一種基于適體識別作用電化學測定多巴胺的方法
【專利摘要】本發明涉及一種基于適體識別作用電化學測定多巴胺的方法及應用，將電化學標記物硫堇吸附在金-鉑納米粒子(Au@PtNPs)表面，再將巰基DNA1固定在Au@PtNPs表面，得電化學探針(DNA1/Th/Au@PtNPs)；再將電化學探針溶液中加入多巴胺適體鏈DNA2，DNA1與DNA2發生互補配對，得DNA2修飾的電化學探針(DNA2/DNA1/Th/Au@PtNPs)；當向DNA2修飾的探針溶液中加入多巴胺后，適體鏈DNA2與多巴胺結合，導致重新生成了電化學探針DNA1/Th/Au@PtNPs；然后將碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)浸入重新生成的電化學探針DNA1/Th/Au@PtNPs溶液中，由于碳納米粒子與單鏈DNA1的吸附作用，電化學探針吸附于電極表面，測電化學信號，通過電化學信號強弱實現了電化學方法對多巴胺的定量測定。本發明的傳感器具有很高的選擇性和檢測靈敏度。
【專利說明】—種基于適體識別作用電化學測定多巴胺的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析化學和電化學領域，具體涉及一種性檢測多巴胺的電化學方法。【背景技術】
[0002]多巴胺(DA)是一重要的信息傳遞物質，其含量的改變可導致一些重要疾病如帕金森氏癥等。因此，多巴胺的測定一直是分析化學、生物和醫學領域的研究熱點。電化學測定多巴胺有較高的靈敏度，但由于大量抗壞血酸(AA)與多巴胺共存于腦內，其在固體電極上的氧化電位與多巴胺重疊，因而嚴重干擾多巴胺含量的測定。
[0003]近年來，提出了一些基于適體技術檢測多巴胺的方法。如光度法(Yu Zheng, YongWang, Xiurong Yang, Aptamer-based colorimetric biosensing of dopamine usingunmodified gold nanoparticles.Sensors and Actuators B, 156(2011)95-99)、突 光法(Qin Mu, Hu Xu,Yan Li, Shijian Ma, Xinhua Zhong, Adenosine capped QDs basedfluorescent sensor for detection of dopamine with high selectivity and sensitivity.Analyst, 139 (2014) 93-98)、酶聯免疫方法(Hoyoung Park, Insook Rhee Paeng, Developmentof direct competitive enzyme-linked aptamer assay for determination of dopaminein serum.Analytica Chimica Acta, 685(2011)65-73;Eunhye Kim, Insook RheePaeng, Advantageous sensitivity in the DNA homolog of the RNA dopamine aptamer.Journal of Immunoassay and Immunochemistry, 35 (2014) 83-100)等，然而這些檢測方法大都靈敏度低，操作繁瑣，而且耗時較多。因此，必須發展一種簡單，低成本，快速的檢測方法用于多巴胺的分析檢測。
【發明內容】
[0004]一種基于適體識別作用電化學測定多巴胺的方法:將電化學標記物硫堇吸附在金-鉬納米粒子(Au@PtNPs)表面，再將巰基DNAl固定在AuOPtNPs表面，得電化學探針(DNAl/Th/AuiPtNPs);再將電化學探針溶液中加入多巴胺適體鏈DNA2，DNAl與DNA2發生互補配對，得DNA2修飾的電化學探針(DNA2/DNAl/Th/Au@PtNPs)；當向DNA2修飾的探針溶液中加入多巴胺后，適體鏈DNA2與多巴胺結合，導致重新生成了電化學探針DNA1/Th/Au@PtNPs ;然后將碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)浸入重新生成的電化學探針DNA1/Th/Au@PtNPs溶液中，由于碳納米粒子與單鏈DNAl的吸附作用，電化學探針吸附于電極表面，測電化學信號，通過電化學信號強弱實現了電化學方法對多巴胺的定量測定。
[0005]本發明是通過以下措施來實現的:一種基于適體識別作用電化學測定多巴胺的方法，其特征是包括以下步驟:
[0006](I)制備電化學探針；
[0007](2)制備碳納米粒子修飾金電極；
[0008](3)電化學檢測多巴胺。
[0009]優選的，本發明所述的電化學探針制備包括以下步驟:取2mL的離心管，加入10μ LKT5M的DNAl和10 μ L pH5.2500mM的醋酸緩沖溶液，和10 μ LlOmM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)反應lh，用以活化巰基。然后，另取2mL離心管依次加入直徑15nmlmLAu@PtNPs和100 μ L10_4M的硫堇溶液反應0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上。將吸附了硫堇的AuOPtNPs加入到活化好的巰基DNAl中，放入37°C搖床輕搖反應16h。使巰基DNAl與AuOPtNPs通過Au-S鍵連接起來。再向體系中加入0.1M NaCl放置24h后在15000轉速下，離心30min，得到紅色沉淀，并用IOmM pH8.0的磷酸緩沖溶液洗滌三次，分散在IOmM pH8.0的磷酸緩沖溶液中得到DNAl/Th/AuOPtNPs電化學探針，4°C避光保存。
[0010]優選地，本發明所述的碳納米粒子修飾金電極制備包括以下步驟:用NaCOJfCNPs調節pH至7.0，移至2mL離心管在15000轉速下離心10min0離心產物用0.01M ρΗ7.0磷酸緩沖溶液洗滌3次。將產物用0.01M ρΗ7.0的磷酸緩沖溶液分散，取10 μ L滴在金電極表面得碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)，置陰涼處風干備用。
[0011]優選地，一種對多巴胺的檢測方法，其特征是:取20μ L10_5M的DNA2加入電化學探針(DNAl/Th/Au@PtNPs)溶液中，反應2h后，14000轉速下離心30min，用10mM，pH8.0磷酸緩沖溶液洗滌三次，再用ImL磷酸緩沖溶液分散。在2mL離心管中加入20 μ L上述溶液，再加入10 μ L —定濃度的多巴胺,反應30min后將碳納米粒子修飾金電極插入反應30min,用磷酸緩沖溶液沖洗。以上述修飾金電極作為工作電極，將電極插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸緩沖溶液中用循環伏安法或微分脈沖伏安法(DPV)測電信號(Ip)，電位增量0.0OlmV，脈沖寬度
0.05s，脈沖周期0.2s。
[0012]具體實驗原理如圖1所示。
[0013]碳納米粒子修飾金電極對電化學行為的影響如圖2所示。(a)無DA時CNPs/GE的 DPV 曲線；(b)在 10 μ L3.0X l(T6mol L-1DA 時 GE 的 DPV 曲線；(c)在 10 μ L3.0X l(T6molL^1DA 時 CNPs/GE 的 DPV 曲線
[0014]吸附時間對電化學信號強度的影響如圖3所示。
[0015]峰電流與多巴胺濃度的標準曲線圖如圖4所示。
[0016]電化學測定多巴胺的選擇性如圖5所示。
[0017]本發明中的檢測條件，具體特征如下:
[0018]多巴胺與DNA2修飾的探針作用后，將碳納米粒子修飾金電極插入溶液，碳納米粒子修飾金電極將吸附生成的探針，吸附時間對電化學信號有著極大的影響。考察了吸附時間對電化學信號的影響。結果如圖3所示，用吸附時間和電化學信號作圖，從圖中可以看出，在10到40min內，電化學信號隨著吸附時間的增加而增加，當吸附時間繼續增加到50min,60min時，電化學信號趨于平穩。表明吸附時間最優為50min。
[0019]分析性能如下:
[0020]本發明在最佳條件下，考察了多巴胺的濃度與電化學信號強度的關系。由圖4可看出，多巴胺的濃度在3.0X 10_8~3.0X 10_6M范圍內與電化學信號強度呈一定的線性關系，其線性回歸方程是Ip = 1.942C+3.6X10_7(IP是體系的電化學信號強度；C是多巴胺的濃度，η = 9)，線性相關系數R = 0.9981，檢測限是1.0X 10-8Μ(3 σ )。該方法的精密度通過對濃度為3.0Χ10_7Μ的多巴胺進行11次平行測定而計算得出，相對標準偏差為3.1 %。表明本法有較好的重現性。
[0021]方法的選擇性。選擇抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)作為對檢測多巴胺選擇性的對比物。將電化學方法檢測濃度為3.0X10_5mol L—1的AA和UA，3X10_7mol L—1的DA。電流強度如圖5所示,可以看出，檢測3.0X l(T5mol L-1的AA和UA的電流強度遠遠低于檢測3X l(T7molL—1的DA電流強度，說明該電化學方法具有很高的選擇性來檢測多巴胺。
[0022]與現有技術相比，本發明涉及的電化學測定多巴胺的方法具有如下優點和顯著的進步:金-鉬納米粒子提供相對大的比表面積用于負載電化學試劑，使得本發明設計的電化學測定多巴胺的方法具有高靈敏度。另外，利用適體的識別作用，通過檢測探針上電化學物質的電化學信號間接測定多巴胺，而不是直接測定多巴胺的電化學信號；根據實驗電化學信號強度(圖5)可以看出，當本發明的電化學測定多巴胺的方法用于檢測抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)時，其電化學信號強度遠遠低于檢多巴胺的電化學信號強度，這說明該方法具有很高的選擇性檢來測多巴胺。因此，本發明涉及的電化學方法在構建檢測小分子化合物的研究方法中體現出良好的發展前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為實驗原理圖。
[0024]圖2為碳納米粒子修飾金電極對電化學行為的影響。
[0025]圖3為吸附時間對電化學信號強度的影響。
[0026]圖4為多巴胺濃度的標準曲線圖。
[0027]圖5為電化學方法檢測多巴胺的選擇性。
【具體實施方式】
[0028]下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。
[0029]實例:一種基于適體識別作用電化學測定多巴胺的方法
[0030]1.實驗部分
[0031]1.1儀器與試劑
[0032]CHI660B電化學工作站(上海辰華儀器公司)；Anke-TGL_16C飛翁牌高速離心機(上海市安亭科學儀器廠)；PHS-3D型酸度計(上海雷磁儀器廠)；實驗采用三電極系統:金電極及修飾金電極為工作電極，Ag/AgCl (飽和KCl)電極為參比電極，鉬絲電極為對電極。
[0033]NaH2PO4.2H20,天津市廣成化學試劑有限公司；Na2HP04.12H20,天津市紅巖化學試劑廠；三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)，氯金酸(HAuCl4),檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7)均購于天津市博迪化工有限公司；鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])，天津市博迪化工有限公司；亞鐵氰化鉀(K4[Fe (CN)6].3Η20)，天津市廣成化學試劑有限公司；氧化鋁粉末(a-Al2O3)，多巴胺(DA)，硫堇(Th)購自上海阿拉丁試劑公司。
[0034]所用人工合成DNA序列(北京賽百盛生物工程有限公司購得)如下:
[0035]優選的DNAl 部分序列:5’ -GTG TTC TCT GGC GCA CAC AGA GAC ACA GAA TGA GGCCC-HS-3，；
[0036]優選的DNA2 部分序列:5’ -GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGGCCA GCA CAG AAT GAG GCC C-3，。
[0037]1.2實驗步驟
[0038]1.2.1金-鉬納米粒子的制備[0039]把制備和儲備金膠溶液所用的玻璃容器(容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶)用王水泡30min，然后用二次水沖洗烘干備用。在IOOOmL圓底燒瓶中加入50mLlmM的HAuCl4，攪拌加熱至沸騰，然后快速加入5mL38.8mM的檸檬酸鈉(NaC6H5O7)，溶液變為酒紅色時，向溶液中依次加入5mL4.0X IO-3Iii0IL-1的HPtCl6, lSmLlOgL—1的PVP，攪拌加熱至沸騰后繼續加熱2h。溶液由酒紅色變為棕褐色，制得AuOPtNPs，轉移至棕色瓶，4°C儲存備用。
[0040]1.2.2碳納米粒子的制備
[0041]把制備、儲備碳納米粒子(CNPs)所用的玻璃容器(容量瓶、棕色廣口瓶、圓底燒瓶)用王水(HCl =HNO3 = 1:3)泡30min，然后用二次水沖洗烘干備用。在IOOmL圓底燒瓶中加入60mL5M的HNO3和0.3g活性炭，加熱沸騰后，繼續回流12h，轉移至棕色廣口瓶，置陰涼避光處保存。
[0042]1.2.3電化學探針的制備
[0043]首先，取2mL的離心管，加入10 μ LKT5M的DNAl和10 μ L pH5.2500mM的醋酸緩沖溶液，和10 μ LlOmM的TCEP反應lh，用以活化巰基。然后，另取2mL離心管依次加入ImLAuiPtNPs和100 μ LlO-4M的硫堇溶液反應0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上。將吸附了硫堇的AuOPtNPs加入到活化好的巰基DNAl中，放入搖床輕搖反應16h。使巰基DNAl與AuOPtNPs通過Au-S鍵連接起來。再向體系中加入0.1M NaCl放置24h后在15000轉速下，離心30min，得到紅色沉淀，并用IOmM pH8.0的磷酸緩沖溶液洗滌三次，分散在IOmM pH8.0的磷酸緩沖溶液中得到DNAl/Th/AuOPtNPs電化學探針，4°C避光保存。
[0044]1.2.4電化學檢測多巴胺方法的構建
[0045]1.2.4.1金電極的預處理
[0046]用NaCOJf制得的CNPs調節pH至7.0，移至2mL離心管在15000轉速下離心IOmin。離心產物用0.0lM pH7.0磷酸緩沖溶液洗滌3次。將產物用0.0lM pH7.0的磷酸緩沖溶液分散，取10 μ L滴在金電極表面得碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)，置陰涼處風干備用。
[0047]1.2.4.2電化學方法對多巴胺的檢測
[0048]取20 μ LKT5M的DNA2加入上述電化學探針中，反應2h后，14000轉速下離心30min，用10mM，pH8.0磷酸緩沖溶液洗滌三次，再用ImL磷酸緩沖溶液分散。在2mL離心管中加入20 μ L上述溶液，再加入10 μ L —定濃度的多巴胺，反應30min后將碳納米粒子修飾金電極插入，30min后用磷酸緩沖溶液沖洗。以上述所得金電極作為工作電極，將三電極體系插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸緩沖溶液中測電信號。實驗采用DPV測定電化學信號，電位增量
0.0OlmV，脈沖寬度0.05s，脈沖周期0.2s。
[0049]1.3結果與討論
[0050]1.3.1實驗原理
[0051]圖1描述了以硫堇為電化學信號標記物檢測多巴胺的電化學適體技術工作原理。首先將電化學標記物硫堇吸附在Au@PtNPs表面，再將巰基DNAl固定在AuOPtNPs表面，得電化學探針(DNAl/Th/Au@PtNPs);再將電化學探針溶液中加入多巴胺適體鏈DNA2，DNAl與DNA2發生互補配對，得DNA2修飾的電化學探針(DNA2/DNAl/Th/Au@PtNPs)；當向DNA2修飾的探針溶液中加入多巴胺后，適體鏈DNA2優先與多巴胺結合，導致重新生成了電化學探針DNAl/Th/AuiPtNPs ;然后將碳納米粒子修飾的金電極(CNPs/GE)浸入重新生成的電化學探針DNAl/Th/Au@PtNPS溶液中，由于碳納米粒子與單鏈DNAl的吸附作用，電化學探針吸附于電極表面，在磷酸緩沖溶液中測電化學信號，通過電化學信號強弱實現對多巴胺的定量測定。AuOPtNPs上吸附大量的硫堇，實現了信號的放大；多巴胺只與多巴胺適體作用，方法具有聞的選擇性。
[0052]1.3.2碳納米粒子修飾金電極對電化學行為的影響
[0053]如圖2所示，做了對照試驗來研究修飾金電極對檢測多巴胺靈敏度的影響。首先，將適體鏈DNA2加入到電化學探針體系中，反應2h后得雜交產物，取20 μ L雜交產物加入2mL離心管，再加入10 μ L 二次水，30min后浸入CNPs/GE反應30min，取出電極，放入0.1MPH7.4的磷酸緩沖緩沖溶液中采用DPV測電信號，所得曲線如圖中a。b是在雜交產物中加入10yL3.0X10—6多巴胺，反應30min后插入GE，后所得DPV圖。C是向雜交產物中加
10μ L3.0X 10_6多巴胺，插入CNPs/GE，所測得DPV圖。通過a與c的對照表明，向體系中加入多巴胺明顯引起電信號的增加，b與c的對照表明CNPs/GE比GE具有更高的靈敏度，這是由于CNPs修飾金電極增加了電極對單鏈DNA的吸附能力。
[0054]1.3.3吸附時 間對電化學信號強度的影響
[0055]多巴胺與其適體結合引起適體互補鏈釋放，釋放越多，與電極發生吸附的探針就越多，經過AuOPtNPs的放大作用，最終得到增強的電信號。不同的吸附時間可能引起吸附量的明顯差異，從而影響電化學信號的明顯不同。為了選擇合適的吸附時間，考察了吸附時間對電化學信號的影響。實驗結果如圖3所示，對吸附時間和電化學信號作圖，從圖中可以看出，在10到40min內，電化學信號隨著吸附時間的增加而增加，當吸附時間繼續增加到50min時，電化學信號趨于平穩。表明在50min時，DNAl/Th/Au@PtNPs在CNPs/GE上的吸附趨于飽和。
[0056]1.3.4方法的線性范圍與檢出限
[0057]由圖4可看出，在最佳的實驗條件下，多巴胺的濃度在3.0Χ10-8~3.0X 10-6Μ范圍內與電化學信號強度呈一定的線性關系，其線性回歸方程是Ip = 1.942C+3.6 X 10_7 (Ip是體系的電化學信號強度；C是多巴胺的濃度，η = 9)，線性相關系數R = 0.9981，檢測限是
1.0X 10_8Μ(3 σ )。該方法的精密度通過對濃度為3.0X 10_7Μ的多巴胺進行11次平行測定而計算得出，相對標準偏差為3.1 %。表明本法有較好的重現性。
[0058]1.3.5電化學方法檢測多巴胺的選擇性
[0059]同時，考察了該電化學方法測定多巴胺的選擇性。選擇抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)作為電化學方法檢測多巴胺選擇性的對比物(Sample)。檢測濃度為3.0X 10_5mol L—1的AA和UA，3 X 10-7mOI L-1的多巴胺。所的電流強度如圖5所示，可以看出，檢測3.0X 10_5mol L-1的AA和UA的電流強度遠遠低于檢測3 X 10_7mol L-1的多巴胺電流強度，說明該電化學方法具有很高的選擇性檢測多巴胺。
[0060]L 4樣品測定
[0061]根據發明的方法對樣品中多巴胺含量進行了測定，并采用標準加入法對方法進行了評價，測定結果見表1，樣品測定回收率為95.0-102.0%，本發明的方法在多巴胺檢測中具有精密度高的特點。
表1.樣品分析測定結果
【權利要求】
1.一種基于適體識別作用電化學測定多巴胺的方法，包括如下步驟: (1)取2mL的離心管，加入I~30μ LKT5M的DNAl和10 μ L ρΗ5.2的500mM的醋酸緩沖溶液，和10 μ LlOmM的三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)反應lh，用以活化巰基；然后，另取2mL離心管依次加入直徑15nm，ImL的AuOPtNPs和100 μ LKT4M的硫堇溶液反應0.5h，使硫堇吸附在金-鉬納米粒子上；將吸附了硫堇的AuOPtNPs加入到活化好的巰基DNAl中，放入37°C搖床輕搖反應8~32h ;使巰基DNAl與AuOPtNPs連接起來；再向體系中加入0.1MNaCl放置24h后在15000轉速下，離心30min，得到紅色沉淀，并用10mMpH8.0的磷酸緩沖溶液洗滌三次，分散在lOmM，pH8.0的磷酸緩沖溶液中得到DNAl/Th/Au@PtNPs電化學探針； (2)用NaCO3將CNPs調節pH至7.0,移至2mL離心管在15000轉速下離心10min ;離心產物用0.01M, pH7.0磷酸緩沖溶液洗滌3次；將產物用0.01M, pH7.0的磷酸緩沖溶液分散，取10 μ L滴在金電極表面得碳納米粒子修飾金電極(CNPs/GE)； (3)取5~40μ LKT5M的DNA2加入電化學探針(DNAl/Th/Au@PtNPs)溶液中，反應0.5~4h后，14000轉速下離心30min，用10mM，pH8.0磷酸緩沖溶液洗滌三次，再用ImL磷酸緩沖溶液分散；在2mL離心管中加入20 μ L上述溶液，再加入2~20 μ L —定濃度的多巴胺，反應30min后將碳納米粒子修飾金電極插入反應10~60min,用磷酸緩沖溶液沖洗后測定電化學信號；
所述的 DNAl 的部分序列為:5’ -GTG TTC TCT GGC GCA CAC AGA GAC ACA GAA TGA GGCCC-HS-3，；
所述的 DNA2 的部分序列為:5’ -GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGGCCA GCA CAG AAT GAG GCC C-3，。
2.根據權利要求1所述的測定電化學信號，其特征在于:以上述修飾金電極作為工作電極，將電極插入0.1Μ，ρΗ7.4的磷酸緩沖溶液中用循環伏安法或微分脈沖伏安法(DPV)測電信號，電位增量0.0OlmV，脈沖寬度0.05s，脈沖周期0.2s。
3.根據權利要求1所述的碳納米粒子的制備，其特征在于:在IOOmL圓底燒瓶中加入10~120mL8M的HNO3和0.3g活性炭，加熱沸騰后，繼續回流2~24h，即得。
4.根據權利要求1所述的一種基于適體識別作用電化學測定多巴胺的方法在檢測多巴胺含量中的應用。
【文檔編號】G01N27/30GK104020199SQ201410272481
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】混旭, 張云飛, 劉芳, 柏莉 申請人:青島科技大學
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