基于微流控系統的單細胞自動分析方法
【專利摘要】本發明提供一種基于微流控芯片的自動化單細胞分析方法，其特征在于：利用熒光標記的單細胞，受激光激發所發出的熒光信號，以觸發該激光光束在進樣光路和檢測光路雙光路間切換的方法，從而實現一個激光器在激光閥門與檢測光源兩個功能間的自動轉換。激光閥門結合液壓泵或電動泵，控制單細胞傳輸，從而在微流控芯片上實現單細胞由進樣通道向分離通道引入和進樣過程的自動化。激光由進樣光路切換至檢測光路，又可實現自動單細胞計數或胞內組分檢測。
【專利說明】基于微流控系統的單細胞自動分析方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及單細胞自動分析技術，特別是涉及基于微流控系統實現單細胞內組分自動分析及單細胞自動分揀的方法。
【背景技術】
[0002]單細胞分析無論對于疾病的早期診斷和治療還是藥物的設計和副作用控制都具有潛在的重要意義。因此研究高效、簡便的單細胞分析方法和儀器，在臨床實踐中顯得尤為重要。但是，單細胞分析通常包括細胞進樣、衍生、溶膜、分離及檢測等多個步驟，操作較復雜。尤其對單細胞進樣和溶膜等步驟的操作，不論其在毛細管電泳還是在微流控芯片上進行，都需依靠實驗人員借助顯微鏡利用各種細胞操控技術才能完成。微流控芯片的微米級通道網絡結合微泵、微閥等裝置在細胞分析方面具有廣闊的前景。在微流控芯片上研究細胞，如何對細胞進行操縱使其在微通道內任意轉移或停留是首先要解決的問題。人們采取了多種微通道液流控制技術，主要包括液壓、氣壓等機械力控制，電壓、介電電泳力等電控制，以及光學陷阱(或激光鑷子)等，或者上述幾種技術的結合。盡管微芯片以其網絡通道結合微閥、微泵在單細胞操控方面可以獲得比毛細管更大的自由度，但仍存在裝置復雜、手工操作、效率低等問題，不易實現連續和自動檢測，不易被更多實驗人員所掌握。同時也影響了微分析系統在單細胞分析領域的進一步發展。
[0003]經過多年發展，微流控芯片技術已廣泛用于細胞研究，實現了包括細胞篩選、分離、操控，以及單細胞培養、單細胞分析等多種研究，但用于單細胞自動分析的方法和技術還未見專利和相關文獻報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種在微流控芯片上進行單細胞分析的自動化分析方法，該方法包括在一塊微流控芯片上自動實現試樣引入、單細胞進樣、溶膜、組分分離檢測全過程。以克服在微流控芯片上進行單細胞分析存在的速度慢、手工操作、裝置復雜、不易被更多實驗人員所掌握等問題。
[0005]本發明提供的基于雙光路的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征在于:
單細胞進樣和檢測分別由進樣光路和檢測光路完成，即利用熒光標記的單細胞受激光激發所發出的熒光信號觸發該激光光束在進樣光路和檢測光路雙光路間切換的方法，實現單一激光器在激光閥門與激發光源兩個功能間的自動轉換，見圖1;
利用液壓泵、電動泵結合激光閥門控制單細胞傳輸的新技術，由計算機控制高壓電源，在微流控芯片上實現單細胞由進樣通道向分離通道引入和進樣過程的自動化，見圖2，3 ;利用程控電源結合芯片網絡控制單細胞輸送或單細胞的溶膜及組分分離過程的自動
化；
最終實現微流控芯片上單細胞計數或單細胞組分分離檢測全過程的自動化，制成適用于單細胞組分分析的自動化微流控分析系統。[0006]本發明的微流控芯片單細胞的自動分析方法步驟如下:
一個具有進樣光路和檢測光路的雙光路裝置，利用熒光標記的單細胞受激光激發后發出的熒光作為控制信號，使同一激光光源既作為單細胞進樣的光控閥門，又作為被分離組分的激發光源。具體設計方案見圖1，圖中微流控芯片以十字型芯片為例。
[0007]采用懸液稀釋結合電動驅動的細胞分散方法，也可適量添加羥丙基甲基纖維素(HPMC)，使細胞分散且不易沉降和聚集。在十字型微流控芯片通道出口處用環氧樹脂粘合微量移液管頭，作為儲液池。在較短通道即進樣通道兩端安裝儲液池S、SW。在較長通道即分離通道兩端安裝B、BW。在儲液池S中加入按一定比例稀釋的細胞懸液，在儲液池B、SW、BW中加入一定體積的電泳緩沖溶液。在進樣通道(S-SW)施加一組較高電壓，在分離通道(B-BW)施加一組夾流電壓，使細胞成單行間隔一定距離以一定流速成單行通過進樣通道(S-SW)，見圖 2。
[0008]進行單細胞分析之前，首先要將單細胞從進樣通道(S-SW)引入分離通道(B-BW)，即實現單細胞自動進樣，本發明利用進樣光路實現單細胞自動進樣，具體做法是，光源
(101)發出的光束沿OX軸穿過光路轉換盤(102)上的圓孔，經平面反射鏡(103~105)反射至顯微鏡物鏡(106)，在通道交叉點聚焦成直徑10-20 μ m的光斑(圖1)，當被熒光物質標記的某個單個細胞經過激光斑點(圖2)，發出熒光，熒光和激光經聚光透鏡(107)匯聚到達半透半反鏡(108)，在此，激光透過(108)，而熒光被反射至平面反射鏡(109)，然后，熒光被反射至凹面反射鏡(110)，將熒光平行反射至針孔(117)，熒光經過針孔(117)過濾并透過長波通濾光片(118)，最終到達光電倍增管(119)，檢測器將此單細胞信號送至數據處理單元(2)(圖1)，由數據處理單元(2)控制多通道高壓直流電源(4)，改變通道兩端電壓差，使該單細胞運輸方向改變，即由S-SW變為B-BW，從而實現光控閥門作用，完成單細胞進自動進樣(圖3);為避免細胞成團經過影響單細胞進樣，通過編制峰值程序由數據處理單元(2)判斷信號大小，從而剔除過大信號，因此不會對成團細胞進行響應，避免出現多個細胞進入分離通道的情況。
[0009]完成單細胞進樣的同時，數據處理單元(2)控制伺服電機(3)轉動光路轉換盤
(102),改變激光傳輸方向，即將激光切換至檢測光路。光束經平面反射鏡(111，112)反射至顯微鏡物鏡(113)，在分離通道末端聚焦成直徑10-20 μ m的光斑，用作激光誘導熒光檢測。熒光和激光經聚光透鏡(114)匯聚到達半透半反鏡(115)，在此，激光透過半透半反鏡(115)，而熒光被反射至平面反射鏡(116)，之后，熒光被反射至凹面反射鏡(110)，被平行反射至針孔(117)，熒光經過針孔(117)過濾并透過長波通濾光片(118)，最終到達光電倍增管(119)，檢測器將此單 細胞信號送至數據處理單元(2)(圖1)，并輸出結果(圖4)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0010]圖1為本發明微流控自動分析系統的結構圖1:雙光路光學單元101:激光光源102:光路轉換盤
103~105，109，111 ~112，116:平面反射鏡
106、113:顯微鏡物鏡 107、114:聚光透鏡108、115:半透半反鏡
110:凹面反射鏡117:針孔118:長波通濾光片
119:光電倍增管120:樣品臺2:數據處理單元3:伺服電機4:直流高壓電源
圖2為單細胞自動進樣示意圖 圖3為單細胞檢測示意圖
圖4為連續自動采集5個單細胞在進樣點和檢測點熒光信號。
【具體實施方式】
[0011]以下結合實施例和附圖對本發明作進一步說明，但不應以此限制本發明的保護范圍。
[0012]參見圖1，采用一種用于單細胞自動分析的雙光路裝置，此裝置包括雙光路光學單元、數據采集單元、微流控電源、光路控制單元。其中:雙光路光學單元中的光電倍增管(119)的輸出端與數據采集單元中的放大電路(2)連接；數據采集單元中的模數轉換器(3)通過RS232接口與數據處理單元(4)連接；數據處理單元(4)的輸出經RS232接口與直流高壓電源(5)連接；數據處理單元(4)的輸出經RS232接口與光路控制單元的數模轉換器
(6)連接，控制伺服電機(7)驅動光路轉換盤(102)。
[0013]微流控芯片置于樣品臺(120)，開啟儀器，微調樣品臺，激光光斑在微通道內精確聚焦。 [0014]細胞經熒光染料染色，調節細胞懸液濃度至0.5~2X IO5 cells/ml。細胞懸液注入樣品池S，緩沖溶液注入S、SW、BW，調節液面高度，使細胞從S流向SW，參見圖2。當單細胞流經位于通道交叉點的激光光斑，被激發發出熒光。此熒光信號經進樣光路被光電倍增管(119 )采集，經模數轉換送至數據處理單元(2 )。
[0015]數據處理單元(2)接收并處理信號后，同時發出兩個指令。一方面控制伺服電機
(3)轉動光路轉換盤(102)，改變激光傳輸方向，將激光切換至檢測光路，激光光斑聚焦于分離通道末端，用作后續的檢測(細胞計數、胞內組分檢測等)。另一方面控制高壓電源(4)，輸出一組電壓，分離通道+150 V~+1500 V，進樣通道+70 V~+700 V，推動細胞由B流向BW。至此，實現單細胞自動進樣，參見圖3。利用計算機程序判斷因細胞成團引起的過大信號并自動剔除，從而保證單細胞進樣。
[0016]單細胞進入分離通道到達末端檢測點，經過激光光斑發出熒光信號。熒光信號經檢測光路到達光電倍增管(119)，經模數轉換送至數據處理單元(2)并輸出結果。至此，實現單細胞自動檢測，參見圖4。圖4為在通道交叉點以及分離通道末端連續測定的5個單細胞(未溶膜)熒光信號峰，每組峰為同一個細胞的進樣信號(左)和未溶膜情況下在分離通道末端的檢測信號(右)。全部過程由儀器自動完成。從圖4可以看出，同一個細胞在前后兩個位置的信號大小有差異，有兩個原因:一是激光在兩個位置的聚焦有偏差；二是細胞經過分離通道的過程有可能發生緩慢溶膜，造成前后差異。
[0017]本裝置也適用于單細胞組分自動分析。調節高壓電源并在B中加入溶膜試劑，可使單細胞迅速溶膜，從而自動完成單細胞進樣、溶膜、分離、檢測全過程。
【權利要求】
1.一種基于雙光路的微流控芯片自動化單細胞分析方法，包括下列步驟: O細胞懸液加入到樣品池中； 2)單細胞進樣:利用雙光路中的進樣光路將單細胞從進樣通道(S-SW)引入分離通道(B-Bff)； 3)檢測:完成單細胞進樣的同時，數據處理單元(2)控制高壓電源(4)推動細胞由儲液池B流向儲液池BW ;同時，數據處理單元(2)控制伺服電機(3)轉動光路轉換盤(102)，改變激光傳輸方向，即將激光由進樣光路切換至檢測光路；光束經平面反射鏡(111，112)反射至顯微鏡物鏡(113)，在分離通道末端聚焦成直徑10-20 μ m的光斑，用作激光誘導熒光檢測；熒光和激光經聚光透鏡(114)匯聚到達半透半反鏡(115)，在此，激光透過半透半反鏡(115)，而熒光被反射至平面反射鏡(116)，之后，熒光被反射至凹面反射鏡(110)，被平行反射至針孔(117)，熒光經過針孔(117)過濾并透過長波通濾光片(118)，最終到達光電倍增管(I 19)； 4)輸出結果:檢測器將此 單細胞信號送至數據處理單元(2)，并輸出結果。
2.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟I)中，細胞懸液用微量移液器、注射器或微量注射泵加入到樣品池中。
3.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟I)中所述的細胞懸液濃度0.5^2X IO5 cells/ml，加入到微流控芯片上樣品池S中。
4.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟2)中利用液壓泵、電動泵結合進樣光路控制單細胞傳輸方法，在儲液池B、SW、Bff中加入一定體積的電泳緩沖溶液，保持液面高度S>B=BW>SW ;或在進樣通道(S-SW)施加一組較高電壓(+100疒+200 V)，在分離通道(B-BW)施加一組夾流電壓(+50疒+100 V)，使細胞成單行間隔一定距離(0.5^5 mm)以一定流速(0.05~0.5 mm/s)成單行通過進樣通道(S-SW)。
5.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟2)中所述的單細胞自動進樣，具體做法是，光源(101)發出的光束沿OX軸穿過光路轉換盤(102)上的圓孔，經平面反射鏡(103~105)反射至顯微鏡物鏡(106)，在通道交叉點聚焦成直徑10-20 μ m的光斑，當被熒光物質標記的某個單個細胞經過激光斑點，發出熒光，熒光和激光經聚光透鏡(107)匯聚到達半透半反鏡(108)，在此，激光透過(108)，而熒光被反射至平面反射鏡(109)，然后，熒光被反射至凹面反射鏡(110)，將熒光平行反射至針孔(117)，熒光經過針孔(117)過濾并透過長波通濾光片(118)，最終到達光電倍增管(119)，檢測器將此單細胞信號送至數據處理單元(2)，由數據處理單元(2)控制多通道高壓直流電源(4)，改變通道兩端電壓差，使該單細胞運輸方向改變，即由S-SW變為B-BW，完成單細胞進自動進樣。
6.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟2)所述的雙光路包括進樣光路和檢測光路。
7.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟2)所述的進樣光路將激光光斑聚焦于芯片通道交叉點，在此激發經過的細胞并產生熒光。
8.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟2)所述的進樣光路產生的熒光信號由所述的數據處理單元(2)處理。
9.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟3)所述的數據處理單元控制伺服電機(3)轉動光路轉換盤(102)，改變激光傳輸方向，將激光切換至檢測光路。
10.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟3)所述的數據處理單元(2)控制高壓電源(4)輸出一組電壓，分離通道+150 V~+1500 V，進樣通道+70 V~+700 V，推動細胞由B流向BW。
11.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟3)所述的檢測光路將激光光斑聚焦于芯片分離通道末端，在此激發經過的細胞或細胞組分并產生熒光。
12.根據權利要求1所述的微流控芯片自動化單細胞分析方法，其特征是，步驟4)所述的檢測光路產生的熒光信號由所述的數據處理單元(2)處理并輸出結果。
【文檔編號】G01N15/14GK103926190SQ201410192110
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月8日 優先權日:2014年5月8日
【發明者】劉彧, 班青, 高健 申請人:齊魯工業大學
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