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抗牛γ干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒及其制備方法
【專利摘要】抗牛γ干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒及其制備方法，屬于生物技術檢測領域，從雜交瘤細胞株BovinIFNgamma-3E1分泌獲得抗牛γ干擾素單克隆抗體3E1，從雜交瘤細胞株BovinIFNgamma-6E5分泌獲得抗牛γ干擾素單克隆抗體6E5，將抗牛γ干擾素單克隆抗體3E1包被在酶標板上，在抗牛γ干擾素單克隆抗體6E5上標記酶。以此制備具有包被抗牛γ干擾素單克隆抗體3E1的酶標板和酶標記抗牛γ干擾素單克隆抗體6E5的檢測牛γ干擾素的雙抗體夾心ELISA試劑盒，具有操作簡便，不需要精密儀器，普通實驗室即可進行的特點。
【專利說明】抗牛Y干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術檢測領域，具體涉及一種檢測牛Y干擾素的雙抗體夾心ELISA試劑盒。
【背景技術】
[0002]干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質(主要是糖蛋白)，一般由干擾素誘導劑誘導產生，它是一種由單核細胞和淋巴細胞產生的細胞因子，其類型分為三類，α-(白細胞)型、(成纖維細胞)型，Y-(淋巴細胞)型；它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節免疫功能等多種生物活性。干擾素可增強自然殺傷細胞(NK細胞)、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節作用，并增強抗病毒能力。
[0003]干擾素(IFN)作為一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產生抗病毒蛋白，從而抑制病毒的復制。
[0004]牛結核病是由牛結核分枝桿菌所引起的一種慢性消耗性傳染病，可通過病畜傳播給人類或其它動物。結核病除了感染人外，還能感染50多種哺乳動物和20多種禽類。牛結核病在世界各國均有發生，在我國依然是常見的多發性疾病，其傳播流行不但影響到畜牧業的持續發展，更嚴重影響著人類的健康。目前，國內外用于診斷牛結核病的檢驗方法，大體上可分為三類:一是細菌學檢驗方法，如涂片鏡檢、細菌培養和動物接種等；第二類為采用分子生物學檢驗方法，如生物探針法、PCR法等；第三類是采用免疫學方法檢測，如皮內變態反應、ELISA和ELISP0T法等。皮內變態反應曾在牛結核病的診斷與防治過程中發揮了重要的作用，但該方法的欠缺之處在于干擾結核病檢疫的因素很多，既有物理性的，也有化學性的，更多的是非典型分支桿菌的干擾，因為各分支桿菌均表現出相互交叉的變態反應，常造成非特異性反應的發生。世界各國都傾力于牛結核病的快速診斷方法研究，建立了一些新型、快速、準確、可靠的檢測方法，并在這個領域取得了矚目的進展。20世紀90年代Wood等證明牛結核分枝桿菌侵染機體后會刺激機體淋巴細胞形成記憶淋巴細胞，使淋巴細胞致敏，將無菌采集到的牛血用牛結核分枝桿菌的特異性抗原(BPPD)再次刺激，就會導致全血中的致敏淋巴細胞被活化，釋放出大量的Y-干擾素，因此可以通過檢測牛全血上清中的Y-干擾素來達到檢測牛結核病的目的。這種全血Y干擾素測定法已顯示出能為人、猴、牛、水牛、綿羊和山羊等動物一系列疾病的診斷提供快速靈敏的手段，并且牛Y干擾素測定法的廣泛性田間試驗已在世界上許多國家(包括澳大利亞、愛爾蘭、新西蘭、阿根廷、西班牙、意大利和美國)完成，正逐步取代結合菌素皮內試驗，Y-干擾素診斷法的敏感性為81.8%?100%，特異性為94%?100%，比皮試更敏感。然而，建立快速、準確、敏感、特異以及簡便的診斷方法的關鍵是高特異性和親和力的單克隆抗體的獲得。

【發明內容】

[0005]本發明目的是提供一種快速、準確、敏感、特異以及簡便的診斷方法的檢測牛Y干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒。[0006]本發明包括:
(1)包被抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1(捕獲抗體)的酶標板；
(2)酶標記抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5(檢測抗體)；
其中，包被在酶標板的抗牛Y干擾素單克隆抗體與酶標記抗牛Y干擾素單克隆抗體分別針對牛Y干擾素不同表位。
[0007]此外，本發明試劑盒還可以包括以下試劑中的一種或多種:稀釋液、洗滌液、底物顯色液、終止液等。
[0008]運用本發明檢測試劑盒可檢測天然的牛Y干擾素，以及人工表達的重組牛Y干擾素。本發明為牛細胞免疫研究和牛結核病的快速檢測提供了可靠的手段。本發明試劑盒便于操作、使用成本低、重復性好，適合大規模推廣應用。
[0009]本發明以合成肽和GST-牛Y干擾素純化的蛋白作為抗原制備抗牛Y干擾素單克隆抗體，得到一系列不同抗原表位的單克隆抗體，通過進一步篩選，結果獲得2株針對牛Y干擾素抗原不同表位的雜交瘤細胞株，該細胞株分泌的單克隆抗體效價高，特異性強，檢測反應性效果好。
[0010]本發明為牛Y干擾素的快速檢測提供了可靠的手段。該試劑盒操作簡便、快速，可以用于牛細胞免疫學研究和牛結核病的快速檢測。適用于高等學校，科研單位、市級以上獸醫部門和出入境檢驗檢疫局的科學研究和牛結核病的檢測。該方法所需成本低廉，經濟效益顯著、應用前景廣泛。
[0011]本發明還提出以上試劑盒的制備方法:` 從雜交瘤細胞株Bovin IFN gamma_3El分泌獲得抗牛、干擾素單克隆抗體3E1,從雜交瘤細胞株Bovin IFN gamma_6E5分泌獲得抗牛、干擾素單克隆抗體6E5,將抗牛、干擾素單克隆抗體3E1包被在酶標板上，在抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5上進行酶標記。
[0012]包被在酶標板的抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1為雜交瘤細胞株Bovin IFNgamma-3El (分類命名:雜交瘤細胞株，保藏號:CGMCC N0.7105)分泌獲得；酶標記抗牛、干擾素單克隆抗體6E5為雜交瘤細胞株Bovin IFN gamma-6E5 (分類命名:雜交瘤細胞株，保藏號:CGMCC N0.7104)分泌獲得。
[0013]本發明所述酶標記抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5，是采用商品化酶標記試劑盒通過辣根過氧化物酶標記而成。
[0014]單克隆抗體可按照如下方法包被到酶標板:將單克隆抗體用碳酸氫鈉緩沖液稀釋到0.35Pg/mL，按?οομL孔加入到酶標板中，4°C放置12_16h，用PBST洗滌后，用5%脫脂乳、350μL7孔，37 °C封閉2h，再用PBST洗滌。
【具體實施方式】
[0015]以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
[0016]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0017]1.抗牛Y干擾素單克隆抗體的細胞株
抗牛Y干擾素單克隆抗體細胞株Bovin IFN gamma_3El,分類命名:雜交瘤細胞株，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保藏號=CGMCC N0.7105，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0018]抗牛Y干擾素單克隆抗體細胞株Bovin IFN gamma_6E5,分類命名:雜交瘤細胞株，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保存，保藏號=CGMCC N0.7104，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
[0019]包被在酶標板的抗牛Y干擾素單克隆抗體為上述雜交瘤細胞株Bovin IFNgamma-3El (細胞保藏號:CGMCC N0.7105)分泌獲得。
[0020]酶標記抗牛Y干擾素單克隆抗體為上述雜交瘤細胞株Bovin IFN gamma_6E5(細胞保藏號=CGMCC N0.7104)分泌獲得。[0021]2.抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1和6E5的制備
(I)將保存的能分泌抗牛Y干擾素單克隆抗體雜交瘤細胞株Bovin IFN gamma_3El(分類命名:雜交瘤細胞株，保藏號=CGMCC N0.7105)的細胞株從液氮中取出，37°C復蘇，待細胞生長狀態良好后，準備制備小鼠腹水抗體。即取10周齡Balb/c母鼠，腹腔注射石蠟油，每只注射0.5ml，10天后，取用DMEM培養基稀釋雜交瘤細胞，每只小鼠腹腔注射300萬雜交瘤細胞，待小鼠腹部明顯膨大后采腹水，將采集的腹水1000Orpm離心5min，取上清，于_20°C保存。用protein G親和柱純化抗體并測定濃度和效價，分裝，_70°C凍存。
[0022](2)將保存的能分泌抗牛Y干擾素單克隆抗體雜交瘤細胞株Bovin IFNgamma-6E5 (分類命名:雜交瘤細胞株，保藏號:CGMCC N0.7104)的細胞株從液氮中取出，37°C復蘇，待細胞生長狀態良好后，準備制備小鼠腹水抗體。即取10周齡Balb/c母鼠，腹腔注射石蠟油，每只注射0.5ml, 10天后，取用DMEM培養基稀釋雜交瘤細胞，每只小鼠腹腔注射300萬雜交瘤細胞，待小鼠腹部明顯膨大后采腹水，將采集的腹水1000Orpm離心5min，取上清，于_20°C保存。用protein G親和柱純化抗體并測定濃度和效價，分裝，_70°C凍存。
[0023]3.抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5的酶標記
用Thermo公司的辣根過氧化物酶標記試劑盒對純化好并能與天然牛Y干擾素反應的單抗6E5進行標記。具體的步驟如下:將Img的IgG溶于體積為0.5-lml的PBS中；再將Img 的 lyophilized EZ-Link Plus Activated Peroxidase 溶解在 100mL 的去離子水中，然后將IgG加到其中；即刻加入10μ1的Sodium Cyanoborohydride于反應體系中，讓其室溫反應I小時；然后加入20μ1 quenching Buffer,讓其室溫反應15分鐘；將標記好的樣品用GE公司的Protein G柱純化。
[0024]4.酶標板包被抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1
(1)將抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1用碳酸鹽緩沖液稀釋至0.35Pg/mL，取100μL7孔的量加入ELISA板中，4°C包被約12h，再37°C水浴包被30~60 min ；
(2)棄包被液，IXPBST洗滌I次，加入5%的脫脂乳，37°C水浴，封閉2h；
(3 )棄去封閉液，用I X PBST洗滌3次，待檢測用。
[0025]5.天然牛Y干擾素的誘導產生 牛全血培養
①米血
無菌采集至少5mL牛血液，抗凝，輕輕顛倒幾次充分混合。采血后30個小時內進行培養。注:抗凝血不能貯存于冰箱中。[0026]②血液培養
血液培養前輕輕顛倒，充分混勻。由于本試驗需要活的淋巴細胞，因此需要將細胞損傷降至最低。將抗凝血加入24孔培養板，每頭動物加兩孔，每孔1.5mL (見下表)。用一次性自動移液器或吸管在無菌條件下進行操作。
[0027]吸取血液或刺激原至24孔培養板的推薦操作
【權利要求】
1.抗牛Y干擾素雙抗體夾心ELISA試劑盒，其特征在于包括: 1)包被抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1的酶標板； 2)酶標記抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5; 其中，包被在酶標板的抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1與酶標記抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5分別針對牛Y干擾素不同的抗原表位。
2.如權利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征在于:從雜交瘤細胞株BovinIFNgamma_3El分泌獲得抗牛\干擾素單克隆抗體3E1,從雜交瘤細胞株Bovin IFN gamma_6E5分泌獲得抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5，將抗牛Y干擾素單克隆抗體3E1包被在酶標板上，在抗牛Y干擾素單克隆抗體6E5上進行酶標記。
【文檔編號】G01N33/68GK103869084SQ201410132953
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月3日 優先權日:2014年4月3日
【發明者】秦愛建, 黃健, 邵紅霞, 錢錕, 黃大盧 申請人:揚州大學