一種高爾基體蛋白73(gp73)抗原硅基磁珠結合物的制備及應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種GP73抗原硅基磁珠結合物，并以此結合物作為組份之一，搭配其他組份組成了一種競爭法GP73定量檢測試劑盒。本發明的試劑盒由高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結合物工作液、高爾基體蛋白73(GP73)校準品、堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液、清洗液和化學發光底物組成。同時本發明提供了上述GP73抗原硅基磁珠結合物的制備方法以及試劑盒各組份的制備方法，包括GP73抗原硅基磁珠結合物工作液的配制、酶標記抗體、校準品配制、清洗液、發光底物配制等步驟。本發明的試劑盒主要可應用于原發性肝癌的診斷，具有靈敏度高、線性范圍寬、無hook效應、成本低檢驗耗時短等優點。
【專利說明】一種高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結合物的制備及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及免疫分析醫學領域，具體地，本發明提供了一種穩定性高的高爾基體蛋白73 (Golgi Protein-73,以下簡寫為GP73)抗原硅基磁珠結合物的制備方法及其在免疫診斷試劑盒中的應用。
【背景技術】
[0002]肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常見的惡性腫瘤之一，由于其發病隱匿，臨床上約有2/3的HCC患者初診時已屬中晚期。據統計，肝癌在世界范圍內發病人數超過50萬，該人數在逐年增加，其中中國肝癌人數將約占去其中的50%，在惡性腫瘤死亡順位中占第二位。醫學研究表明，如若早期發現肝癌并且及時治療大概可以提高患者的5年存活率，因此肝癌的早期發現具有重要的臨床意義。
[0003]原發性肝細胞癌通常發生于有慢性病毒性肝炎、肝硬化基礎的人群，能夠及時的跟蹤監測隨訪這部分人群，對提高肝癌的早期診斷率有著重要的意義。目前，對于HCC常用的檢測手段包括肝超聲影像分析和血清學標志物檢測，其中最常使用的血清學標志物是甲胎蛋白(AFP)，但是AFP在早期肝癌診斷中靈敏度不高，只有50 %?60 %的肝癌患者AFP呈陽性，并且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋白的升高。因此，臨床需要一種更理想的血清標志物。
[0004]近年來，隨著基因組學、蛋白質組學、腫瘤免疫等相關研究的飛速發展，與肝癌相關的新的腫瘤標志物相繼出現，其中高爾基體糖蛋白73(GP73)是最值得期待的血清標志物之一。
[0005]高爾基體糖蛋白73(GP73)又稱II型高爾基體跨膜蛋白(Golgiphosphoprotein2, G0LPH2)和GOLMl，因其在SDS-PAGE中顯示相對分子質量為?.3xl04，所以稱為GPTSt5Kladney等證明GP73主要表達于上皮細胞，在正常肝臟，GP73主要在膽管上皮細胞中表達，而在干細胞則很少表達甚至不表達，但是其在各種急、慢性肝炎及肝硬化患者中GP73水平明顯上調。2004年Iftikhar等研究發現GP73在急性肝炎(包括病毒性和自身免疫性)和進行性肝硬化患者(慢性丙型肝炎和酒精性肝病)中表達明顯增高(IftikharR, Kladney RD, Havl1glu N, et al.Disease and cell specific express1n of GP73inhuman liver disease [J].Am J Gastroenterol2004,99(6):1087-1095)。
[0006]2005年，Block等研究發現，原發性肝癌患者血清中的GP73含量明顯升高(BlockTM, et al.Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(3):779-784.)，同年，Marrero 等通過臨床血清標本分析測定，發現GP73用于診斷肝癌的靈敏度和特異性均超過70%，診斷早期肝癌的靈敏度為AFP的2.55倍，在AFP < 20ng/L的肝癌患者中，超過一半的人群GP73明顯升高(Marrero JA, et al.J Hepatol, 2005,43 (6):1007-1012)。因此，對 AFP 陰性的肝癌患者，GP73的應用能夠明顯提高肝癌的檢出率。
[0007]GP73的臨床檢驗技術有不少文章和專利。在期刊文章方面所涉及到的GP73檢測方法有很多，排除掉操作方面復雜、成本高、文章較少的免疫印跡法、配套預裝離心柱的酶標試劑盒法及抗體芯片法后，目前絕大多數文獻中的檢測方法是雙抗夾心酶聯免疫法。專利方面的情況與期刊文章類似，其中CN200810172605《抗高爾基體蛋白單克隆抗體及應用》和CN200810181016《一種抗GP73蛋白的單克隆抗體、其制備方法和應用》等的技術重點是抗GP73單克隆抗體的制備及所制備的單克隆抗體的應用，其中涉及到的檢測試劑盒一般均采用微孔板包被抗體，另一抗體標記辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，使用夾心法測定GP73含量，均屬于比較傳統的微孔板酶聯免疫檢測技術。在臨床檢驗方面，微孔板酶聯免疫檢測技術已逐步被更完善的技術取代，例如顯色底物被靈敏度更高的發光底物所取代，做為固相載體的微孔板被反應面積更大的免疫磁珠所取代等。在磁珠方面需要說明的是，在酶聯免疫檢測技術中所用的磁珠以羥基或羧基磁珠為主，偶有使用氨基磁珠，表面其他活性基團的磁珠未見在酶聯免疫檢測中使用，硅基磁珠由于對核酸有吸附力，所以在臨床上主要用于核酸的檢測，沒有用于蛋白質檢測的文獻。在GP73酶聯免疫檢測方面，引入免疫磁珠的文獻很少，在專利CN103499692A中，提出了一種GP73板式磁顆?；瘜W發光免疫分析方法，引入了磁顆粒，不過從其具體專利內容來看，磁顆粒上的活性基團沒有明確的說明，從交聯方法來看，磁珠應該是羥基或羧基磁珠，其交聯方式是羥基或羧基磁珠的簡易交聯方法，其效果不會很理想，從最終試劑盒的介紹來看，性能很一般。
[0008]綜上所述，目前GP73的主流酶聯免疫法，主要有以下不足:一、靈敏度一般均較低，線性范圍窄，受到微孔板的面積限制，微孔板作為載體可包被的抗體有限，反應面積小，較顯著地限制了試劑的線性范圍，要么試劑靈敏度低，要么試劑盒的線性上限低，不能有效滿足臨床的應用；個別文獻采用了磁珠作為固相載體，但對磁顆粒沒有明確說明，交聯方法也屬于簡易方法，不能發揮出磁珠的優勢，從最終試劑盒的介紹來看，仍存在靈敏度低和線性范圍窄的問題；二、所用連接方法采用雙抗夾心反應原理，存有Hook效應問題，進一步限制了線性范圍；三、反應體系中存在兩種抗體及GP73抗原，成本較高；四、反應試劑組分一般較多或者反應模式較為復雜，導致反應步驟繁瑣、反應時間長。
【發明內容】
[0009]本發明所需要解決的技術問題是:彌補現有GP73檢測技術的不足，建立一種GP73和硅基磁珠連接的新型方法，制備出非特異性極低、穩定性高的GP73硅基磁珠連接物，并以此連接物作為組份之一，搭配其他組份組成了一種競爭法GP73定量檢測試劑盒，具有靈敏度高、線性范圍寬、無hook效應、成本低檢驗耗時短等優點。
[0010]本發明的技術問題，通過以下的技術方案解決:
[0011]1.一種GP73抗原硅基磁珠結合物的制備方法，優選的，包括以下幾個步驟:
[0012]I)稱取一定量的娃基磁珠,將娃基磁珠溶于其質量(單位:毫克)數一半毫升數的70%乙醇中，加入硅基磁珠質量(單位:毫克)數0.5%毫升數的氨水、加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其終濃度為15% (V/V)，室溫攪拌反應17?18小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定量氨基的硅基磁珠；
[0013]2)將上一步得到的表面修飾有氨基的硅基磁珠溶于其質量(單位:毫克)數一半毫升數的pH = 8.0±0.05的50mM Tris緩沖液中，加入戊二醛使其濃度為5% (V/V)，室溫震蕩反應I小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定fe基的娃基磁珠；
[0014]3)將上一步得到的表面修飾有一定醛基的硅基磁珠用pH = 7.8±0.05的50mMPBS緩沖液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后待用；
[0015]4)按每400mg硅基磁珠對應Img高爾基體蛋白73 (GP73)全長抗原的比例，稱取所需量的GP73全長抗原，溶解于pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液制備出濃度為35 μ g/ml的高爾基體蛋白73(GP73)全長抗原溶液，待用；
[0016]5)將步驟3)得到的全部表面修飾有醛基的硅基磁珠加入步驟4)的GP73全長抗原溶液中，室溫震蕩混勻3小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，繼續用pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗至上清0D280 < 0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結合物。
[0017]6)將上一步得到的GP73抗原硅基磁珠結合物加入一定量的保存緩沖液(pH =7.8±0.05，100mMTris,0.85% NaCl，0.5% BSA，0.1% Proclin300)得到 GP73 抗原硅基磁珠結合物濃溶液，用于日常保存。
[0018]上述方法中所述的GP73抗原硅基磁珠結合物濃溶液，可采用以下方式測定濃度:將濃溶液混勻，取一定體積的濃溶液，用磁板沉淀磁珠結合物，去除上清后，對磁珠結合物進行干燥后稱重，用磁珠結合物的重量除以所取濃溶液體積，得到GP73抗原硅基磁珠結合物濃溶液的磁珠結合物濃度。
[0019]上述方法中所述的GP73抗原，優選的，是帶His標簽的高爾基體蛋白73 (GP73)全長抗原。
[0020]上述方法中所述的硅基磁珠，是四氧化三鐵經過二氧化硅包裹形成的硅基殼層的磁微粒，可以從外部購買，也可以自制，優選的，自制硅基磁珠的制備方法包含如下步驟:
[0021]I)將含Fe3+和Fe2+試劑按2.5:1的摩爾比溶于水中形成混合液，其中Fe3+在混合液中可接受的摩爾濃度范圍為0.03?0.3mol/L，在55°C氮氣保護狀態下攪拌反應2小時，攪拌轉速為400?650rpm，并通過濃NaOH溶液調節混合液pH值為堿性，反應得到磁性四氧化三鐵微粒，即磁微粒。
[0022]2)將上一步中制備得到的磁性四氧化三鐵顆粒,利用純化水清洗至中性,之后加入其質量(單位:毫克)數一半毫升數的90%乙醇，繼續加入磁微粒質量0.5%毫升數的氨水，在30°C下攪拌，1kHZ超聲30分鐘后緩慢加入90%乙醇體積0.5%體積的正硅酸乙酯(TEOS)，反應持續15-16小時，結束后之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次即得到二氧化硅包裹四氧化三鐵的磁性顆粒，即自制硅基磁珠。
[0023]在自制娃基磁珠制備過程中，取磁微粒和自制娃基磁珠進行電鏡粒徑測試，計算二氧化硅殼層厚度，優選的，磁微粒直徑在I?3.5 μ m，二氧化硅殼層厚度為15?20nm。
[0024]2.一種競爭法酶促化學發光高爾基體蛋白73(GP73)定量檢測試劑盒，其組份包括:
[0025]I)高爾基體蛋白73(GP73)校準品；
[0026]2)堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液；
[0027]3)高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結合物工作液；
[0028]4)清洗液；
[0029]5)化學發光底物。
[0030]優選的，高爾基體蛋白73 (GP73)抗原硅基磁珠結合物工作液的配制方法為:使用上述步驟制備而成的GP73抗原硅基磁珠結合物濃溶液加入保存緩沖液(pH = 7.8±0.05，10mM Tris,0.85% NaCl,0.5% BSA,0.1 % Proclin300)配制成一定濃度得到的，工作液中磁珠結合物可接受的濃度范圍為0.5?2mg/ml。
[0031]優選的，競爭法GP73定量檢測試劑盒GP73校準品的制備過程包括如下步驟:
[0032]I)校準品緩沖液制備:準確稱取Tris堿0.6g,NaC10.85g,海藻糖3g,Proclin300
0.lg，添加80g純化水混勻后，用高濃度鹽酸或氫氧化鈉調整pH = 7.8±0.05，添加BSA6g，混勻后定重至100g，繼續混勻30分鐘后0.22 μ m過濾。
[0033]2)校準品的配制:在上述緩沖液中加入GP73抗原配制而成。
[0034]優選的，堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液的制備包括以下步驟:
[0035]I)稱取 3mg2IT，用含有 50mM Tris,0.1M NaCl 和 0.005M EDTA, pH = 8.5±0.05水溶液溶解至10mg/ml ;準確量取GP73單克隆抗體0.5mg，通過濃縮或定容的方式使溶液中抗體濃度為3.5mg/ml，溶劑使用上述2IT溶液的溶劑，置于反應試管底部；在含有3.5mg/mlGP73單克隆抗體溶液的試管中加入其體積1/20比例的2IT溶液進行活化?；靹?，在室溫下反應20分鐘，結束后利用分子篩層析方式去除溶液中的過量的2IT，得到活化的抗體；
[0036]2)準確量取堿性磷酸酶0.4mg,置于反應試管底部；稱取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mg/ml ;在含有堿性磷酸酶的試管中加入其體積1/20的SMCC溶液，混勻后，室溫下反應15分鐘，結束后利用分子篩層析去除溶液中的過量的SMCC，得到活化的堿性磷酸酶；
[0037]3)將以上步驟中活化的抗體和活化的堿性磷酸酶按質量比1: 0.8混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液,混勻后在2?8°C環境下反應24小時。反應結束后，用分子篩層析的方法純化得到最終抗體-酶連接物；
[0038]4)工作液緩沖液制備:準確稱取 Tris 堿 0.6g，NaCl0.85g，Proclin300 0.lg，添加80g純化水15分鐘混勻后用高濃度鹽酸或氫氧化鈉溶液調整pH = 7.2±0.05，繼續加入IM MgCl20.35ml, 0.1M ZnCl20.05ml, BSA0.5g，純水定重至 100g，30 分鐘混勻后 0.22 μ m 過濾，即得到工作液緩沖液；
[0039]5)將以上步驟中得到的抗體-酶連接物，利用工作液緩沖液稀釋至抗體-酶連接物濃度為3.0μ g/ml，即得到堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液。
[0040]優選的，清洗液的配制方法如下:
[0041]稱取Trisl211.4mg, NaC19g,吐溫-20 lg,加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用高濃度鹽酸溶液或高濃度氫氧化鈉溶液調整溶液PH值到8.0±0.5，補加純化水定容至1000ml，混勻30分鐘，過濾后待用。
[0042]優選的，化學發光底物的配制包括以下步驟:
[0043]準確稱取AMPH) (3-(2-螺旋金剛烷)_4_甲氧基_4_(3_磷氧酰)-苯基_1，2_ 二氧環乙烷二鈉鹽)或APS-51g，Tris24g，氯化鈉(NaCl) 160g，CTAC0.0255g，加入純化水約900ml，混勻15分鐘，用高濃鹽酸溶液或高濃氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到9.7±0.05，之后補加純化水定容至1000ml，混勻待用。本化學發光底物為針對堿性磷酸酶的化學發光底物，需要在2-8 °C條件下避光保存，用時緩慢混勻。
[0044]本GP73-硅基磁珠結合物及相應試劑盒的創新性和突出技術優勢具體在于:
[0045]I)將硅基磁珠引入到了酶聯免疫檢測技術中并通過創新的方法對硅基磁珠的表面進行了一定的氨基化和醛基化，既保留了硅基磁珠對蛋白質有一定物理吸附力的特性，又使硅基磁珠表面具備了與蛋白質進行化學鍵結合的能力；利用了 GP73抗原對二氧化硅較強的物理吸附特性，GP73抗原首先與磁珠表面吸附，之后GP73抗原與磁珠表面的氨基及醛基的化學鍵連接由于距離近而完成得更充分；最終的結合物同時有化學鍵和物理吸附力兩種作用力，穩定性很好，同時由于磁珠的上述特性，GP73抗原在磁珠表面的封閉效果很好，磁珠結合物的非特異性極低；此GP73-硅基磁珠結合物被配制成工作液加入到GP73檢測試劑盒中，使試劑盒具備更高的靈敏度和線性范圍，同時有效期更長。
[0046]2)試劑盒的反應模式是競爭法，無hook效應問題，明顯拓展了檢測試劑盒的線性范圍；
[0047]3)試劑盒的反應體系均一，能夠極大提高抗原抗體的結合速率，樣本測定耗時短。
【具體實施方式】
[0048]實施例1自制硅基磁珠的制備
[0049]l)Fe3+在混合液中摩爾濃度為0.3mol/L的制備磁微粒1:準確稱取FeCl3.6H2040.54g和FeCl2.4H2011.93g溶于500ml純化水中，在55°C氮氣保護狀態下攪拌反應2小時，攪拌轉速為400?650rpm，并通過濃NaOH溶液調節混合液pH為堿性，反應得到磁性四氧化三鐵微粒，即磁微粒,稱為磁微粒I。結束后用純化水清洗磁微粒至中性。將磁微粒浸泡于一定純化水中混勻，取出一些磁微粒溶液利用烘干法(即取一定體積磁微粒溶液烘干稱量干燥后的磁微粒質量，除以原體積)，測定四氧化三鐵濃度。
[0050]2) Fe3+在混合液中摩爾濃度為0.03mol/L的制備磁微粒2:準確稱取FeCl3.6H204.054g和FeCl2.4H201.193g溶于500ml純化水中，在55°C氮氣保護狀態下攪拌反應2小時，攪拌轉速為400?650rpm，并通過濃NaOH溶液調節混合液pH為堿性，反應得到磁性四氧化三鐵微粒，即磁微粒,稱為磁微粒2。結束后用純化水清洗磁微粒至中性。將磁微粒浸泡于一定純化水中混勻，取出一些磁微粒溶液利用烘干法(即取一定體積磁微粒溶液烘干稱量干燥后的磁微粒質量，除以原體積)，測定四氧化三鐵濃度。
[0051]3)準確量取步驟I)得到磁微粒I 200mg，磁分離去除其中的水分，添加90%乙醇100ml、氨水1ml，在30°C下機械攪拌1kHZ超聲30分鐘后緩慢加入0.5ml的TE0S，反應持續15-16小時，結束后用純化水清洗5次即得到二氧化硅包裹四氧化三鐵的磁性顆粒，命名為硅基磁珠I。
[0052]4)準備量取步驟2)得到磁微粒2200mg，磁分離去除其中的水分，添加90%乙醇100ml、氨水1ml，在30°C下機械攪拌1kHZ超聲30分鐘后緩慢加入0.5ml的TE0S，反應持續15-16小時，結束后用純化水清洗5次即得到二氧化硅包裹四氧化三鐵的磁性顆粒，命名為硅基磁珠2。
[0053]5)利用電鏡檢測確定磁微粒1、磁微粒2、硅基磁珠I和硅基磁珠2的粒徑并計算，磁微粒粒徑在I μ m-3.5 μ m,硅基磁珠的二氧化硅殼層厚度在15_20nm。
[0054]實施例2 GP73抗原硅基磁珠結合物的制備
[0055]I)準確量取硅基磁珠200mg，溶于100ml70%乙醇中，加入Iml的氨水、加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其終濃度為15% (V/V)，室溫機械攪拌反應17?18小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，即得到表面修飾有一定量氨基的磁微粒。
[0056]2)將步驟I)得到的修飾有氨基的磁微粒溶于100ml pH = 8.0±0.05的50mMTris緩沖液中，加入戊二醛使其濃度為5% (V/V)，室溫震蕩反應I小時，結束后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定醛基的硅基磁珠。
[0057]3)將步驟2)得到的修飾有醛基的硅基磁珠用pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后，待用；
[0058]4)稱取0.5mg帶His標簽的GP73全長抗原，溶解于14.28ml pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液中，制備出14.28ml濃度為35 μ g/ml的GP73全長抗原溶液，待用；
[0059]5)將步驟3)得到的修飾有醛基的硅基磁珠加入步驟4)的14.28ml GP73全長抗原溶液中，室溫震蕩混勻3小時，繼續用pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗至上清OD< 0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結合物。
[0060]6)將步驟5)得到的GP73抗原硅基磁珠結合物加入一定量的保存緩沖液(pH =7.8±0.05，100mMTris,0.85% NaCl,0.5% BSA，0.1% Proclin300)得到 GP73 抗原硅基磁珠結合物濃溶液，用于日常保存；
[0061]7)將濃溶液混勻，取一定體積的濃溶液，用磁板沉淀磁珠結合物，去除上清后，對磁珠結合物進行干燥后稱重，用磁珠結合物的重量除以所取體積，得到GP73抗原硅基磁珠結合物濃溶液的磁珠結合物濃度；
[0062]8)工作液的配制:參照步驟7)得到的GP73抗原硅基磁珠結合物濃溶液的濃度，用保存緩沖液(pH = 7.8±0.05，10mM Tris,0.85% NaCl，0.5% BSA，0.1% Proclin300)稀釋GP73抗原硅基磁珠結合物濃溶液，得到所需濃度的GP73抗原硅基磁珠結合物的工作液。
[0063]米用娃基磁珠1、娃基磁珠2及外購于河南惠爾納米科技有限公司的娃基磁珠(簡稱為硅基磁珠3)，按上述步驟分別制備出GP73抗原硅基磁珠結合物的工作液1-1 (濃度為
0.5mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液1_1)、GP73抗原硅基磁珠結合物的工作液1_2 (濃度為2mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液1_2)、GP73抗原硅基磁珠結合物的工作液2_1 (濃度為0.5mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液2_1)、GP73抗原硅基磁珠結合物的工作液2_2 (濃度為2mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液2_2)、GP73抗原硅基磁珠結合物的工作液3_1 (濃度為0.5mg/ml,簡稱GP73硅基磁珠工作液3_1)和GP73抗原硅基磁珠結合物的工作液3-2 (濃度為2mg/ml，簡稱GP73硅基磁珠工作液3-2)。
[0064]實施例3 堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73 (GP73)單克隆抗體工作液以及其余試劑組份的制備
[0065]1、堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液的制備
[0066]I)稱取 3mg2IT，用含有 50mM Tris,0.1M NaCl 和 0.005M EDTA, pH = 8.5±0.05水溶液溶解至10mg/ml ;準確量取GP73單克隆抗體0.5mg，通過濃縮或定容的方式使溶液中抗體濃度為3.5mg/ml，溶劑使用上述2IT溶液的溶劑，置于反應試管底部；在含有3.5mg/mlGP73單克隆抗體溶液的試管中加入其體積1/20比例的2IT溶液進行活化?；靹?，在室溫下反應20分鐘，結束后利用分子篩層析方式去除溶液中的過量的2IT，得到活化的抗體；
[0067]2)準確量取堿性磷酸酶0.4mg,置于反應試管底部；稱取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mg/ml ;在含有堿性磷酸酶的試管中加入其體積1/20的SMCC溶液，混勻后，室溫下反應15分鐘，結束后利用分子篩層析去除溶液中的過量的SMCC，得到活化的堿性磷酸酶；
[0068]3)將步驟I)得到的活化抗體和步驟2)得到的活化堿性磷酸酶按質量比1: 0.8混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液,混勻后在2?8°C環境下反應24小時。反應結束后,用分子篩層析的方法純化得到最終抗體酶連接物；
[0069]4)工作液緩沖液的配制:準確稱取 Tris 堿 0.6g, NaCl0.85g, Proclin300 0.lg,添加80g純化水15分鐘混勻后用高濃鹽酸或氫氧化鈉調整pH = 7.2±0.05，繼續加入IMMgCl20.35ml, 0.1M ZnCl20.05ml, BSA0.5g，純水定重至 100g，30 分鐘混勻后 0.22 μ m 過濾，即得到工作液緩沖液；
[0070]5)將步驟3)得到的抗體酶連接物，利用步驟4)得到的試劑緩沖液稀釋至
3.0 μ g/ml,即得到堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液，簡稱GP73酶標抗體工作液。
[0071]2、化學發光底物的配制包括以下步驟:
[0072]I)準確稱取AMPPDlg，Tris24g，NaC1160g，十六烷基三甲基氯化銨0.0255g，加入純化水約900ml，混勻15分鐘，用高濃鹽酸溶液或高濃氫氧化鈉溶液調整溶液pH值到
9.7±0.05，之后補加純化水定容至1000ml，混勻待用。此發光底物在2_8°C條件下避光保存，使用前輕輕震蕩混勻，得到化學發光底物I。
[0073]2)按照以上步驟，除了將AMPH)替換成等量的APS-5外，底物中其他成份的量和配制方法一致，配制得到化學發光底物2。
[0074]3、高爾基體蛋白73(GP73)校準品
[0075]校準品緩沖液制備:準確稱取Tris堿0.6g, NaCl0.85g,海藻糖3g, Proclin300
0.1g,添加80g純化水混勻后，用高濃鹽酸調整pH = 7.8±0.05，添加BSA6g，混勻后定重至10g,繼續混勻30分鐘后0.22 μ m過濾。用校準品緩沖液將帶His標簽的GP73全長抗原分別配制成0，10，50，150，500，2000ng/ml，5個濃度點，共6瓶待用。
[0076]4、清洗液的配制
[0077]依次向容器內加入Trisl211.4mg，NaC19g，吐溫-20 lg，加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用高濃鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調pH至8.0±0.5，補加純水定容至1000ml，混勻30分鐘，0.22 μ m過濾即得到清洗液。
[0078]實施例4酶促化學發光GP73定量檢測試劑盒的組合
[0079]將實施例2制備的各GP73抗原硅基磁珠結合物工作液分別與實施例3中所制備的試劑盒其余組分，配套組合為試劑盒。詳細組合見下表:
[0080]
【權利要求】
1.一種高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結合物及其制備方法，其特征在于此結合物通過硅基磁珠和高爾基體蛋白73(GP73)全長抗原制備而成，其制備包括以下步驟: 1)稱取一定量的娃基磁珠，將娃基磁珠溶于其質量(單位:毫克)數一半毫升數的70%乙醇中，加入硅基磁珠質量(單位:毫克)數0.5%毫升數的氨水、加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其終濃度為15% (V/V)，室溫攪拌反應17?18小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定量氨基的硅基磁珠； 2)將上一步得到的表面修飾有氨基的硅基磁珠溶于其質量(單位:毫克)數一半毫升數的pH = 8.0±0.05的50mM Tris緩沖液中，加入戊二醛使其濃度為5% (V/V)，室溫震蕩反應I小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次，得到表面修飾有一定醛基的娃基磁珠； 3)將上一步得到的表面修飾有一定醛基的硅基磁珠用pH= 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后待用； 4)按每400mg硅基磁珠對應Img高爾基體蛋白73(GP73)全長抗原的比例，稱取所需量的GP73全長抗原，溶解于pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液制備出濃度為35 μ g/ml的高爾基體蛋白73(GP73)全長抗原溶液，待用； 5)將步驟3)得到的全部表面修飾有醛基的硅基磁珠加入步驟4)的GP73全長抗原溶液中，室溫震蕩混勻3小時，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，繼續用pH = 7.8±0.05的50mM PBS緩沖液清洗至上清0D280 < 0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結合物。 6)將上一步得到的GP73抗原硅基磁珠結合物加入一定量的保存緩沖液(pH=7.8±0.05，100mMTris,0.85% NaCl，0.5% BSA，0.1% Proclin300)得到 GP73 抗原硅基磁珠結合物濃溶液，用于日常保存。
2.根據權利要求1所述的高爾基體蛋白73(GP73)抗原，其特征在于:所述高爾基體蛋白73(GP73)抗原為帶His標簽的高爾基體蛋白73 (GP73)全長抗原。
3.根據權利要求1所述的硅基磁珠，其特征在于:所述的硅基磁珠是四氧化三鐵經過二氧化硅包裹形成的硅基殼層的磁微粒，可以通過外部購買或自制得到。
4.根據權利要求3所述的自制硅基磁珠，其特征在于，其具體制備方法如下: 1)將含Fe3+和Fe2+試劑按2.5:1的摩爾比溶于水中形成混合液，其中Fe3+在混合液中可接受的摩爾濃度范圍為0.03?0.3mol/L，在55°C氮氣保護狀態下攪拌反應2小時，攪拌轉速為400?650rpm，并通過濃NaOH溶液調節混合液pH為堿性，反應得到磁性四氧化三鐵微粒，即磁微粒。 2)將上一步中制備得到的磁性四氧化三鐵顆粒，利用純化水清洗至中性，之后加入其質量(單位:毫克)數一半毫升數的90%乙醇，繼續加入磁微粒質量(單位:毫克)0.5%毫升數的氨水，在30°C下攪拌，1kHZ超聲30分鐘后緩慢加入90%乙醇體積0.5%體積的正硅酸乙酯(TEOS)反應持續15-16小時，結束后之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用純化水清洗5次得到二氧化硅包裹四氧化三鐵的磁性顆粒，即硅基磁珠。
5.根據權利要求4所述的Fe3+和Fe2+試劑，其特征在于，Fe3+試劑是六水氯化鐵、Fe2+試劑是四水氯化亞鐵。
6.根據權利要求3或4所述的磁微粒，其特征在于，磁微粒直徑在1-3.5 μ m。
7.根據權利要求1或3或4所述的硅基磁珠，其特征在于，二氧化硅殼層厚度為15_20nmo
8.一種酶促化學發光高爾基體蛋白73 (GP73)定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 1)高爾基體蛋白73(GP73)校準品； 2)堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液； 3)高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結合物工作液； 4)清洗液； 5)化學發光底物。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的高爾基體蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠結合物工作液是用權利要求1中所述的GP73抗原硅基磁珠結合物濃溶液加入適量的保存緩沖液(pH = 7.8±0.05，10mM Tris,0.85% NaCl,0.5% BSA,0.1% Proclin300)配制成一定濃度得到的，工作液中磁珠結合物可接受的濃度范圍為0.5?2mg/ml。
10.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述清洗液的配制包括以下步驟: 稱取Trisl211.4mg, NaC19g,吐溫-20 lg，加入純化水約900ml，混勻至各試劑溶解，用高濃度鹽酸溶液或高濃度氫氧化鈉溶液調整溶液PH值到8.0±0.5，補加純化水定容至100ml，混勻30分鐘，過濾后待用。
11.根據權利8要求所述的化學發光底物的配制包括以下步驟:準確稱取AMPPD (3- (2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧酰)-苯基-1，2- 二氧環乙烷二鈉鹽)或APS-5 lg，Tris24g，氯化鈉(NaCl) 160g, CTAC 0.0255g，加入純化水約 900ml，混勻 15 分鐘，用高濃鹽酸溶液或高濃氫氧化鈉溶液調整溶液PH值到9.7±0.05，之后補加純化水定容至1000ml，混勻待用。
12.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述的GP73校準品的制備過程包括如下步驟: 1)校準品緩沖液制備:準確稱取Tris堿0.6g, NaCl0.85g,海藻糖3g, Proclin300.0.1g,添加80g純化水混勻后，用高濃度鹽酸或氫氧化鈉調整pH = 7.8±0.05，添加BSA6g，混勻后定重至100g，繼續混勻30分鐘后0.22 μ m過濾。 2)校準品的配制:在上述緩沖液中加入GP73抗原配制而成。
13.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白.73 (GP73)單克隆抗體工作液的制備包括以下步驟:
1)稱取3mg2IT，用含有 50mM Tris, 0.1M NaCl 和 0.005M EDTA，pH = 8.5±0.05 水溶液溶解至10mg/ml ;準確量取GP73單克隆抗體0.5mg，通過濃縮或定容的方式使溶液中抗體濃度為3.5mg/ml，溶劑使用上述2IT溶液的溶劑，置于反應試管底部；在含有3.5mg/ml GP73單克隆抗體溶液的試管中加入其體積1/20比例的2IT溶液進行活化?；靹?，在室溫下反應20分鐘，結束后利用分子篩層析方式去除溶液中的過量的2IT，得到活化的抗體； 2)準確量取堿性磷酸酶0.4mg，置于反應試管底部；稱取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mg/ml ;在含有堿性磷酸酶的試管中加入其體積1/20的SMCC溶液，混勻后，室溫下反應15分鐘，結束后利用分子篩層析去除溶液中的過量的SMCC，得到活化的堿性磷酸酶； 3)將以上步驟中活化的抗體和活化的堿性磷酸酶按質量比1: 0.8混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液，混勻后在2?8°C環境下反應24小時。反應結束后，用分子篩層析的方法純化得到最終抗體-酶連接物； 4)工作液緩沖液制備:準確稱取Tris堿0.6g，NaCl0.85g,Proclin300 0.lg，添加80g純化水15分鐘混勻后用高濃度鹽酸或氫氧化鈉溶液調整pH = 7.2±0.05，繼續加入IMMgCl20.35ml, 0.1M ZnCl20.05ml, BSA0.5g，純水定重至 100g，30 分鐘混勻后 0.22 μ m 過濾，即得到工作液緩沖液； 5)將以上步驟中得到的抗體-酶連接物，利用工作液緩沖液稀釋至抗體-酶連接物濃度為3.0μ g/ml，即得到堿性磷酸酶標記抗高爾基體蛋白73(GP73)單克隆抗體工作液。
【文檔編號】G01N33/68GK104198721SQ201410360560
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年7月28日 優先權日:2014年7月28日
【發明者】霍萌萌, 劉向祎, 魯辛辛, 路晟 申請人:北京潤諾思醫療科技有限公司, 首都醫科大學附屬北京同仁醫院, 劉向祎
專業數控銑床產品供應商
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