一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法
【專利摘要】本發明公開了一種為斑馬魚應用于中藥安全性評價和魚類生理學的研究提供基礎資料的藥物功效評價方法，包括如下步驟，1)、試驗材料的準備：a）、藥品，b）、實驗儀器，c）、實驗魚馴養；2)、試驗方法：a）、設置濃度梯度，b）、排除消化過程差異，c）、藥物處理，d）、實驗魚恢復平靜，e）、記錄窒息時間的準備，f）、記錄窒息時間，g）、實驗魚的乳酸的測定，h）、計算實驗魚體內乳酸的含量，i）、實驗魚的乳酸脫氫酶的測定，j）、統計分析。通過本發明，證明斑馬魚應用于中藥藥物篩選安全性評價是可行的，本研究可為斑馬魚應用于中藥安全性評價和魚類生理學的研究提供基礎資料。
【專利說明】一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種藥物功效的評價方法，特別是涉及一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法。
【背景技術】
[0002]紅景天系薔薇目景天科(Crassulaceae)紅景天屬(Rhod1la L.),多年生草本或亞灌木野生植物，因花、根、莖之浸液均成紅色而得名。主要生長于高寒、缺氧、狂風、紫外線照射強、晝夜溫差大、海拔2000?5000m的巖石縫隙和高山礫石中，惡劣的生存環境使紅景天從遺傳上具備了特殊的適應性物質，是一種珍稀的藥用植物。
[0003]在藥物的開發過程中，臨床應用之前的藥物藥效篩選和安全性評價是一個重要的環節。目前藥物非臨床安全性評價研究主要包括體內(動物)實驗和體外(細胞、分子)實驗。體內毒性試驗周期長，藥物用量大，操作難度大，不利于少量藥物的快速毒性篩選。而體外細胞實驗不能精確地模擬藥物在體內的真實過程，實驗結果往往難以在體內得到重現。要解決新藥開發過程中的瓶頸問題，就要建立經濟、快速、有效的毒性評價動物模型，進行體外大規模篩選，建立哺乳動物鑒定之前的中間驗證體系。
[0004]斑馬魚由于其自身的特點，可克服體外細胞和化學篩選模型的局限性，在短期內進行大規模藥物篩選，觀察藥物對多種復雜生理過程的效果,從整體上直觀地評估藥物的治療效果、不良反應及毒副作用；能夠更便捷地獲得實驗數據，明顯縮短研發周期，降低研發成本，加快新藥開發過程。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一種為斑馬魚應用于中藥安全性評價和魚類生理學的研究提供基礎資料的藥物功效評價方法。
[0006]為實現上述目的，本發明提供了一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法，其包括如下步驟:
1)、試驗材料的準備:
a)、藥品:由三普藥業股份有限公司銷售三普紅景天膠囊。由南京建成生物工程研究所銷售的乳酸測定試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒；
b)、實驗儀器:可見光分光光度計，酶標儀；
C)、實驗用魚馴養:以購自廣東的斑馬魚作為實驗魚，首先進行為期4周的馴養實驗，以小型顆粒飼料為餌料，培養在水溫25°C，溶氧大于6.5mg/L，光制為12:12的環境中；
2)、試驗方法:
a)、設置濃度梯度，設置6個處理實驗的紅景天濃度梯度各為Omg/L、0.01mg/L、
0.02mg/L、0.04mg/L、0.08mg/L和0.16mg/L，各處理實驗的實驗魚數量為20條；
b)、排除消化過程差異，實驗前，斑馬魚禁食24h以排除消化過程差異，然后隨機選取實驗魚分配到各處理組； C)、藥物處理，紅景天水溶液置于IL玻璃燒杯中，然后于恒溫25°C水浴控制溫度，采用小型氣泵充氧，往水體中放入實驗魚后立即以塑料篩網罩住燒杯杯口 ；
d)、實驗魚恢復平靜，藥物處理結束后，小心移出斑馬魚，移出后的斑馬魚逐個放入預先注入恒溫養殖水的25mL小口玻璃瓶中，充滿水后，用塑料篩網罩住玻璃瓶口，放入恒溫水浴，適應lOmin，使實驗魚恢復平靜；
e)、記錄窒息時間的準備，用小塑料管向玻璃瓶內注入飽和溶氧養殖用水，1s內使瓶內的水全部被換出后，蓋緊橡膠塞，并以秒表開始計時；
f)、記錄窒息時間，直至實驗魚身體失去平衡發生側翻時，記錄時間，為窒息時間；為消除個體大小對實驗結果的影響，對體重差異進行了以下校正:ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25-m),其中ts為校正后時間，ti為校正前時間為體重；將各濃度梯度試驗校正后的時間ts與對應濃度關系制作成標準曲線；
g)、實驗魚的乳酸的測定，把用于測定缺氧窒息的實驗魚在實驗結束后，在低于4攝氏度的環境中制成生理鹽水勻漿液，再將此生理鹽水勻漿液稀釋10倍后離心取上清液，再將此上清液稀釋5倍，再用乳酸測試盒按步驟加樣，最后在530nm波長時用可見光分光光度計測其吸光值，并制作計算乳酸含量的標準曲線；
h)、計算實驗魚體內乳酸的含量，采用以下方法計算實驗魚體內乳酸的含量:
組織中乳酸的含量=c*50/1000
其中，c為通過乳酸含量的標準曲線計算得出的勻漿稀釋液乳酸濃度，計算后繪制出各濃度試驗的乳酸含量標準曲線圖。
[0007]i)、實驗魚的乳酸脫氫酶的測定，上步操作制得的斑馬魚生理鹽水勻漿液，離心取上清液，稀釋20倍，用乳酸脫氫酶測定試劑盒按步驟加樣，反應15min，用酶標儀在450nm波長時測其吸光度；并通過換算出每個濃度試驗中乳酸脫氫酶的濃度，制作各個濃度試驗中乳酸脫氫酶濃度的標準曲線。
[0008]j)、統計分析，采用單因素方差分析及多重比較分析不同濃度處理造成的差異。
[0009]優選的，所述的實驗魚平均體重在0.2g左右。
[0010]本發明的有益效果是:通過本發明，證明斑馬魚應用于中藥藥物篩選安全性評價是可行的，本研究可為斑馬魚應用于中藥安全性評價和魚類生理學的研究提供基礎資料。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為本發明一一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法的不同濃度紅景天溶液處理5天對斑馬魚窒息時間的影響曲線圖。
[0012]圖2為本發明一一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法的不同濃度紅景天溶液處理5天對斑馬魚缺氧窒息后體內乳酸含量的標準曲線圖。
[0013]圖3為本發明一一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法的不同濃度紅景天溶液處理5天對斑馬魚缺氧窒息后體內乳酸含量的影響曲線圖。
[0014]圖4為本發明一一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法的不同濃度紅景天溶液處理5天對斑馬魚缺氧窒息后體內乳酸脫氫酶活性的影響曲線圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明:
一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法，包括如下步驟:
一、試驗材料的準備:
1、藥品:由三普藥業股份有限公司銷售三普紅景天膠囊。由南京建成生物工程研究所銷售的乳酸測定試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒。
[0016]2、實驗儀器:可見光分光光度計,酶標儀。
[0017]3、實驗用魚:以購自廣東的斑馬魚作為實驗魚，首先進行為期4周的馴養實驗，以江門市蓬江區海豚水族有限公司生產的海豚熱帶魚糧微顆粒為餌料，培養在水溫25°C，溶氧大于6.5mg/L,光制為12:12的環境中。
[0018]二、試驗方法:
1、設置6個處理實驗的紅景天濃度梯度各為Omg/L、0.01mg/L、0.02mg/L、0.04mg/L、
0.08mg/L和0.16mg/L，各處理實驗的實驗魚數量為20條；
2、實驗前，斑馬魚禁食24h以排除消化過程差異，然后隨機選取實驗魚(平均體重0.2g左右)分配到各處理組；
3、紅景天水溶液置于IL玻璃燒杯中，然后于恒溫25°C水浴控制溫度，采用小型氣泵充氧，往水體中放入實驗魚后立即以塑料篩網罩住燒杯杯口 ；
4、藥物處理結束后，小心移出斑馬魚，移出后的斑馬魚逐個放入預先注入恒溫養殖水的25mL小口玻璃瓶中，充滿水后，用塑料篩網罩住玻璃瓶口，放入恒溫水浴，適應lOmin，使實驗魚恢復平靜；
5、用小塑料管向玻璃瓶內注入飽和溶氧養殖用水，1s內使瓶內的水全部被換出后,蓋緊橡膠塞，并以秒表開始計時；
6、直至實驗魚身體失去平衡發生側翻時，記錄時間，為窒息時間；為消除個體大小對實驗結果的影響，對體重差異進行了以下校正:ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25-m)，其中ts為校正后時間(min)，ti為校正前時間(min)，m為體重(g);將各濃度梯度試驗校正后的時間ts與對應濃度關系制作成標準曲線——圖1。
[0019]7、斑馬魚的乳酸和乳酸脫氫酶的測定，把用于測定缺氧窒息的實驗魚在實驗結束后，在低于4攝氏度的環境中制成生理鹽水勻漿液，再將此生理鹽水勻漿液稀釋10倍后離心取上清液，再將此上清液稀釋5倍，再用乳酸測試盒按步驟加樣(具體步驟按照南京建成生物工程研究所的乳酸測試盒使用說明書)，最后在530nm波長時用可見光分光光度計測其吸光值，并制作計算乳酸含量的標準曲線——圖2。
[0020]8、計算斑馬魚體內乳酸的含量:
采用以下方法計算斑馬魚體內乳酸的含量:
組織中乳酸的含量=c*50/1000
其中，c為通過圖2標準曲線計算得出的勻漿稀釋液乳酸濃度(mmol/L)，50為稀釋倍數(稀釋為體重的50倍，單位為g);并繪制出各濃度試驗的乳酸含量標準曲線圖——圖3。
[0021]9、上步操作制得的斑馬魚生理鹽水勻漿液，離心取上清液，稀釋20倍，用乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒按步驟加樣，反應15min，用酶標儀在450nm波長時測其吸光度；并通過換算出每個濃度試驗中乳酸脫氫酶(LDH)的濃度，制作標準曲線——圖4。具體的換算方法需參考查閱南京建成生物工程研究所的A020乳酸脫氫酶(LDH)測試盒說明書中的分析方法。
[0022]10、統計分析，數據采用Excel 2003進行運算，同時采用SPSS 13.0進行統計分析。采用單因素方差分析及多重比較(LSD)分析不同濃度處理造成的差異。
[0023]結果:
統計分析紅景天藥物處理5天，藥物濃度與斑馬魚窒息所用時間的關系，
由圖1可知，紅景天藥液處理5天之后，斑馬魚的窒息時間隨濃度增高呈現明顯的先增后降的趨勢，當處理濃度為0.02mg/L時達到最大值，與對照組差異性顯著。當處理濃度為0.04mg/L時,窒息時間最短,但與對照組差異不顯著。當處理濃度為0.08mg/L、0.16mg/L時，窒息時間與對照組也沒有明顯差異。
[0024]測定了缺氧窒息實驗后的斑馬魚體內乳酸的含量和乳酸脫氫酶(LDH)的活性，分析紅景天藥物處理濃度與斑馬魚體內乳酸的積累量、乳酸脫氫酶(LDH)活性的關系，得到圖
3、圖4所示的結果:
由圖3可知，用不同濃度的紅景天藥液處理5天，缺氧窒息后，隨著藥物處理濃度的增大，斑馬魚體內乳酸含量呈現先增高，后降低，再增高的變化趨勢。在處理濃度為0.01mg/L、
0.08mg/L時明顯地高于對照組，在處理濃度為0.04mg/L時低于對照組，乳酸含量的變化出現了兩個峰值，而其它濃度的處理組較對照組乳酸含量的變化不顯著。
[0025]由圖4可知，用不同濃度的紅景天藥液處理5天，缺氧窒息后，隨著藥物處理濃度的增大，斑馬魚體內乳酸脫氫酶(LDH)的活性呈現降低的趨勢，各藥物處理組之間差異不顯著，當藥物濃度大于0.02mg/L時，斑馬魚體內乳酸脫氫酶活性顯著低于對照組。
[0026]結論:
本發明中，隨藥物處理濃度增高，斑馬魚耐低氧能力先迅速增高，然后降低，二者關系呈鐘形曲線。低濃度處理后，斑馬魚耐低氧能力增強，提示紅景天對魚類有抗缺氧的效果，采用斑馬魚為實驗動物進行藥效評價應當可行。
[0027]本發明研究了缺氧窒息后斑馬魚體內乳酸含量和乳酸脫氫酶(LDH)的活性，當濃度為0.04mg/L時，乳酸含量顯著低于對照組，這說明紅景天在此濃度時起到了降低乳酸含量的作用。本實驗中LDH活性隨著濃度的增大而降低，說明紅景天可能通過降低LDH活力從而減少乳酸的生成，發揮抗疲勞的作用。
[0028]中藥藥物抗疲勞、抗缺氧藥性研究和安全性評價目前所用的實驗動物一般是小鼠，通過本實驗的研究，說明斑馬魚應用于中藥藥物篩選安全性評價是可行的，本方法可為斑馬魚應用于中藥安全性評價和魚類生理學的研究提供基礎資料。
[0029]南京建成生物工程研究所的A020乳酸脫氫酶(LDH)測試盒說明書中的分析方法:速率A ;主波長:340nm ;副波長:405nm ;樣品量:8.0ul ；R-1:320ul, R-2:80ul ;校準方式:K因子；反應方向:上升；測定溫度:37°C。
[0030]樣品與R-1混勻后反應5分鐘，加入R-2混合后延遲53秒，測定104秒。
[0031]計算:
Δ ABS/minXVtX1000
LDH(U/L)=-
6.22XVsXd Δ ABS/min =每分鐘平均吸光度變化； Vt =總反應體積(ml)；
1000 = U/ml到U/L的轉換系數；
6.22 = NADH的毫摩爾吸光系數；
Vs =標本體積(ml)； d =比色杯光徑(cm)。
[0032]以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術人員無需創造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術領域】中技術人員依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術方案，皆應在由權利要求書所確定的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)、試驗材料的準備: a)、藥品:由三普藥業股份有限公司銷售三普紅景天膠囊；由南京建成生物工程研究所銷售的乳酸測定試劑盒、乳酸脫氫酶試劑盒； b)、實驗儀器:可見光分光光度計，酶標儀； C)、實驗用魚馴養:以購自廣東的斑馬魚作為實驗魚，首先進行為期4周的馴養實驗，以小型顆粒飼料為餌料，培養在水溫25°C，溶氧大于6.5mg/L，光制為12:12的環境中； 2)、試驗方法: a)、設置濃度梯度，設置6個處理實驗的紅景天濃度梯度各為Omg/L、0.0lmg/L、0.02mg/L、0.04mg/L、0.08mg/L和0.16mg/L，各處理實驗的實驗魚數量為20條； b)、排除消化過程差異，實驗前，斑馬魚禁食24h以排除消化過程差異，然后隨機選取實驗魚分配到各處理組； C)、藥物處理，紅景天水溶液置于IL玻璃燒杯中，然后于恒溫25°C水浴控制溫度，采用小型氣泵充氧，往水體中放入實驗魚后立即以塑料篩網罩住燒杯杯口 ； d)、實驗魚恢復平靜，藥物處理結束后，小心移出斑馬魚，移出后的斑馬魚逐個放入預先注入恒溫養殖水的25mL小口玻璃瓶中，充滿水后，用塑料篩網罩住玻璃瓶口，放入恒溫水浴，適應lOmin，使實驗魚恢復平靜； e)、記錄窒息時間的準備，用小塑料管向玻璃瓶內注入飽和溶氧養殖用水，1s內使瓶內的水全部被換出后，蓋緊橡膠塞，并以秒表開始計時； f)、記錄窒息時間，直至實驗魚身體失去平衡發生側翻時，記錄時間，為窒息時間；為消除個體大小對實驗結果的影響，對體重差異進行了以下校正:ts=ti*(m/0.2)0.75*25/(25-m),其中ts為校正后時間，ti為校正前時間為體重；將各濃度梯度試驗校正后的時間ts與對應濃度關系制作成標準曲線； g)、實驗魚的乳酸的測定，把用于測定缺氧窒息的實驗魚在實驗結束后，在低于4攝氏度的環境中制成生理鹽水勻漿液，再將此生理鹽水勻漿液稀釋10倍后離心取上清液，再將此上清液稀釋5倍，再用乳酸測試盒按步驟加樣，最后在530nm波長時用可見光分光光度計測其吸光值，并制作計算乳酸含量的標準曲線； h)、計算實驗魚體內乳酸的含量，采用以下方法計算實驗魚體內乳酸的含量: 組織中乳酸的含量=c*50/1000 其中，c為通過乳酸含量的標準曲線計算得出的勻漿稀釋液乳酸濃度，計算后繪制出各濃度試驗的乳酸含量標準曲線圖； i)、實驗魚的乳酸脫氫酶的測定，上步操作制得的斑馬魚生理鹽水勻漿液，離心取上清液，稀釋20倍，用乳酸脫氫酶測定試劑盒按步驟加樣，反應15min，用酶標儀在450nm波長時測其吸光度；并通過換算出每個濃度試驗中乳酸脫氫酶的濃度，制作各個濃度試驗中乳酸脫氫酶濃度的標準曲線； j)、統計分析，采用單因素方差分析及多重比較分析不同濃度處理造成的差異。
2.如權利要求1所述的一種用斑馬魚對藥物功效的評價方法，其特征在于，所述的實驗魚平均體重在0.2g左右。
【文檔編號】G01N33/15GK104165975SQ201410300100
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年9月25日 優先權日:2014年9月25日
【發明者】范能全, 羅毅平, 彭蘭, 林艷華 申請人:重慶市食品藥品檢驗所
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
