一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法
【專利摘要】本發明公開了奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，包括待測樣品制備、凈化、檢測和回收率實驗；在嬰幼兒奶粉中加入甲醇/水溶液，并經微波萃取得到待檢液，并將其離心后經固相萃取，依次經水和甲醇/水溶液淋洗和洗脫溶劑洗脫得到洗脫液，將洗脫液蒸發濃縮后用甲醇溶劑稀釋過濾得到待測樣品溶液；配置階梯濃度的標準工作溶液，將待測樣品溶液和標準工作溶液在氣相色譜-串聯質譜儀(GC-MS/MS)上分別進樣，獲得工作曲線和質譜圖，通過工作曲線和質譜圖定性定量分析；然后稱取4種香料含量確定的嬰幼兒奶粉，依次經上述實驗步驟測得4種香料濃度，將測定值與確定值計算得到回收率為83.6～107.8%。本發明具有提取效率高、準確定性定量測定、靈敏度高、結果準確的優點。
【專利說明】—種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于食品檢測領域，涉及微波萃取-固相萃取-氣相色譜-串聯質譜法(GC-MS/MS)，具體是指一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，尤其適用于嬰幼兒奶粉。【背景技術】
香料包括香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素是常用的日用化學品香料，也是重要的食品添加劑，廣泛用作巧克力、冰淇淋、糕點的增香劑。但是，大劑量使用香蘭素等香料將有害健康。近年來由于嬰幼兒配方奶粉的質量優劣而頻繁引發食品安全事件。因此，建立準確、可靠地測定嬰幼兒配方奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的含量非常重要。
[0002]嬰幼兒配方奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素殘留成分的檢測方法主要包括從嬰幼兒配方奶粉中提取殘留的香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素制成檢樣，以及對該檢樣進行測試分析兩個步驟，其中檢樣制備至關重要，直接影響后續測試分析結果的準確性。分析方法可分為定性分析、定量分析和定性定量分析技術。定量分析一般采用色譜技術和色譜質譜聯用技術，色譜技術有氣相色譜和液相色譜等方法，色譜質譜聯用技術有液相色譜-質譜聯用和氣相色譜-質譜聯用等方法；定性定量分析則要兼具兩種技術為一體，檢測結果要同時提供目標物的結構信息和數量信息，根據歐盟委員會非強制執行法案2002/657/EC的規定，對禁用藥物進行確證檢測的方法必須能提供結構方面的信息，且要達到該法案規定的4個確證點。
[0003]目前，由于無相關標準可循，有關嬰幼兒配方奶粉中香料或其他物質中的香料檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯質譜法、毛細管電泳法，但目前還沒有同時檢測嬰幼兒配方奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的微波萃取-固相萃取-氣相色譜-串聯質譜法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，該方法結合微波萃取-固相萃取-氣相色譜-串聯質譜法，能夠對奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素同時進行測定，該方法具有準確、快速、靈敏度高的優點，為奶粉的快速檢測提供了可靠的分析方法。
[0005]為實現上述目的，本發明的技術方案是包括以下步驟:
(一)待測樣品的制備:稱取奶粉，配制同位素內標溶液，在奶粉中加入提取溶劑和同位素內標溶液，均勻攪拌后安裝于微波萃取儀中，經微波萃取后，加提取溶劑定容得到待檢液；
(二)待測樣品的凈化:將步驟(一)制備的待檢液經離心得到凈化液，將固定相萃取柱進行預處理，取凈化液的上萃取柱，經水和甲醇/水溶液淋洗除去固體雜質，甲醇/水溶液中甲醇和水的體積比為1:9，再用洗脫溶劑洗脫萃取柱上的香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料得到洗脫液，將洗脫液濃縮富集后，用甲醇溶劑稀釋并經0.22 μ m微孔濾膜過濾后得到待測樣品溶液；
(三)待測樣品的檢測:配制香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料溶液階梯濃度的標準工作溶液，將步驟(二)中的待測樣品溶液和標準工作溶液在氣相色譜-串聯質譜儀上分別進樣，獲得以待測樣品溶液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料的濃度和同位數內標溶液的濃度的比值為橫坐標，再以待測樣品溶液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料的峰面積和同位數內標溶液的峰面積的比值為縱坐標的工作曲線，還有獲得可以確定母離子的香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料和同位素的一級質譜圖，確定母離子后，采用子離子掃描獲得二級質譜圖，然后從二級質譜圖中選取定量離子和定性離子，然后用工作曲線對定量離子進行定量計算獲得待測樣品溶液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料濃度。
[0006]進一步設置是所述步驟(一)中的提取溶劑為甲醇/水溶液、乙醇/水溶液、甲醇、乙醇中的其中一種。優選，甲醇/水溶液的組分體積比為1:1 ;乙醇/水溶液的組分體積比也是1:1。
[0007]進一步設置是所述甲醇水溶液濃度為25%~90%。
[0008]進一步設置是所述步驟(一)中的微波萃取溫度為60~80°C。
[0009]進一步設置是所述步驟(一)中的同位素內標溶液為13C6-香蘭素、13C-甲基香蘭素和D4-香豆素內標溶液。
[0010]進一步設置是所述 步驟(二)中的萃取固定相為Waters Oasis HLB SPE柱，并通過甲醇、水對SPE柱進行活化處理。
[0011]進一步設置是所述步驟(二)中的洗脫溶劑為甲醇。
[0012]本發明的的原理和優點:
采用上述方案，首先，本發明通過微波萃取技術，以甲醇/水、乙醇/水、甲醇、乙醇為提取溶劑，在試樣中加適量同位素內標溶液和提取溶劑浸泡，經渦旋振蕩后，再在微波萃取儀中按一定溫度、時間和功率進行萃取制得待檢液。如果采用不加溫的傳統的超聲萃取方法，有利于香料的穩定性，僅僅的超聲作用施加不足以破壞香料與蛋白、脂肪等極性分子間形成的鍵合作用，造成香料解離溶出不徹底，影響提取效率，造成最終檢測分析結果的準確性和重現性不好。本發明采用微波萃取，由于微波能是通過內部均勻加熱加速分子運動破壞鍵合作用。因此在功率、溫度、時間、壓力可控的情況下，微波萃取可以使固體或半固體試樣中的某些有機物成分與基體物質有效地分離，從而提高萃取效率，而且還能很好地重現萃取回收率。與傳統的超聲萃取、渦旋提取相比，本發明的提取方法提取效果好，回收率可以達到83.6~107.8% ;遠高于超聲萃取的回收率74.6-83.2%和渦旋提取的回收率72.8-80.9%。而本發明的提取方法還具有快速、節能、節省溶劑、污染小，而且有利于萃取熱不穩定物質的優點。
[0013]其次，本發明還對由微波萃取得到的待檢液進行凈化處理，該凈化處理包括純化和富集的過程。第一步純化:先將待檢液經離心初步凈化，然后將離心后的凈化液通過固相萃取分離的方法依次經過經水和甲醇/水溶液淋洗、甲醇洗脫；第二步富集:將第一步中純化的待檢液濃縮蒸干，然后加入甲醇溶液溶解、經0.22 μ m微孔濾膜過濾，得到凈化的待檢液。該凈化后的待檢液則不會對檢測儀器造成污染。本發明中固相萃取的SPE柱為WatersOasis HLB SPE柱，由于香料和其他雜質的極性大小存在差異，在固相萃取柱上吸附產生保留差異，然后通過優選的淋洗條件和洗脫條件，達到凈化富集香料的目的。
[0014]再次，本發明對于嬰幼兒配方奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素成分的定性定量檢測分析是通過氣相色譜-串聯質譜儀(GC-MS/MS)分析。先配置一組階梯形的標準工作溶液，然后將標準工作液和待檢液在氣相色譜-串聯質譜儀上分別進樣。待檢液中出現的色譜峰保留時間與標準工作溶液一致，允許偏差小于±2.5 %，該色譜峰所對應的質譜定性離子的相對豐度與濃度相當的標準工作溶液的相對豐度一致，而且相對豐度偏差不超過規定，則可確定該待檢液中含有香料。另外，在質譜定量分析中，有兩種方法分別是內標法和外標法。內標法是將一定量的同位素標記物質作內標物，加入到準確稱量的試樣中，根據被測試樣和內標物的質量比及其相應的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。選擇內標物有4個要求:1.內標物應是該試樣中不存在的純物質；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內標物的量應接近于被測組分；4.色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。外標法是用待測組分的純品作對照物質，以對照物質和樣品中待測組分的響應信號相比較進行定量的方法。由于內標法是通過測量內標物及被測組分的峰面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差，其測定結果較為準確。而外標法雖然簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結果。
[0015]下面結合說明書附圖和【具體實施方式】對本發明做進一步介紹。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為本發明具體實施例中的4種香料和3種同位素內標結構圖；圖1中4:香蘭
素、B:甲基香蘭素、C:乙基香蘭素、D:香豆素E =13C6-香蘭素、F =13C-甲基香蘭素、G =D4-香豆素；
圖2為本發明具體實施例中10 μ g kg—1奶粉加標MRM色譜圖；圖2中，各小圖分別對應:香蘭素(A)，13C6-香蘭素(B)，乙基香蘭素(C)，甲基香蘭素(D)，13C-甲基香蘭素(E)，香豆素(F), D4-香豆素(G)；
圖3為本發明具體實施例中4種香料和3種同位素內標GC-MS/MS掃描二級質譜圖；圖3中，各小圖分別對應:香蘭素(A)，13C6-香蘭素(B)，乙基香蘭素(C)，甲基香蘭素(D)，13C-甲基香蘭素(E)，香豆素(F)，D4-香豆素(G)；
圖4為本發明具體實施例中4種香料和3種同位素內標GC-MS/MS掃描二級質譜圖解析圖譜；圖4中，各小圖分別對應:香蘭素(A)，13C6-香蘭素(B)，乙基香蘭素(C)，甲基香蘭素(D)，13C-甲基香蘭素(E)，香豆素(F)，D4-香豆素(G)；
圖5為本發明具體實施例中內標標準曲線，圖5中，各小圖分別對應:香蘭素(A)，甲基香蘭素(B)，乙基香蘭素(C)，香豆素⑶；
【具體實施方式】
[0017]下面通過實施例對本發明進行具體的描述，只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限定，該領域的技術工程師可根據上述發明的內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。
[0018]實施例1 包括以下步驟:
(一)待測樣品的制備:稱取嬰幼兒配方奶粉1.0g，加入0.5mL13C6-香蘭素、13C-甲基香蘭素和D4-香豆素內標混合溶液(濃度均為400 ng mr1)，再加入15mL甲醇/水混合溶液，均勻攪拌后安裝于微波萃取儀中，經微波萃取后，萃取溫度為70 C，取出靜置，取上層清液，用純水定容至50mL容量瓶得到待檢液；
(二)固相萃取凈化:取HLBSPE柱，依次用甲醇和水活化SPE柱，取4?6mL待凈化液至SPE柱，再依次用4?6mL水和4?6mL甲醇/水混合溶液(v/v，1/9)淋洗SPE柱，將SPE柱真空抽干，用6?SmL的甲醇對SPE柱進行洗脫，得到洗脫液，將洗脫液濃縮后，用甲醇稀釋過微孔濾膜后得到待測樣品溶液；
(三)標準溶液的配置:取香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素、13C6-香蘭素、13C-甲基香蘭素和D4-香豆素，用甲醇/水混合溶液分別配制成質量濃度為200 mg/L的單標儲備液，進行測定使用時，用甲醇稀釋上述標準儲備液，將香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素、香豆素分別配制成1.0, 2.0,4.0,10.0, 20.0 ng/mL的混合標準工作溶液，同時每個標準溶液里含有的13C6-香蘭素、13C-甲基香蘭素和D4-香豆素內標溶液均為10ng/mL ；
(四)待測樣品的檢測:將步驟(二)(三)中的待測樣品溶液和標準工作溶液在氣相色譜-串聯質譜儀上分別進樣，獲得以標準工作溶液中每個香料的濃度和同位數內標溶液的濃度的比值為橫坐標，再以標準工作溶液中每個香料的的峰面積和同位數內標溶液的峰面積的比值為縱坐標的工作曲線，還有獲得可以確定母離子的香料和同位素的一級質譜圖，確定母離子后，采用子離子掃描獲得二級質譜圖，然后從二級質譜圖中選取定量離子和定性離子，然后用工作曲線對定量離子進行定量計算獲得待測樣品溶液中每個香料濃度。
[0019]參見表I，其為4種香料和3種同位素GC-MS/MS檢測條件
【權利要求】
1.一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，其特征在于包括以下步驟: 待測樣品的制備:稱取奶粉，配制同位素內標溶液，在奶粉中加入提取溶劑和同位素內標溶液，均勻攪拌后安裝于微波萃取儀中，經微波萃取后，加提取溶劑定容得到待檢液； 待測樣品的凈化:將步驟(一)制備的待檢液經離心得到凈化液，將固定相萃取柱進行預處理，取凈化液的上萃取柱，經水和甲醇/水溶液淋洗除去固體雜質，再用洗脫溶劑洗脫萃取柱上的香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料得到洗脫液，將洗脫液濃縮富集后，用甲醇溶劑稀釋并經0.22 μ m微孔濾膜過濾后得到待測樣品溶液； 待測樣品的檢測:配 制香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料溶液階梯濃度的標準工作溶液，將步驟(二)中的待測樣品溶液和標準工作溶液在氣相色譜-串聯質譜儀上分別進樣，獲得以待測樣品溶液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料的濃度和同位數內標溶液的濃度的比值為橫坐標，再以待測樣品溶液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料的峰面積和同位數內標溶液的峰面積的比值為縱坐標的工作曲線，還有獲得可以確定母離子的香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料和同位素的一級質譜圖，確定母離子后，采用子離子掃描獲得二級質譜圖，然后從二級質譜圖中選取定量離子和定性離子，然后用工作曲線對定量離子進行定量計算獲得待測樣品溶液中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4種香料濃度。
2.根據權利要求1所述的一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，其特征在于:所述步驟(一)中的提取溶劑為甲醇/水溶液、乙醇/水溶液、甲醇、乙醇中的其中一種。
3.根據權利要求2中的一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，其特征在于:所述甲醇水溶液濃度為25%~90%。
4.根據權利要求1所述的一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，其特征在于:所述步驟(一)中的微波萃取溫度為60~80°C。
5.根據權利要求1所述的一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，其特征在于:所述步驟(一)中的同位素內標溶液為13C6-香蘭素、13C-甲基香蘭素和D4-香豆素內標溶液。
6.根據權利要求1所述的一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，其特征在于:所述步驟(二)中的萃取固定相為Waters Oasis HLB SPE柱，并通過甲醇、水對SPE柱進行活化處理。
7.根據權利要求1所述的一種奶粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的提取和檢測方法，其特征在于:所述步驟(二)中的洗脫溶劑為甲醇。
【文檔編號】G01N30/02GK103713066SQ201410005844
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月3日 優先權日:2014年1月3日
【發明者】韓超, 陳祥準, 胡貝貞, 朱振甌, 劉濱 申請人:韓超
專業數控銑床產品供應商
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