；然后插入濃度為2.0mM的巰基乙醇溶液中，使巰基乙醇封閉未被吸附的納米金。
[0056]S5、配制與捕獲探針的氨基酸序列互補的濃度為1.0 μ M的適體探針溶液(適體探針為具有SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列)和濃度為0.1mM的亞甲基藍溶液，完成電化學傳感器的制備。
[0057]分別將S2步驟中制備得到的多壁碳納米管修飾的玻碳電極和S3步驟中制備得到的納米金/多壁碳納米管修飾的玻碳電極進行電鏡掃描，掃描結果參見圖2、3。
[0058]從圖2、3中可以看出:玻碳電極上的多壁碳納米管分散均勻(圖2)，金納米粒子平鋪在多壁碳納米管上(圖3)。
[0059]實施例3
[0060]實施例1的電化學傳感器在檢測鉛離子中的應用，具體的檢測方法為:
[0061]將適體探針滴加到電化學傳感器的玻碳電極的反應端表面，37°C下反應60分鐘，然后將濃度為0.1mM的亞甲基藍(亞甲基藍濃度可以為0.1~0.5mM)滴在玻碳電極的反應端表面，37°C下反應20分鐘；接著分別將鉛離子濃度分別為5.0X10_nM~1.0X10_14M的待測溶液滴加在玻碳電極表面，反應30分鐘之后，接入三電極系統的電解池中，以pH為
7.4的Tris-HCl作為電解質溶液，檢測電流值。
[0062]圖4 是鉛離子濃度分別為 OM (a)、1.0X KT14M (b)、5.0X KT14M(C)、1.0X KT13M (d)、
5.0X KT13M (e)、1.0 X KT12M (f)、5.0 X KT12M (g)、I X KT11M (h)與 5.0 X KT11M (i)的待測溶液的差分脈沖伏安曲線(DPV曲線)，圖5是鉛離子濃度與電流變化的線性回歸方程圖，從圖4和圖5中可知，鉛離子的濃度與電流值的線性回歸方程為:
[0063]Y= - (7.660±0.363) - (1.035±0.03118) x
[0064]其中，Y為對鉛離子檢測時的電流平均值，單位為A ； X為待測溶液中鉛離子的濃度值的自然對數，單位 為M ；R2 = 0.994 ;檢測下限為4.3X 10_15M(檢測下限按照按照3倍空白樣的標準偏差計算)。
[0065]在實施例3中，電解池中的電解質溶液還可以為pH5.0~9.0的TriS-HCl緩沖液；亞甲基藍溶液制備方法為:取0.007478g亞甲基藍溶于IOOmL的超純水中。
[0066]實驗例I
[0067]為了進一步驗證本實施例的電化學傳感器及其檢測方法的檢測效果，現將三組鉛離子濃度分別為I X IO^moI 5 X IO^12moI.L—1、I X 10115mol.L—1的待測溶液用實施例1的電化學傳感器進行測定(測定方法參照實施例3)，進行回收率實驗。
[0068]檢測步驟:采用實施例1的電化學傳感器對待測溶液進行檢測。
[0069]將適體探針滴加到電化學傳感器的玻碳電極的反應端表面，37°C下反應60分鐘，然后將濃度為0.1mM的亞甲基藍滴在玻碳電極的反應端表面，37°C下反應20分鐘；接著將鉛離子濃度分別為IXlO-1W.L-1JXIO-12Iii0I.ΙΛ1Χ10-15πιΟ1.L—1的待測溶液滴加在玻碳電極表面，反應30分鐘之后，接入20mL三電極系統的電解池中，以pH為7.4的Tris-HCl作為電解質溶液，檢測電流值。根據所產生的電流信號的強弱對應待檢測環境水樣中鉛離子的濃度及含量。檢測結果如表1所示。
[0070]表1:三組環境樣品的回收率驗證結果
[0071]
【權利要求】
1.一種用于檢測鉛的電化學傳感器，包括一在三電極系統中用作工作電極的玻碳電極，其特征在于，所述玻碳電極的檢測端表面修飾有多壁碳納米管，所述多壁碳納米管上沉積有納米金粒子，所述納米金粒子上連接有巰基修飾的捕獲探針，所述電化學傳感器還包括適體探針，所述適體探針與所述巰基修飾的捕獲探針通過互補配對形成雙鏈結構。
2.根據權利要求1所述的電化學傳感器，其特征在于，所述巰基修飾的捕獲探針為具有SEQ ID N0.1所述的核苷酸序列，所述適體探針為具有SEQ ID N0.2所述的核苷酸序列。
3.根據權利要求1所述的電化學傳感器，其特征在于，所述電化學傳感器還包括信號指示劑，所述信號指示劑鑲嵌在所述捕獲探針與適體探針形成的雙鏈結構中。
4.根據權利要求3所述的電化學傳感器，其特征在于，所述信號指示劑為亞甲基藍，所述亞甲基藍濃度為0.1~0.5mM。
5.—種如權利要求1至4中任意一項所述電化學傳感器的制備方法,其特征在于,包括以下步驟: 51、將多壁碳納米管進行羧化處理得到羧化多壁碳納米管； 52、將所述羧化多壁碳納米管配置成懸浮液，然后滴加到玻碳電極的檢測端表面得到多壁碳納米管修飾的玻碳電極； 53、將納米金粒子沉積在所述多壁碳納米管修飾的玻碳電極的檢測端表面得到納米金/多壁碳納米管修飾的玻碳電極； 54、將納米金/多壁碳納米管修飾的玻碳電極插入巰基修飾的捕獲探針中，使所述巰基修飾的捕獲探針吸附在納米金上；然后插入巰基乙醇溶液中，使巰基乙醇封閉未被吸附的納米金； 55、配制適體探針溶液,完成電化學傳感器的制備。
6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟SI中的所述羧化處理步驟為:將多壁碳納米管浸入過氧化氫與濃硫酸的混合溶液中超聲2.5小時以上，然后洗滌至中性、過濾、真空干燥得到所述羧化多壁碳納米管。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述過氧化氫與濃硫酸的混合溶液中過氧化氫和濃硫酸的體積比為1: 2~4。
8.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S2中羧化多壁碳納米管分散在N，N—二甲基甲酰胺中制成懸浮液。
9.一種用權利要求1至4中任意一項所述的電化學傳感器或采用權利要求5至8中任意一項所述制備方法制得的電化學傳感器在檢測鉛離子中的應用，其特征在于，包括以下步驟: 將適體探針滴加到電化學傳感器的玻碳電極的反應端表面進行反應，反應完成后將待測溶液滴加在玻碳電極表面進行反應，待反應完成后接入三電極系統的電解池中檢測電流值，根據鉛離子的濃度與電流值建立線性回歸方程:
Y= - (7.660±0.363) - (1.035±0.03118) x 其中，Y為對鉛離子檢測時的電流平均值，單位為A ； X為待測溶液中鉛離子的濃度值的自然對數，單位為M ;檢測下限為4.3X 10_15M。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于:所述適體探針在與玻碳電極反應端反應完成后，再將亞甲基藍滴加在玻碳電極反應端表面進行反應，待反應完成后再進行待測溶液的檢測；所述 電解池中的電解質溶液為PH5.0~9.0的Tris-HCl緩沖液。
【文檔編號】G01N27/30GK104020204SQ201410275635
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】竺園, 曾光明, 章毅, 湯琳, 陳俊, 程敏, 郭遠, 袁玉潔 申請人:湖南大學
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