專利名稱：萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條及其制備方法與用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于食品安全領域中涉及β2-受體激動劑殘留檢測領域。具體而言，本發明涉及萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條及其制備方法與用途。
背景技術：
萊克多巴胺(Ractopamine)、西馬特羅(Cimaterol)都屬于β2-受體激動劑,近年來，很多不法商家將它們作為鹽酸克倫特羅的替代品添加于動物飼料中，當長期用來飼喂動物時，萊克多巴胺、西馬特羅對動物有營養再分配的作用，促進動物體內蛋白質沉積而抑制脂肪形成，從而顯著提高動物胴體的瘦肉率。但萊克多巴胺、西馬特羅在體內代謝緩慢、易聚積、藥物殘留率高，當人類食用殘留該類藥物的動物性食品后會產生中毒從而對人體健康產生相當的危害，通常表現為肌肉震顫、心悸、發燒、惡心嘔吐等，嚴重的會昏迷甚至死亡。因此，許多國家已經禁止在動物飼料中添加β2_興奮劑，但是關于β2_興奮劑的食品安全事件時有發生。目前，國內外檢測萊克多巴胺和西馬特羅的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜質譜聯用技術(GC-MS)、液相色譜質譜聯用技術(LC-MS)、酶聯免疫吸附法(ELISA)。在食品安全檢測中，往往先用ELISA進行初篩后，再對陽性樣本用HPLC或GC-MS、LC-MS進行確證。但是上述方法所用的儀器設備昂貴復雜、成本高，同時需要對操作人員進行特殊培訓，且實驗結果不能立即顯示，因此不適用于商檢、防疫、畜牧生產者對懷疑對象的快速在線檢測和監控。膠體金試紙條是 以膠體金作為免疫層析的指示物，其原理是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發生高特異高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶)，通過直接運用可目測的膠體金標記物而得到直觀的實驗結果。雖然該方法快速方便，但是膠體金試紙條仍有以下缺點:(I)只有當金顆粒集聚到一定量(IO7個/mm2)時，才出現肉眼可見的紫紅條帶，且該顏色條帶與背景對比度不大，從而限制了檢測靈敏度。(2)樣品基質效應明顯，背景干擾大。(3)無法實現定量檢測。(4)只能檢測單個污染物此外，雖然現在也有單獨檢測萊克多巴胺的膠體金試紙條和西馬特羅的檢測卡，但是至今仍沒有一種能同時定性且定量檢測萊克多巴胺和西馬特羅的產品。因此，目前對于同時定量檢測萊克多巴胺與西馬特羅的檢測手段仍有待改進。
發明內容
本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一。為此，本發明的一個目的在于提出一種能有效檢測萊克多巴胺和西馬特羅的二聯膠體金試紙條及其制備方法和用途。在本發明的第一方面，參考圖1，本發明提出了一種萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條，包括:底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述金標墊上是含有膠體金標記的抗萊克多巴胺單克隆抗體和膠體金標記的西馬特羅單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上進一步形成有兩條檢測線和一條質控線，所述檢測線依次由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合的萊克多巴胺檢測抗原線狀點樣和能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原線狀點樣組成，所述質控線由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合和抗西馬特羅單克隆抗體結合的驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。由此，可以有效地獲得萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條，從而對樣品中萊克多巴胺、西馬特羅進行定量檢測。在本發明的又一方面，本發明提出了一種制備前面所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條的方法，其包括下列步驟:制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上形成有兩條檢測線和一條質控線；制備金標墊；以及組裝試紙條，其中，用能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合的萊克多巴胺檢測抗原和能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原在所述硝酸纖維素膜上進行線狀點樣分別作為所述兩條檢測線；用能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合和能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的驢抗小白鼠抗體在所述硝酸纖維素膜上進行線狀點樣作為質控線。由此，通過本發明的方法，能有效制備前面所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條，從而對樣品中萊克多巴胺、西馬特羅進行定量檢測。根據本發明的實施例，所述檢測線和質控線是通過下列步驟獲得的:將硝酸纖維素膜按20mm 30mm寬的尺寸剪裁；將經純化濃度調整為0.2mg/mL 1.0mg/mL的萊克多巴胺、西馬特羅檢測抗原，在膜上線狀點樣作為檢測線，其中，檢測線點樣位置離膜底邊15mm 18mm,兩條檢測線之間相隔5mm ;將經純化濃度調整為0.5mg/mL 1.5mg/mL的驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線，質控線點樣位置離膜底邊IImm 13mm ;將所述硝酸纖維素膜于37攝氏度烘干處理過夜后，在室溫干燥的環境下保存。由此，通過本發明實施例的方法，可以有效地制備大小均一、位置固定并且分別具有特定濃度抗原、抗體的檢測線和質控線，從而獲得具有檢測線和質控線的萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條，進而有效地對萊克多巴胺、西馬特羅進行定量檢測。根據本發 明的實施例，金標墊是通過下列步驟獲得的:分別選用能與萊克多巴胺、西馬特羅檢測抗原結合的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體用膠體金標記；把所述的用膠體金標記過的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體混合后，噴在玻璃纖維膜上。由此，通過本發明實施例的方法，可以有效地制備具有能與萊克多巴胺、西馬特羅檢測抗原結合的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體用膠體金標記的金標墊，從而獲得具有金標墊的萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條，進而有效地對萊克多巴胺、西馬特羅進行定量檢測。在本發明的另一方面，本發明提供了一種前面所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條檢測萊克多巴胺、西馬特羅的方法，包括以下步驟:配制已知系列濃度的萊克多巴胺、西馬特羅混合標準品并加入所述膠體金讀取儀的樣本孔中，10分鐘后檢測對應的光密度數值并建立標準曲線，將含有檢測樣品的試紙條放入所述膠體金讀取儀中，讀取檢測數值，以及通過所述標準曲線計算所述檢測樣品中萊克多巴胺、西馬特羅含量。由此，通過本發明所提供的方法，可以有效地制備采用該膠體金讀取儀檢測萊克多巴胺、西馬特羅的校準曲線，從而配合本發明提供的萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條有效地對萊克多巴胺、西馬特羅進行定量檢測。有益效果1、多殘留監測:本發明采用萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條能根據T線和C線的顯色情況同時監測樣品中萊克多巴胺、西馬特羅的污染情況。2、靈敏度高:本發明采用萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條配膠體金讀取儀的方法，能通過儀器替代肉眼觀察實驗結果，克服了肉眼判斷帶來的誤差，從而提高了檢測靈敏度，本方法檢測萊克多巴胺和西馬特羅的靈敏度分別為0.5ppb和lppb。3、定量:本發明采用萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條配膠體金讀取儀的方法，可以根據膠體金讀取儀顯示器上的顯示數值，參照標準曲線即可分別得出被檢樣品中萊克多巴胺和西馬特羅的含量。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1是根據本發明實施例的萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條的結構圖；圖2是根據本發明實施例的一種膠體金讀取儀的示意圖；圖3是根據本發明實施例的定量檢測萊克多巴胺、西馬特羅流程圖。
具體實施例方式本實施例給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1免疫抗原的合成1.1合成萊克多巴胺免疫抗原采用混合酸酐法制備萊克多巴胺-BSA免疫抗原:稱取萊克多巴胺34mg和IOmg丁二酸酐在2mL吡啶中反應，室溫下攪拌過夜，置于通風櫥中將吡啶完全蒸發，此反應產物為萊克多巴胺-半丁二酸酐；將其溶于2mL N, N- 二甲基甲酰胺和2mLl，4- 二氧六環混合物中，再加26.2μ L的三正丁胺，在冰浴中攪拌10分鐘，再加氯甲酸異丁酯15L，室溫反應，攪拌I小時；將此混合物逐滴加入預冷的蛋白溶液(IOOmg BSA溶解于0.1M硼酸鈉pH8.5)，室溫反應過夜，在PBS中透析72小時以上，透析后即得到純化的萊克多巴胺-BSA免疫抗原。
權利要求
1.一種萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條，其特征在于，包括: 底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊， 其中，所述金標墊上是含有膠體金標記的抗萊克多巴胺單克隆抗體和膠體金標記的西馬特羅單克隆抗體， 所述硝酸纖維素膜上進一步形成有兩條檢測線和一條質控線， 所述檢測線依次由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合的萊克多巴胺檢測抗原線狀點樣和能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原線狀點樣組成， 所述質控線由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合和抗西馬特羅單克隆抗體結合的驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。
2.一種制備權利要求1所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條的方法，其特征在于，包括下列步驟: 制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上形成有兩條檢測線和一條質控線； 制備金標墊；以及 組裝試紙條， 其中， 用能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合的萊克多巴胺檢測抗原和能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原在所述硝酸纖維素膜上進行線狀點樣分別作為所述兩條檢測線； 用能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合和能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的驢抗小白鼠抗體在所述硝酸纖維素膜上進行線狀點樣作為質控線。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述檢測線和質控線是通過下列步驟獲得的: 將硝酸纖維素膜按20mm 30mm寬的尺寸剪裁；將經純化濃度調整為0.2mg/mL 1.0mg/mL的萊克多巴胺、西馬特羅檢測抗原，在膜上線狀點樣作為檢測線，其中，檢測線點樣位置離膜底邊15mm 18mm,兩條檢測線之間相隔5mm ； 將經純化濃度調整為0.5mg/mL 1.5mg/mL的驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線，質控線點樣位置離膜底邊Ilmm 13mm ； 將所述硝酸纖維素膜于37攝氏度烘干處理過夜后，在室溫干燥的環境下保存。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，金標墊是通過下列步驟獲得的: 分別選用能與萊克多巴胺、西馬特羅檢測抗原結合的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體用膠體金標記； 把所述的用膠體金標記過的萊克多巴胺和西馬特羅單克隆抗體混合后，噴在玻璃纖維膜上。
5.一種采用如權利要求1所述的萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙配膠體金讀取儀定量檢測的方法，其特征在于，包括下列步驟: 配制已知系列濃度的萊克多巴胺、西馬特羅混合標準品并加入所述膠體金讀取儀的樣本孔中， 10分鐘后檢測對應的光密度數值并建 立標準曲線，將含有檢測樣品的試紙條放入所述膠體金讀取儀中，讀取檢測數值，以及通過所述標準曲線計 算所述檢測樣品中萊克多巴胺、西馬特羅含量。
全文摘要
本發明提出了一種萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條及其制備方法，其中萊克多巴胺、西馬特羅二聯膠體金試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述金標墊上是含有膠體金標記的抗萊克多巴胺單克隆抗體和膠體金標記的西馬特羅單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上進一步形成有兩條檢測線和一條質控線，所述檢測線依次由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合的萊克多巴胺檢測抗原線狀點樣和能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原線狀點樣組成，所述質控線由能與抗萊克多巴胺單克隆抗體結合和抗西馬特羅單克隆抗體結合的驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。利用該試紙配合膠體金讀取儀能有效的定量檢測萊克多巴胺、西馬特羅。
文檔編號G01N33/577GK103235125SQ201310121479
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月9日 優先權日2013年4月9日
發明者賴衛華, 彭濤, 楊萬春, 陳媛, 劉文娟 申請人:江西中德生物工程有限公司
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