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溪黃草藥材hplc指紋圖譜的建立及其指紋圖譜的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立及其指紋圖譜，涉及中藥藥材的質量控制方法，具體是建立HPLC指紋圖譜以檢測溪黃草藥材提取液的方法。本發明步驟為，對照品溶液的制備；提取溶劑與方法的選擇；樣品溶液的制備；色譜條件考察：色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為0.1%～0.3%乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，柱溫：25～40℃，紫外檢測波長為230～270nm，時間100～120min；不同品種溪黃草藥材HPLC指紋圖譜測定；特征峰的標記與參照峰的選擇。本發明的有益效果：解決溪黃草的入藥基源爭議。綜合運用了指紋圖譜的共有峰比較、聚類分析和特有峰分析等方法對三個品種溪黃草HPLC指紋圖譜進行鑒別，實現對溪黃草藥材的基源鑒別，劃分了產地歸類，為溪黃草藥材的質量控制、臨床正確使用提供依據。
【專利說明】溪黃草藥材HPLC指紋圖譜的建立及其指紋圖譜
【技術領域】
[0001]本發明涉及中藥藥材的質量控制方法，具體涉及溪黃草藥材高效液相色譜法指紋圖譜的構建方法和標準指紋圖譜。
【背景技術】
[0002]溪黃草原植物為唇形科香茶菜屬植物線紋香茶菜Isodon 1phanthoides(Buch.-Ham.ex D.Don)H.Hara.的干燥地上部分。主產于長江以南的湖南、湖北、四川、云南、江西、廣東、廣西、福建等省區。性味苦、甘、寒，歸肝、膽經，具有清熱利濕、退黃、涼血散瘀的功效，用于治療濕熱黃疸、濕熱瀉痢、跌打瘀痛、急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎、痢疾、腸炎等疾病。
[0003]溪黃草為華南地區民間習用草藥。溪黃草作為清肝利膽藥在廣東大部分地區民間有著很長的使用歷史。民間和歷代名醫把溪黃草用作清熱祛濕、利膽退黃藥，治療急性黃疸型肝炎、急性膽囊炎，為預防和治療肝膽疾病的常用藥。
[0004]現作商品“溪黃草”入藥的除線紋香茶菜外，還有同屬植物狹基線紋香茶菜R.1ophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) Hara var.gerardiana (Benth.) Hara、纖花香茶菜R.1ophanthoides (Buch.-Ham ex D.Don) Hara var.gracilifl ora (Benth.) Hara 和溪黃草R.serra(Maxim.)Hara0廣東部頒標準和國家藥典2010版(附錄)對溪黃草的基源收載以及學者間都存在爭議。中藥溪黃草來源復雜，同名異物、品種混亂普遍，且這類植物外形類似，開花前和干品都不易鑒別。為保證和提高藥材質量，促進中藥標準化，在研究過程中應重視對所用藥材作基源鑒定；并應對多來源藥材在鑒定、化學、藥理和臨床進一步比較研究，以便在各種藥材之間找出功效、主效異同點，為臨床用藥的安全、有效提供準確可靠的依據。

【發明內容】

[0005]本發明的目的為溪黃草藥材的質量控制和真偽鑒別提供一個新的方法，通過建立溪黃草藥材指紋圖譜的方法，并由此方法得到溪黃草藥材共有模式的指紋圖譜。
[0006]為達到本發明的目的所采用的技術方案:用高效液相色譜法建立溪黃草藥材指紋圖譜的方法，具體包括如下步驟:
①、對照品溶液的制備:精密稱取對照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸，以甲醇為溶劑，配成咖啡酸濃度為0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素為0.238mg/mL、牡荊苷為0.179mg/mL和迷迭香酸為
0.115mg/mL的混合對照品溶液。；
②、樣品溶液的制備:精密稱定溪黃草藥材粉末，精密加入50%乙醇20mL，稱搖勻，濾過，作為供試品溶液；
③、色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，紫外檢測波長為230?270nm ；
④、測定:精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
[0007]進一步優選的方法可以通過下述步驟實施:
①、對照品溶液的制備:精密稱取對照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸，以甲醇為溶劑，配成咖啡酸濃度為0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素為0.238mg/mL、牡荊苷為0.179mg/mL和迷迭香酸為
0.115mg/mL的混合對照品溶液。；
②、樣品溶液的制備，取溪黃草藥材粉末1.0g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用0.22 μ m微孔濾膜濾過，作為樣品溶液；
所述步驟；
③、色譜條件，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為
0.1%?0.3%乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，柱溫:25?40°C，紫外檢測波長為230?270nm，時間 100 ?120min ；
④、測定，采用精密吸取樣品溶液10?20μ L注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
[0008]本發明最佳的檢測方法可以通過下述步驟實施:
步驟②樣品溶液的制備，取溪黃草藥材粉末1.0g,精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用0.22 μ m微孔濾膜濾過，作為樣品溶液；步驟③色譜條件中流動相為0.3%乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，流速為0.8mL/min，柱溫:30°C，紫外檢測波長為254nm,分析時間 120min ；
在步驟③中，所述的梯度洗脫，優選梯度洗脫程序以如下體積濃度配置進行:
O分鐘時，流動相A為8%的乙腈溶液、流動相B為92%的0.3%的磷酸溶液；
5分鐘時，流動相A為12%的乙腈溶液、流動相B為88%的0.3%的磷酸溶液；
30分鐘時，流動相A為18%的乙腈溶液、流動相B為82%的0.3%的磷酸溶液；
60分鐘時，流動相A為23%的乙腈溶液、流動相B為77%的0.3%的磷酸溶液；
80分鐘時，流動相A為50%的乙腈溶液、流動相B為50%的0.3%的磷酸溶液；
100分鐘時，流動相A為70%的乙腈溶液、流動相B為30%的0.3%的磷酸溶液；
120分鐘時，流動相A為90%的乙腈溶液、流動相B為10%的0.3%的磷酸溶液。
[0009]具體見下表:
【權利要求】
1.一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于采用高效液相色譜法，具體包括如下步驟: ①、對照品溶液的制備:精密稱取對照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸，以甲醇為溶劑，配成咖啡酸濃度為0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素為0.238mg/mL、牡荊苷為0.179mg/mL和迷迭香酸為0.115mg/mL的混合對照品溶液； ②、樣品溶液的制備:準確稱定溪黃草藥材粉末，精密加入50%乙醇20mL，搖勻，濾過，作為供試品溶液； ③、色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，紫外檢測波長為230~270nm ； ④、測定:精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
2.根據權利要求1所述的一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于: 所述步驟②樣品溶液的制備，取溪黃草藥材粉末1.0g，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用0.22 μ m微孔濾膜濾過，作為供試品； 所述步驟③色譜條件，色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為乙腈-0.1%~0.3%磷酸組成的梯度洗脫液，柱溫:25~40°C，紫外檢測波長為230~270nm，時間 100 ~120min ； 所述步驟④測定，采用精密吸取樣品溶液10~20 μ L注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
3.根據權利要求1所述的一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于: 所述步驟②樣品溶液的制備，取溪黃草藥材粉末1.0g,精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇20mL，稱定重量，超聲提取30min，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，用0.22 μ m微孔濾膜濾過，作為樣品溶液； 所述步驟③色譜條件中流動相為乙腈-0.3%磷酸組成的梯度洗脫液，流速為0.SmL/min，柱溫:30°C，紫外檢測波長為254nm，分析時間120min。
4.根據權利要求2或3所述的一種溪黃草藥材指紋圖譜的建立方法，其特征在于: 所述步驟③色譜條件中所述的梯度洗脫，梯度洗脫程序以如下體積濃度配置進行: O分鐘時，流動相A為8%的乙腈溶液、流動相B為92%的0.3%的磷酸溶液； 5分鐘時，流動相A為12%的乙腈溶液、流動相B為88%的0.3%的磷酸溶液； 30分鐘時，流動相A為18%的乙腈溶液、流動相B為82%的0.3%的磷酸溶液； 60分鐘時，流動相A為23%的乙腈溶液、流動相B為77%的0.3%的磷酸溶液； 80分鐘時，流動相A為50%的乙腈溶液、流動相B為50%的0.3%的磷酸溶液； 100分鐘時，流動相A為70%的乙腈溶液、流動相B為30%的0.3%的磷酸溶液； 120分鐘時，流動相A為90%的乙腈溶液、流動相B為10%的0.3%的磷酸溶液。
5.一種溪黃草藥材的指紋圖譜，其特征在于: 溪黃草藥材指紋圖譜的建立，具體包括如下步驟 ①、對照品溶液的制備:精密稱取對照品咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸，以甲醇為溶劑，配成咖啡酸濃度為0.092mg/mL、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素為0.238mg/mL、牡荊苷為0.179mg/mL和迷迭香酸為0.115mg/mL的混合對照品溶液； ②、樣品溶液的制備:精密稱定溪黃草藥材粉末，精密加入50%乙醇20mL，搖勻，濾過，作為供試品溶液； ③、色譜條件:色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料，采用梯度洗脫，流動相為乙腈-磷酸組成的梯度洗脫液，紫外檢測波長為230~270nm ； ④、測定:精密吸取供試品溶液注入高效液相色譜儀，照高效液相色譜法測定，得到指紋圖譜。
6.一種溪黃草藥材的指紋圖譜，其特征在于:通過高效液相色譜儀獲得的指紋圖譜是聯合運用色譜峰保留時間(t)和二極陣列檢測器采集各色譜峰紫外光譜(UV)確定4個特征峰(見圖2和圖3);其中，S4號峰(迷迭香酸)的峰高最高(見圖1)，且均為4個品種溪黃草藥材均含有的色譜峰，峰面積最大，與相鄰峰分離度較好，在測定時比較穩定，因此選作參照峰；咖啡酸、6-C-吡喃阿拉伯糖基-8-C-吡喃葡萄糖基芹菜素、牡荊苷和迷迭香酸均為線紋香茶菜、狹基線紋香茶菜和纖花線紋香茶菜共有的色譜峰(分別為2-Sl、3-S2、5-S3、9-S4峰)，而溪黃草僅有咖啡酸和迷迭香酸峰(分別為3-S1U5-S4峰)；指紋圖譜中特征峰的差異可作為區別溪黃草與正品線紋香茶的標準。
【文檔編號】G01N30/02GK103776926SQ201410008547
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月8日 優先權日:2014年1月8日
【發明者】賴小平, 黃松, 蔣東旭 申請人:東莞廣州中醫藥大學中醫藥數理工程研究院