專利名稱：：一種檢測牛細小病毒的熒光定量pcr試劑盒及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，涉及一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，同時還涉及熒光定量PCR試劑盒的用途，適用于對血清制品中的牛細小病毒污染進行實時監控，同時廣泛用于該病毒感染的流行病學調査，還可以為相關基礎研究提供技術支持。
背景技術：
：牛細小病毒(Bovineparvovirus,BPV)屬于細小病毒科細小病毒屬，基因組是單鏈的DNA分子，主要引起牛的呼吸道和腸道疾病，其主要特征是引發牛腹瀉另外致母牛流產。人工經口或靜脈感染未吃初乳、體內不含抗體的新生牛犢，于2448小時出現腹瀉，腹瀉同時伴有病毒血癥。且該病毒潛伏期不易被發覺，其易感和潛伏性給畜牧業及其國際貿易帶來嚴重的經濟損失。因此，該病歷來都是國際社會最為關注的傳染病之一。牛細小病毒的快速檢測是控制和消滅該病的前提，但細小病毒的常規檢測方法有一些不足之處，檢測技術一般來說有血清學診斷技術、生物學試驗、分子生物學診斷技術三類1.血清學診斷技術包括補體結合實驗、中和實驗、凝集實驗、免疫擴散、沉淀實驗、免疫電泳技術、免疫熒光技術、放射免疫試驗和免疫電鏡技術等。在這些方法中得到普遍承認、采用并且廣泛應用的有補體結合實驗、間接血凝實驗、瓊脂擴散實驗、中和實驗。但由于所有實驗均用到抗血清和抗原免疫反應，反應時間長，材料多，準備周期長，檢測具有明顯的滯后性，只能定性不能定量，而且重復性差。2.生物學試驗包括動物實驗、雞胚接種和細胞培養。這種檢測方法存在不敏感問題，而且有些樣品中存在抗補體活性，影響檢測效果。動物實驗成本高，周期長，浪費生物資源和人力物力。3.分子生物學診斷技術包括核酸雜交、等電點聚焦電泳、寡核苷酸指紋圖譜分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳、聚合酶鏈式反應、單克隆抗體技術等。核酸雜交、等電點聚焦電泳、寡核苷酸指紋圖譜分析、聚丙烯酰胺凝膠電泳3等檢測方法更適用于對病毒特性進行更加深入的研究，由于整個系統操作復雜，過程繁多，成本高，不適宜同時進行大批量檢測，因而受到很大限制。相比之下，普通PCR方法特異性好，檢測靈敏度高，不但可以檢測活病毒核酸，也能直接檢測滅活的核酸片段。樣品可以是牛血清，也可以是扁桃體、淋巴結、脊髓、肌肉和皮膚等組織，這是免疫學方法無法替代的。但這種傳統的定量方法測定的都是PCR的終產物，而不是起始DNA拷貝數。由于PCR的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。因此，如何快速、準確測定牛腺病毒是面臨的主要難題之一。近年來發展起來的熒光定量PCR(FluorogeneticQuantitativePCR,FQ-PCR)技術以其靈敏度高、速度快、特異性強等優點在基因表達水平分析(NellemannC,VinggaardAM，DalgaardM,etal.QuantificationofAntiandrogenEffectDeterminedbyLightCyclerTechnology[J].Toxicology,2001,163:29-38)、病原體的定性(McGoldrickA,LowingsJP,IbataG,etal.ANovelApproachtotheDetectionofClassicalSwineFeverVirusbyRT-PCRwithaFluorogenicProbe(TaqMan)[J].J.Virol.Methods,1998,72:125-135.;BhudeviB,WdnstockD.FluorogenicRT陽PCRassay(TaqMan)forDetectionandClassificationofBovineViralDiarrheaVirus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:1-10.)和定量檢測(KathyF丄Tang,JunWang,DonaldV丄ightner.QuantitationofTaurasyndromevirusbyreal-timeRT-PCRwithaTaqManassay[J].J.Virol.Methods,115(2004)109國114.;MichaelaSchwaiger,PascalCassinotti.Developmentofaquantitativereal-timeRT-PCRassaywithinternalcontrolforthelaboratorydetectionoftickborneencephalitisvirus(TBEV)RNA[J].J.Clin.Microbiol.,27(2003)136-145.;R.FrankCookc,S丄Cooka，etal.Developmentofamultiplexreal-timereversetranscriptase-polymerasechainreactionforequineinfectiousanemiavirus(EIAN)[J].J.Virol.Methods,105(2002;)171-179.;BirgitLiss*.Improvedquantitativereal-timeRT-PCRforexpressionprofilingofindividualcells[J].NucleicAcidsRes"2002,Vol.30No.17e89.;FranckHousseau3,1imberlyR丄indseya''，etal.Quantitativereal-timeRT-PCRasamethodformonitoringTlymphocytereactivitytofull-lengthtyrosinaseproteininvaccinatedmelanomapatients[J].J.Immunol.Methods266(2002)87-103.;DesireN,DeheeA,SchneiderV,etal.QuantificationofHumanImmunodeficiencyVirusType1ProviralLoadbyaTaqManReal-TimePCRAssay[J].J.Clin.Microbiol,2001,39:1303國1310,;MartellM,GomezJ,EstebanJI,etal.High-ThroughputReal-TimeReverseTranscription-PCRQuantitationofHepatitisCVirusRNA[J].J.Clin.Microbiol,1999，37:327-332.;KearnsAM，TurnerAJL，EltringhamGJA,etal.RapidDetectionandQuantificationofCMVDNAinUrineusingLightcycler-basedReal-timePCR[J],J.Clin.Virol,2002,24:131-134;FlorenceKP,GlauciaPB，MireilleS,etal.QuantitationofHCVRNAusingreal-timePCRandfluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:111-119;ZakhartchoukA，ConnorsW，vanKesselA,etal.Bovineadenovirustype3containingheterologousproteinintheC-termi皿sofminorcapsidproteinIX.Virology,2004,320(2):291-300.)等方面得到廣泛應用，并且已經成為當前病毒核酸定量主要方法，國內目前已有關于丙肝、乙肝、支原體、艾滋病、結核定量檢測的試劑盒上市。
發明內容本發明的目的是在于提供了一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，該PCR試劑盒適用于目前市場上的所有類型熒光定量基因擴增儀，靈敏度高、定量快速準確、檢測范圍廣，穩定性好。本發明的另一個目的是在于提供了一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學調查中的應用，可高效方便地對血清制品中的牛細小病毒污染進行實時監控，還可以為相關基礎研究提供技術支持。為了實現上述目的，本發明采用以下技術措施，該熒光定量PCR試劑盒包括a)DNA提取試劑，b)熱啟動TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針，d)標準陽性DNA模板，e)PCR熒光定量反應液，其特征在于引物序列分別為正義引物(FP):5'-CCAGTACCAGGAAACGGAGAC-3'，反義引物(RT):5'-GCATGTATTCCGGTCTCCAA-3'，擴增子大小為118bp，熒光探針序列為5'-FAM-CCTCAACATCTACGTCACCGGACAA陽TAMRA-3'(SEQIDNO:3)，探針的5'端標記熒光發射基團FAM，靠近3'端標記熒光淬滅基團TAMRA，標準陽性DNA模板由己插入細小病毒VP3蛋白編碼區118bp片段的pGEM-T載體(購自Pramega公司)轉化大腸桿菌DH5a(購自Invitrogen公司，普通大腸桿菌DH5a)，增殖后提取質粒制備，并于紫外分光光度計測A26o定量并10倍梯度稀5釋。所述的PCR熒光定量反應液由10xbuffer、10pM的正義引物和反義引物、10pM的熒光探針和熱啟動TaqDNA聚合酶、無核酸酶的無菌水組成。所述的標準陽性模板DNA序列為GGAGACCGGAATACATGC。在本發明的一個優選方案中，熒光定量反應液由正義引物(FP)，反義引物(RT)，熒光探針(TaqMan)，10xbuffer溶液，熱啟動TaqDNA聚合酶，無核酸酶的滅菌雙蒸水組成；在本發明的一個具體方案中，熒光定量反應液由10xbuffer溶液2.5^1，10nmol/L正義(FP)、反義(RP)引物各3fil，10|amol/L熒光探針0.75|il，dNTPs(10mM)l(il，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，Mg2SO4(50mM)0.5pl，無核酸酶的滅菌雙蒸水9nl組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5"端標記的熒光報告基團是FAM，3'端標記熒光淬滅基團TAMRA。在本發明的一個優選方案中，標準陽性DNA模板由含有插入目的片段的pGEM-T(購自Promega公司)載體制備，于紫外分光光度計測八26()定量并10倍梯度稀釋。實驗所用的標準品制備過程為PCR產物電泳后切下含有目的片段的凝膠，用Omega公司的凝膠純化試劑盒純化，與pGEM-T載體(購自promega公司)4'C過夜連接，轉化感受態細胞，轉化產物涂平板培養，挑取白斑PCR鑒定陽性后送英駿生物技術有限公司測序，根據測序結果將篩選的陽性克隆菌接種到含氨卞的LB培養基過夜培養，用SDS堿裂解法制備質粒DNA，經Omega公司的凝膠純化試劑盒純化后，于紫外分光光度計測A26()定量，并稀釋至梯度109-102拷貝/|^，-70匸保存，所用一切物品均無核酸酶。在本發明提供檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒中，有一條一端標記有熒光報告基團另一端標記有熒光淬滅基團的特異性熒光探針，在探針完整時，兩基團在空間結構上距離相互靠近，5'端報告基團產生的熒光因為熒光共振能量轉移(FRET)而被3'端淬滅基團淬滅，故體系中沒有熒光信號的變化。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結合，隨著引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5'-3'外切活性對探針進行切割釋放出報告基團，這樣破壞了兩基團之間的FRET，報告基團所釋放的熒光可以被內置在定量檢測儀內的熒光探測器檢測，模板每復制一次，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數目和PCR產物數量是一對一的關系，所以熒光量的增加與PCR產物的積累量呈比例關系。對BPV的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量的循環數，Ct值與起始模數呈一定比例關系，Ct值越小，起始模板數越多，相反，Ct值越大，起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的a值制成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。在本發明提供檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒中，針對牛細小病毒的基因組的靶片段核苷酸排列的特殊性，將反應體系(引物和探針濃度、Mg2+濃度、擴增程序等)優化，并將熒光定量PCR技術和定量檢測系統(包括LigthCycler系統，Roche,ABIPrism系統，PEAppliedBioasystems)相結合，將其用于各種來源的牛細小病毒樣品的定量檢測。通過優化方案，反復實驗，以及與傳統檢測方法進行比較，建立了定量檢測BPV的方法，并研制出牛細小病毒的定量檢測試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個反應體系中檢出IOO個病毒基因拷貝數，檢測范圍可以達到八個數量級，是其它任何方法無法比擬的。在本發明的另外一個方面，還提供了一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學調査中的應用，熒光定量PCR試劑盒對牛細小病毒進行檢測的方法，該方法包括下列步驟-A)用e)標準陽性DNA模板由插入目的片段的pGEM-T(購自Promega公司)載體制備，并用紫外分光光度計定量；B)用a)DNA抽提液從待測標本和陰陽性標準品中提取DNA，然后加C)e)PCR熒光定量反應液及其優化試劑，b)熱啟動TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針；D)將C)步中已加入了標準品及待測樣品的熒光定量反應液PCR反應體系上機，用熒光定量檢測儀進行PCR檢測；E)通過比較待測樣品和標準品的循環域值根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。在本發明中提供的檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒可對各種來源的牛血清樣品進行準確定量檢測，從而可對疫情進行實時監控，可廣泛用于動物產品的進出口及動物食品的安全檢測和質量監控，可為相關基礎研究提供技術支持。本發明與現有技術相比具有以下優點和效果1.與傳統定量方法相比，此實時熒光定量PCR具有高靈敏性，高特異性和高準確性的特點，直接對PCR每循環一次就收集一個數據，建立實時擴增曲線，準確地確定Ct值，從而根據Ct值確定起始DNA拷貝數，做到了真正意義上的DNA2.檢測范圍廣，在109-102copies/reactiOn濃度范圍內有極好的線性關系(R=0.999)，檢測范圍可以達到八個數量級，巳達到國際先進水平，其靈敏度可檢測100copies的水平，是其它任何方法無法比擬的。3.適用于各種型號的熒光定量擴增儀，一次實驗中三個重復樣品相應的變異系數(CV)小于2%，說明其極高的重復性和穩定性。4.該實時熒光定量PCR利用外標準曲線，是迄今為止定量最準確，重現性最好的定量方法，廣泛用于血清制品中的病毒污染、流行病檢查和基礎研究等領域。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明要求保護的范圍，下列實施例中未注明的具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如精編分子生物學指南，F.M.奧斯柏等主編，科學出版社，1995，分子克隆實驗指南(第三版)；D丄.斯佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南；呂鴻聲，科學出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。實施例1牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒組成及其反應條件A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應)DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR擴增反應液(220pl/管)強陽性標準品(IOO倍稀釋定值準品20pl/管，共四管)陰性標準品(50^11/管)熱啟動TaqDNA聚合酶(2.75nl/管)PCR反應管(無菌、無RNA酶和DNA酶)無核酸酶H20(2ml/管)臨界陽性標準品(50pl/管)(DNA提取液A、B、C、D為TIANGEN公司產品。b)熱啟動TaqDNA聚合酶(2U1)、c)PCR擴增反應液購自Takara公司)B).熒光定量反應液(反應總體積是25pl):10xbuffer2.5pl，正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10pmol/L)，熒光探針0,75p1(10|amol/L)，dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5|al，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，標準品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9^1組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標記的熒光報告基團是FAM,3'端標記熒光淬滅基團TAMRA。C).反應條件如下(采用兩步法)PCR:94°C2min94°C30si4060°C90sJCycle在每個循環的第二步結束時進行熒光檢測。對BPV的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。D).熒光定量PCR試劑盒檢測細小病毒的靈敏度、檢測范圍及穩定性取標準品DNA109-102c/nl濃度范圍，每個濃度三個重復，分別加入對應編號的PCR反應管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環條件為94'C預變性2min;94°C30s，60°C90s，擴增40個循環。把熒光檢測的程序設置在每個循環的第二步結束時進行，檢測波長為518nm。循環結束后，運用Eppendorf公司的MastercyclerepRealplex儀器自帶的分析軟件(Realplex)，讀取待檢樣品拷貝數。結果為<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>以上結果表明該試劑盒檢測范圍廣，在109-102(^濃度范圍內有極好的線性關系，相關系數R=0.999，其檢測范圍可以達到八個數量級，其靈敏度可檢測lOOcopies，且穩定性好，一次實驗中三個重復樣品相應的變異系數(CV)小于2%，說明其極高的重復性，適用于各種型號的熒光定量擴增儀，是其它任何方法無法比擬的。實施例2熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學調査中的應用A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應)DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR擴增反應液(220pl/管)強陽性標準品(IOO倍稀釋定值準品20^/管，共四管)陰性標準品(50pl/管)熱啟動TaqDNA聚合酶(2.75inl/管)PCR反應管(無菌、無RNA酶和DNA酶)臨界陽性標準品(50pl/管)無核酸酶H20(2ml/管)(DNA提取液A、B、C、D為TIANGEN公司產品。b)熱啟動TaqDNA聚合酶(2U/pI)、c)PCR反應液購自Takara公司)B).熒光定量反應液(反應總體積是25jil):10xbuffer2.5fi1,正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10pmol/L)，熒光探針0.75pi(10pmol/L),dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5|al，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的標準品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9^1組成。其中熒光探針為(SEQIDNO:3)所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標記的熒光報告基團是FAM，3'端標記熒光淬滅基團TAMRA。C).反應條件如下(采用兩步法)PCR:94。C2min在每個循環的第二步結束時進行熒光檢測。對BPV的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。D).熒光定量PCR試劑盒檢測細小病毒.-(1)不同來源的奶牛血清原料樣本，經(X2tiM濾器過濾后，分別配制成5%(體積比)奶牛血清(FetalBovineSerum,FBS)的MEM培養基(lmlFBS加入19mlMEM)，分別編號為A1A25;(2)將狀態良好的原代牛腎細胞BKC接入6孔板，匯合度約25%，待細胞貼壁后(約6h)，更換為待檢的5%(體積比)FBSMEM樣本，同時設陰性對照和陽性對照，于37°C，5%(體積比)C02培養箱中培養4天后2000rpm離心5min收集細胞；(3)上述收集得到的細胞，倒盡上清，加入200^1DNA提取液A，振蕩至徹底懸浮，加入4plRNaseA(100mg/ml)，振蕩15s，室溫(2025°C，以下相同)放置5min;(4)加入20pl蛋白酶K，混勻(5至20次)；7(TC放置10min，至溶液變清亮，瞬時離心，去除管內壁的水珠；(5)加入200pl無水乙醇，充分混勻15s，瞬時離心；(6)將上一歩溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，12000rpm離心30s，棄廢液；(7)吸附柱中加入500plDNA提取液C(使用前加入3.4ml無水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(8)吸附柱中加入700^1DNA提取液D(使用前加入10ml無水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(9)吸附柱中加入500nlDNA提取液D，12000rpm離心30s，棄廢液；(10)空離吸附柱，12000rpm離心2min，室溫(20~25°C)涼干；(11)20^1無核酸酶水加入吸附柱，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min;(12)得到的DNA用于下游的熒光定量PCR實驗。E)取D步所提DNA5pd,熒光定量反應液(反應總體積是25^1):10xbuffer2.5pl，正義引物FP(SEQIDN0:1)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3pl(10^unol/L)，熒光探針0.75pl(10|imol/L)，dNTPs(10mM)lnl，Mg2SO4(50mM)0.5pl，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25W，標準品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9pl，分別加入對應編號的PCR反應管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢領U。循環條件為94。C預變性2min;94°C30s，60°C90s，擴增40個循環。把熒光檢測的程序設置在每個循環的第二步結束時進行，檢測波長為518nm。循環結束后，運用Eppendorf公司的MastercyclerepRealplex儀器自帶的分析軟件(Realplex),讀取待檢樣品拷貝數。結果為血清樣品編號奶牛編號BPV變異系數％12<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>以上結果表明，奶牛編號為7-021的奶牛血清中含有BPV，表明奶牛群中存在少量的奶牛攜帶BPV,同時證實了牛細小病毒熒光定量PCR試劑盒能成功應用于BPV流行病學調査，牛血清以及牛血液制品的監測，重復性好，CV值均小于2%。實施例3熒光定量PCR試劑盒在市售牛血清產品中質量監測的應用A).試劑盒組成a)試劑盒組成如下(IO次反應)DNA提取液A(4ml/管)DNA提取液B(2ml/管)DNA提取液C(2.6ml/管)DNA提取液D(2.5ml/管)RNaseA(40ul/管)蛋白酶K溶液(2ml/管)PCR擴增反應液(220pl/管)熱啟動TaqDNA聚合酶(2.75pl/管)強陽性標準品(100倍稀PCR反應管(無菌、無RNA酶和DNA酶)釋定值準品20pl/管，共四管)無核酸酶1120(2ml/管)陰性標準品(50pl/管)臨界陽性標準品(50pl/管)(DNA提取液A、B、C、D為TIANGEN公司產品。b)熱啟動TaqDNA聚合酶(2U/nl)、c)PCR反應液購自Takara公司)B).熒光定量反應液(反應總體積是25pl):10xbuffer2.5jal，正義引物FP(SEQIDNO:l)和反義引物RP(SEQIDNO:2)各3(10^mol/L)，熒光探針0.75pl(10|umol/L)，dNTPs(10mM)lpl，Mg2SO4(50mM)0.5pl，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，抽提的標準品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9^1組成。其中熒光探針為(SEQIDN03)所示的核苷酸序列，熒光探針5"端標記的熒光報告基團是FAM，3"端標記熒光淬滅基團TAMRA。C).反應條件如下(采用兩步法)PCR:94°C2min94。C30s"^4060°C90s^Cycle在每個循環的第二步結束時進行熒光檢測。對BPV的定量可通過與標準品的循環域值(Ct，ThresholdCycle)相比較并根據標準曲線計算出待測樣品的起始拷貝數。D).熒光定量PCR試劑盒檢Gibco、Hyclone、杭州四季青、武漢三利生物技14術有限公司四個產家的血清是否污染有牛細小病毒:1)待檢血清的批號<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2)實驗方法-(1)培養的原代牛腎細胞鋪制6孔板x4塊，2ml/L，50%(面積比)匯合度；(2)待檢血清用MEM配制為5%(體積比)工作濃度；(3)細胞貼壁后，更換為待檢血清配制的培養基，2ml/孔；(4)同時設陰性和陽性對照，陽性對照加含有BPV的5%(體積比)FBSMEM;(5)37°C，5%(體積比)C02培養箱中培養。(6)細胞培養72h后，收集細胞，2000rpm離心5min暫存于-8(TC。其余樣品同樣方法處理。提取細胞的總DNA，作為熒光定量PCR的模板。3)細胞中總DNA的提取(1)上述收集得到的細胞，倒盡上清，加入200plDNA提取液A，振蕩至徹底懸浮，加入4plRNaseA(100mg/ml)，振蕩15s，室溫(20~25°C)放置5min;(2)加入20pl蛋白酶K，混勻(5至20次)；70。C放置10min，至溶液變清亮，瞬時離心，去除管內壁的水珠；(4)加入200W無水乙醇，充分混勻15s，瞬時離心；(5)將上一步溶液和絮狀沉淀都加入吸附柱中，12000rpm離心30s，棄廢液；(6)吸附柱中加入500nlDNA提取液C(使用前加入3.4ml無水乙醇)，12000rpm離心30s,棄廢液；(7)吸附柱中加入700^1DNA提取液D(使用前加入10ml無水乙醇)，12000rpm離心30s，棄廢液；(8)吸附柱中加入500nlDNA提取液D，12000rpm離心30s，棄廢液；(9)空離吸附柱，12000rpm離心2min,室溫(20~25°C)涼干；(10)2(^1無核酸酶水加入吸附柱，室溫放置2-5min，12000rpm離心2min;(11)得到的DNA用于下游的熒光定量PCR實驗。E)取D步所提DNA5pl，熒光定量反應液(反應總體積是25pl):10xbuffer2.5^1，正義引物FP(SEQIDN0:1)和反義引物RP(SEQIDN0:2)各3(il(10Hmol/L)，熒光探針0.75pl(10|amol/L)，dNTPs(10mM)l|al，Mg2SO4(50mM)0.5pl，熱啟動TaqDNA聚合酶0.25^1，標準品或待測樣品均為5^1，無核酸酶的滅菌雙蒸水9pl，分別加入對應編號的PCR反應管，在熒光定量檢測儀上平行做PCR檢測。循環條件為94。C預變性2min;94°C30s，60°C90s，擴增40個循環。把熒光檢測的程序設置在每個循環的第二步結束時進行，檢測波長為518nm。循環結束后，運用儀器自帶分析軟件，讀取待檢樣品拷貝數。結果為:公司名稱血清批號BPV(copies/ml)Gibco749154-949184-719321-719351-7685959D-HycloneNSF0081-NSF0071-NSF0061-NSF0051-NSF0021-杭州四季青080304-080504-080426-080228-080408-武漢三利20080701-060604-20080302-16<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>-以上結果表明四個公司全部待檢批號的血清均表現為BPV陰性，而陽性對照細胞中檢測出大量的BPV，表明該試劑盒能用于檢測細胞樣品中的病毒。SEQUENCELISTING〈110>武漢三利生物技術有限公司〈120〉一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒及應用〈130>—種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒及應用〈160〉3〈170〉Patentlnversion3.3<210>1〈211〉22〈212〉DNA〈213〉人工合成<400>1CCAGTACCAGGAAACGGAGAC21<210〉2〈211〉20〈212>DNA〈213〉人工合成<■〉2GCATGTATTCCGGTCTCCAA20<210〉3<211〉28<212>DNA<213>人工合成〈400〉3CCTCAACATCTACGTCACCGGACAA2權利要求1、一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒含有a)DNA提取試劑，b)熱啟動TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針，d)標準陽性DNA模板，e)PCR熒光定量反應液，其特征是引物序列分別為正義引物5′-CCAGTACCAGGAAACGGAGAC-3′，反義引物5′-GCATGTATTCCGGTCTCCAA-3′，擴增子大小為118bp，熒光探針序列為5′-FAM-CCTCAACATCTACGTCACCGGACAA-TAMRA-3′，探針的5’端標記熒光發射基團FAM，3’端標記熒光淬滅基團TAMRA，標準陽性DNA模板由已插入細小病毒VP3蛋白編碼區118bp片段的pGEM-T載體轉化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質粒制備，并于紫外分光光度計測A260定量并10倍梯度稀釋。2、根據權利要求1所述的一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述的PCR熒光定量反應液由10xbuffer、10pM的正義引物和反義引物、10(iM的熒光探針和熱啟動TaqDNA聚合酶、無核酸酶的無菌水組成。3、根據權利要求1所述的一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于所述的標準陽性模板DNA序列為GGAGACCGGAATACATGC4、權利要求1所述的一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學調査中的應用。全文摘要本發明公開了一種檢測牛細小病毒的熒光定量PCR試劑盒及應用，該試劑盒含有a)DNA提取試劑，b)熱啟動TaqDNA聚合酶，c)引物和TaqMan探針，d)標準陽性DNA模板，e)PCR熒光定量反應液，其特征是引物序列為正義引物5′-CCAGTACCAGGAAACGGAGAC-3′，反義引物5′-GCATGTATTCCGGTCTCCAA-3′，擴增子大小為118bp，熒光探針序列為5′-FAM-CCTCAACATCTACGTCACCGGACAA-TAMRA-3′，探針的5’端標記熒光發射基團FAM，靠近3’端標記熒光淬滅基團TAMRA，標準陽性DNA模板由已插入細小病毒VP3蛋白編碼區118bp片段的pGEM-T載體轉化大腸桿菌DH5α，增殖后提取質粒制備，并于紫外分光光度計測A<sub>260</sub>定量并10倍梯度稀釋。熒光定量PCR試劑盒在奶牛感染細小病毒流行病學調查中的應用，高效方便地對血清制品中的牛細小病毒污染進行實時監控，廣泛適用于該病毒感染的流行病學調查。文檔編號G01N21/64GK101565759SQ200910062398公開日2009年10月28日申請日期2009年6月2日優先權日2009年6月2日發明者張國榮,勇李,鄭從義,佳郭,璇黃申請人:武漢三利生物技術有限公司
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