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一種五味子有機酸分析方法
【專利摘要】本發明公開了一種五味子有機酸分析方法。本發明提供了采用GC-MS分析五味子炮制品中有機酸的分析方法，同時提供了五味子炮制品中4-氧代戊酸的含量測定方法。該分析方法是：取五味子粉加入硫酸甲醇、NaCl及乙醚-氯仿混合液、無水硫酸鈉，干燥，制得樣品；進行GC-MS分析。本發明針對五味子炮制品的有機酸的分析方法具有較強的專屬性和良好的重現性，為五味子炮制前后有機酸的質量控制提供了依據。
【專利說明】一種五味子有機酸分析方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及中藥飲片的質量控制領域，具體涉及五味子飲片有機酸的分析方法及其中代表性物質4-氧代戊酸的質量控制方法。
【背景技術】
[0002]五味子是木蘭科五味子Schisandra Chinese (Turcz.) Baill.的干燥成熟的果實，具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心之效。臨床用于久嗽虛喘，夢遺滑精，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗，盜汗，津傷口渴，短氣脈虛，內熱消渴，心悸失眠。《中國藥典》2010版收載的五味子的炮制品種是五味子及醋蒸五味子，在五味子的臨床應用上亦以此兩種為主，醋蒸后酸澀作用增強，澀精止瀉作用增強。五味子中主要成分包括木脂素、揮發油、有機酸類等。其中，木脂素的成分主要為聯苯環辛烯型木脂素，現代研究多認為其為五味子中最主要的生物活性成分，具有保肝、抗氧化等藥理作用，以五味子醇甲、五味子醇乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素等為代表，揮以油主要以a-菔烯，莰烯，(6-菔烯，月桂烯，a-萜品烯，檸檬烯，Y -萜品烯等為主，而有機酸多以小分子有機酸為主，如枸櫞酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸等。
[0003]目前藥典及各研究報道主要集中在對其所含木脂素成分的研究，有較多的文獻對五味子炮制前后的木脂素含量進行了分析，其結果說明五味子經醋蒸后木脂素含量稍有增加，但基本無顯著性差異，現版藥典中關于五味子飲片及醋五味子飲片的質量控制均只以木脂素代表性成分五味 子醇甲作為其指標性成分，且限度相同。但五味子在醋蒸前后的藥效作用及臨床運用有較大的差異，且五味子醋蒸后主要體現的是止瀉作用增強，尚無其增強止瀉的相關成分的文獻報道。因此對五味子炮制品進行全面的質量評價，特別是選擇與藥效作用相關成分并確定其限度，才能更加有效地保證五味子炮制品的質量，以保證其在臨床上發揮最大的功效。
[0004]作為收斂固澀藥的代表，五味子中的有機酸成分亦不容忽視。五味子的藥效作用應是多成分的綜合作用，不僅僅體現在其主要的木脂素類成分，因此對五味子中有機酸的化學成分、藥理作用亦應深入研究，特別是炮制前后在有機酸上的差異。文獻上對五味子有機酸的分析主要采取的是電位滴定法測定其所含的總有機酸含量，而對其具體的有機酸成分報道較少，特別是醋蒸后有機酸成分的變化無文獻報道。
[0005]本發明針對現有研究的空白，采用新的手段對五味子中的有機酸進行了質量評價，特別是對生五味子及醋五味子有機酸采取了直接甲酯化的方法，并采用氣質聯用的方法進行了全面的分析，研究過程中發現五味子醋蒸后4-氧代戊酸的含量明顯增加，通過藥理實驗證明4-氧代戊酸具有止瀉的作用，測定了其中4-氧代戊酸的含量并規定了限度，解決了五味子炮制品有機酸質量控制的難題，充分體現了與藥效相關的指標來控制飲片質量的要求，提高后的有機酸質量檢測能更好地控制五味子炮制品中的有機酸的質量，本方法具有較強的專屬性和良好的重現性。
【發明內容】

[0006]為了解決上述問題，本發明的目的在于提供一種五味子有機酸分析檢測的方法，并建立五味子炮制品中4-氧代戊酸的含量測定方法。為了達到這個目的，采用如下技術方案:
[0007]—種五味子炮制品有機酸的分析方法，包括以下步驟:
[0008](I)樣品制備方法:取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各約0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min)，取上清液，加適量無水硫酸鈉，干燥，即得。
[0009](2)GC-M S分析條件:質譜條件:EI離子源；電子能量70eV ;離子源溫度230°C;四級桿溫度150°C;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。色譜條件:HP_5色譜柱(30mX 250 u m,0.5 u m);氦氣(99.999%)為載氣，流速 1.0mL/min ;柱前壓 0.17IMPa ;進樣 口溫度 250°C ；分流進樣(分流比15:1);程序升溫:初始溫度40°C，以5°C /min的速率升至260°C (恒溫lOmin)。
[0010]采用上述方法分析五味子炮制品有機酸，結果表明:五味子醋蒸后，4-氧代戊酸在生五味子飲片中其相對含量為0.692%，而在醋五味子飲片中相對含量達到1.653%，醋五味子中4-氧代戊酸相對含量是生五味子中的2.38倍。
[0011]本發明還公開一種利用上述有機酸分析方法的4-氧代戊酸的含量測定方法，該方法包括以下步驟:
[0012](I)對照品溶液的制備:分別精密吸取4-氧代戊酸對照品適量置5mL量瓶中，各加10%硫酸甲醇溶液溶解并定容至刻度。
[0013](2)內標溶液的配制精密稱取水楊酸甲酯適量至IOOmL量瓶中，用乙醚-氯仿混合液(2:1)溶解并稀釋至刻度。
[0014](3)供試品溶液的制備取五味子飲片粉末(60目)0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL溶液，置于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2:1) 2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min)，精密吸取上清液lmL，加入水楊酸甲酯內標溶液lmL，加適量無水硫酸鈉，干燥，即得。
[0015](4) GC-MS分析條件質譜條件:EI離子源；電子能量70eV;離子源溫度230°C ；四級桿溫度150 °C ;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。色譜條件:HP_5色譜柱(30mX250umX0.5um);氦氣(99.999%)為載氣，流速 1.0mL/min ;柱前壓 0.17IMPa ;進樣口溫度250°C ;分流進樣(分流比15:1);程序升溫:初始溫度40°C，以5°C /min的速率升至140。。。
[0016](5)含量測定:精密吸取對照品及供試品溶液I U 1，注入氣相色譜儀，測定(n=3)，即得。
[0017]本發明還公開了一種五味子質量控制方法，是用上述方法測定五味子中4-氧代戊酸含量，按照五味子干燥品中4-氧代戊酸含量計，結果不少于設定值。生五味子與醋五味子的設定值分別為0.28%,0.60%。本發明對五味子有機酸進行了全面的分析并提出了質量控制方法，該方法提供了氣相色譜法測定藥物中4-氧代戊酸成分的含量，本發明的質量控制方法具有較強的專屬性和良好的重現性。【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為五味子炮制品有機酸甲酯化GC-MS總離子流色譜圖。
[0019]圖2為五味子炮制品有機酸部位甲酯化GC-MS總離子流色譜圖。
[0020]圖3為4-氧代戊酸甲酯質譜圖。
[0021]圖4為4-氧代戊酸含量測定標準曲線圖。
[0022]圖5為五味子炮制品4-氧代戊酸含量測定GC-MS總離子流圖。
【具體實施方式】
[0023]結合【具體實施方式】，對本發明進一步說明如下:
[0024]實施例1、五味子不同炮制品有機酸的分析比較
[0025]1.1儀器與試藥
[0026]1.1.1 儀器
[0027]美國Agilent GC6890-MS型氣相色譜-質譜聯用儀(配有NIST2005標準譜庫)，LXJ-2B多管離心機(上海安亭科學儀器廠)，METTLER AE240電子分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司)，THZ-D臺式恒溫振蕩器(太倉市實驗設備廠)。
[0028]1.1.2 試劑
[0029]甲醇、濃硫酸、氯仿、乙醚、無水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純。
[0030]1.2樣品的制備
[0031]1.2.1五味子飲片甲酯化樣品的制備
[0032]取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各約0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加A 10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min (3000r/min),取上清液,力口適量無水硫酸鈉，干燥，即得。
[0033]1.2.2飲片試樣空白的制備
[0034]取生五味子(60目)、醋五味子(60目)各約0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉，干燥，即得。
[0035]1.2.3醋甲酯化試樣的制備
[0036]取IOmL醋按醋蒸五味子的炮制工藝，常壓蒸5h后，加水定容至25mL,精密吸取0.1mL溶液(相當于0.2g藥材中加入的輔料醋的量)，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min (3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉，干燥，即得。
[0037]1.2.4醋試樣空白的制備
[0038]取IOmL醋按醋蒸五味子的炮制工藝，常壓蒸5h后，加水定容至25mL,精密吸取
0.1mL溶液(相當于0.2g藥材中加入的輔料醋的量)，置具塞試管中，精密加入甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h (150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿(2:1)混合液2mL,混旋3min,離心5min (3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉,干燥，即得。
[0039]1.2.5試劑甲酯化空白的制備
[0040]精密吸取10%的硫酸甲醇1.0mL溶液置具塞試管中，于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2:1)2mL,混旋3min，離心5min(3000r/min),取上清液,加適量無水硫酸鈉,干燥，即得。
[0041]1.2.6試劑空白的制備
[0042]精密吸取甲醇1.0mL置具塞試管中，于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h( 150r/min)后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液(2: l)2mL,混旋3min,離心5min(3000r/min)，取上清液，加適量無水硫酸鈉，干燥，即得。
[0043]1.3GC-M S 分析條件
[0044]質譜條件:EI離子源；電子能量70eV ;離子源溫度230°C ;四級桿溫度150°C ;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。
[0045]色譜條件:HP-5色譜柱(30mX250iim，0.5iim);氦氣(99.999%)為載氣，流速
1.0mL/min ;柱前壓0.17IMPa ;進樣口溫度250°C ;分流進樣(分流比15:1);程序升溫:初始溫度40°C，以5°C /min的速率升至260°C (恒溫IOmin)。
[0046]將各供試品溶液1.0 ii L按1.3項下條件進行GC-MS分析。
[0047]1.4 結果
[0048]在實驗過程中，對甲酯化反應條件進行了優選:分別比較了甲酯化試劑10%硫酸甲醇溶液和苯-10%硫酸甲醇溶液(1: 1)，硫酸濃度8%硫酸-甲醇、10%硫酸-甲醇、12%硫酸-甲醇，甲酯化試劑的用量lmL、2mL、3mL，甲酯化時間12小時、24小時、36小時，根據GC分析結果，以出峰的個數與豐度為指標，確定10%硫酸-甲醇ImL振蕩24小時甲酯化基本完全；對萃取溶劑苯和氯仿-乙醚進行比較，發現以苯為提取溶劑的色譜圖，溶劑出峰時間晚，為了避免對有機酸成分的干擾，選用氯仿-乙醚(2:1)作為萃取溶劑；為促進甲酯化液分液，在其中加入了飽和氯化鈉溶液，并對其的用量比例進行了為1、1.5mL、2mL考察，確定2mL飽和氯化鈉符合酸度要求。
[0049]將五味子炮制品有機酸甲酯化物及空白樣品用氣質聯用儀進行分離、鑒定，經與NIST2005標準譜庫對比檢索，結果從生、醋五味子飲片中檢出69、70種成分，分別占其總量的93.360%、92.226%。具體結果見表I及圖1。
[0050]從表I檢出的結果可以看出，生五味子與醋五味子的有機酸在化學成分組成有一定的相似性。同時，兩者在化學成分的種類及成分組成的相對比例上均有一定的差別。
[0051]有些成分在五味子醋蒸后已無法檢測到，即生五味子飲片中有，而對應的醋品中未檢測到，如9.478min的丙二酸二甲酯(生五味子中的百分含量為0.033%)。
[0052]但同時在醋蒸后，有一些新的化合物的被檢測到，如4.522min的2-羥基丙酸甲酯為醋的特征峰，醋五味子及輔料醋中均檢出此物，而在對應的生品中均無此物。22.807min的a -羥基苯丙酸甲酯(醋五味子中的百分含量為0.041%), 32.89min的未知物(醋五味子中的百分含量為0.029%), 39.148min的未知物(醋五味子中的百分含量為0.076%)，以上物質在生五味子中均未檢測到，因此說明此物質可能是醋蒸加熱過程所產生。
[0053]但較多的是成分在醋蒸后含量上產生了變化差別。醋蒸后，有的含量增高，如10.184min的2，2-二甲氧基丙酸甲酯(生藥0.016%，醋藥0.084%，);11.46min4_氧代戊酸甲酯(生藥0.692%，醋藥1.653%)； 14.409min的未知物(生藥峰量小未積分，醋藥0.021%,)；16.631min的未知物(生藥1.67%，醋藥3.284%) ；19.646min的未知物(生藥0.213，醋藥0.323%) ；21.536min 的未知物(生藥 0.006%,醋藥 0.019%) ；21.598min 的未知物(生藥0.016%，醋藥 0.024%)；29.71min 的未知物(生藥 0.031%，醋藥 0.043%)；31.163min 的 12-甲基十三酸甲酯(生藥0.068%，醋藥0.105%) ;33.063的未知物(生藥0.199%，醋藥0.516%);33.316min的十五酸甲酯(生藥0.067%，醋藥0.11%) ；33.473的未知物(生藥0.013%，醋藥0.031%) ；37.371min的十七酸甲酯(生藥0.021%,醋藥0.038%) ；39.711min的未知物(生藥0.366%，醋藥0.533%)。也有醋蒸后含量降低的，主要是一些非酸的化合物及未知化合物，且這些化合物的相對含量均小于0.2%，如22.431min的未知物、24.372min的1-丙烯-1，2，3-三羧酸三甲酯、25.732min 的 I, 2，3，4，4a, 5，6，8a_八氫_4a，8-二甲基-2-( 1-甲乙基)-萘；25.87min的2-十三烷酮；26.461min的1-甲基-4- (1，2，2-三甲基環戊基)苯；26.812min 的 1，6_ 二甲基-4- (1-甲基乙基)_1，2，3，4-四氫萘、27.326min 的 a -白菖考烯、29.187min 的 I, 2, 4a, 5，8，8a_ 六氫-4，7-二甲基-1-(1-甲乙基)-萘；29.483min的香橙烯；29.925min的1A, 2，3,4, 4A, 5,6, 7B-八氫化_1，1,4, 7-四甲基-1H-環丙烯并奧；30.096min 的 2,6,6,9-四甲基-三環[5.4.0.0 (2, 8)] ^^一 _9_ 烯；30.251min 的未知物；30.427min 的 6- 二甲基-4- (1-甲基乙基)萘；30.669 的 2,4a, 5，6，9a_ 六氫-3,5,5,9-四甲基(IH)苯并環庚烯；30.872min的1，5，5，9-四甲基-1，8-二烯-螺[55] 十一烷；32.171min的未知物；32.514min的未知物；33.563的未知物；33.96的未知物；36.907min的未知物；39.064的未知物。
[0054]從五味子樣品甲酯化后GC-MS總離子流圖可見，五味子醋蒸后，4-氧代戊酸在生五味子飲片中其相對含量為0.692%，而在醋五味子飲片中相對含量達到1.653%，醋五味子有機酸相對含量是生五味子有機酸相對含量有2.38倍，提示其可能與醋蒸后五味子的藥效作用相對應。
[0055]表1五味子不同炮制品有機酸GC-MS分析結果
[0056]
【權利要求】
1.一種五味子有機酸分析方法，其特征在于包括以下步驟: (1)樣品制備方法:取五味子粉末約0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液2mL,混旋3min,離心5min,取上清液,加適量無水硫酸鈉，干燥，即得； (2)GC-M S分析條件:質譜條件:EI離子源；電子能量70eV ;離子源溫度230°C ;四級桿溫度150°C ;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min ;色譜條件:HP_5色譜柱；氦氣為載氣，流速1.0mL/min ;柱前壓0.17IMPa ;進樣口溫度250°C ;分流進樣；程序升溫:初始溫度40°C，以5°C /min的速率升至260°C，再保持lOmin。
2.一種測定4-氧代戊酸含量的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)對照品溶液的制備分別精密吸取4-氧代戊酸對照品適量置5mL量瓶中，各加10%硫酸甲醇溶液溶解并定容至刻度； (2)內標溶液的配制精密稱取水楊酸甲酯適量至IOOmL量瓶中，用乙醚-氯仿混合液溶解并稀釋至刻度； (3)供試品溶液的制備取五味子粉末0.2g，精密稱定，置具塞試管中，精密加入10%的硫酸甲醇1.0mL溶液，置于恒溫振蕩器中35°C振蕩24h后，精密加入飽和NaCl溶液2mL及乙醚-氯仿混合液2mL,混旋3min,離心5min,精密吸取上清液ImL,加入水楊酸甲酯內標溶液lmL，加適量無水硫酸鈉，干燥，即得； (4)GC-MS分析條件 質譜條件:EI離子源；電子能量70eV ;離子源溫度230°C ;四級桿溫度150°C;檢測電壓1235V ;溶劑延遲3.2min。色譜條件:HP_5色譜柱；氦氣為載氣，流速1.0mL/min ;柱前壓0.17IMPa ;進樣口溫度250°C ;分流進樣；程序升溫:初始溫度40°C，以50C /min的速率升至140°C ； (5)含量測定精密吸取對照品及供試品溶液IU 1，注入氣相色譜儀，測定，即得。
3.—種五味子質量控制方法，其特征在于，用權利要求2的方法測定五味子中4-氧代戊酸含量，按照五味子干燥品中4-氧代戊酸含量計，結果不少于設定值。
4.根據權利要求3所述4-氧代戊酸的含量測定方法，其特征在于按照五味子炮制品干燥品中4-氧代戊酸含量計，生五味子與醋五味子的設定值分別為0.28%, 0.60%。
【文檔編號】G01N30/02GK103604890SQ201310654107
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】殷放宙, 殷武, 李林, 陸兔林, 蔡寶昌, 李偉東 申請人:南京中醫藥大學