国产自产21区,亚洲97,免费毛片网,国产啪视频,青青青国产在线观看,国产毛片一区二区三区精品

抗Lp(a)單克隆抗體及Lp(a)膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了抗Lp(a)單克隆抗體及Lp(a)膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒。本發明提供了一株微生物保藏號是：CGMCC?No.8509的穩定分泌抗Lp(a)單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發明雜交瘤細胞株能夠穩定地生產抗Lp(a)單克隆抗體，可以實現自身配對、特異性結合Lp(a)且與Kringle?IV-2無結合。LPa-3單抗所配Lp(a)試劑盒檢測病人血清樣本的試驗表明，用本發明抗Lp(a)單克隆抗體制備的膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒與市售試劑盒測值符合度高，準確度可靠，可以應用于Lp(a)的檢測。
【專利說明】抗Lp (a)單克隆抗體及Lp (a)膠乳增強免疫比濁檢測試劑
合
Si
【技術領域】
[0001]本發明涉及雜交瘤細胞株以及分泌的單克隆抗體，尤其涉及一種抗脂蛋白(a)[Lipoprtein (a)，Lp (a)]的單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株,本發明進一步Lp (a)膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒，屬于脂蛋白(a)的檢測領域。
【背景技術】
[0002]脂蛋白(a) [Lipoprotein (a) ,Lp (a)]是人體內一種獨特的脂蛋白，由低密度脂蛋白(LDL)樣微粒和載脂蛋白(a) [apolipoprotein(a)，apo(a)]組成。Apo (a)與纖溶酶原的基因高度同源，屬于人類纖溶酶原基因超家族成員。Apo (a)由多拷貝的纖溶酶原KringleIV樣的重復片斷和單拷貝的Kringle V和絲氨酸蛋白酶區域構成。Apo (a)有10種纖溶酶原Kringle IV樣的基序(命名為Kringle IV-1 ~Kringle IV-10),除了 Kringle IV-2外,每種Kringle IV都是單拷貝。Apo (a)多態性受基因控制，不同apo (a)亞型Kringle IV-2的拷貝數為3-40不等。關于Lp(a)的最大的流行病學研究已證明Lp (a)水平與心臟疾病和缺血性腦卒中存在連續的獨立的中等程度的相關，高Lp (a)作為心腦血管動脈粥樣硬化性疾病的獨立危險因素已得到公認。
[0003]Lp (a)濃度檢測常用的方法有雙抗體夾心ELISA法、免疫比濁法與膠乳增強免疫比濁法。這三種方法均需 要用到Lp (a)抗體，其中后兩種方法在臨床檢驗上應用更多，特別是膠乳增強免疫比濁法。由于Lp(a)分子量大，結構復雜，目前還無法通過人工表達手段制備Lp(a)抗原。多克隆抗體(多抗)制備用Lp(a)抗原只能從血清中純化制備，由于Lp (a)在不同人之間具有多態性，受血清來源的限制，Lp (a)抗原的批間差較難控制，最終導致Lp (a)多抗的批間差較大。另外，由于apo (a)分子Kringle IV-2拷貝數的差異，用針對該位點的單抗或多抗作為原料制備的試劑盒會受到抗原多態性的影響，造成檢測結果的不準確。
[0004]多克隆抗體(多抗)制備用Lp (a)抗原只能從血清中純化制備，由于Lp (a)在不同人之間具有多態性，受血清來源的限制，Lp (a)抗原的批間差較難控制，最終導致Lp (a)多抗的批間差較大。單克隆抗體(單抗)雖然不依賴Lp (a)抗原，但現有單抗要么識別多態性位點，要么需要與其他單抗進行配對使用。以膠乳增強免疫比濁試劑為例:試劑配制中，抗體種類的增加會相應的偶聯工序與濃度調整工序，工作量成倍增長，試劑盒性能差異變大的風險也會由此產生。
[0005]開發識別apo (a)分子Kringle IV_2以外抗原表位的單克隆抗體,可以很好解決抗體批間差大與apo (a)多態性影響的問題。

【發明內容】

[0006]本發明的目的之一是提供一株能生產自身配對，特異性結合Lp (a)，且能穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株；[0007]本發明的目的之二是提供由所述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體；
[0008]本發明的進一步目的是將該單克隆抗體應用于檢測Lp(a)并提供一種Lp(a)膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒。
[0009]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0010]本發明人用Lp(a)分子中的多態性片段Kringle IV_2為篩選抗原，采用間接ELISA法進行Lp(a)特異性單克隆抗體篩選，用棋盤法進行單抗的配對篩選，最終獲得了 I株能夠產生自身配對、特異性結合Lp (a)、且與Kringle IV-2無結合的單抗目標細胞株,從而完成了本發明。
[0011]本發明首先提供一株產生能自身配對、特異性結合Lp (a)且與Kringle IV_2無結合的抗Lp (a)單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[0012]本發明將所篩選得到的雜交瘤細胞株將其保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號=CGMCC N0.8509 ;分類命名為:脂蛋白(a)單克隆抗體雜交瘤細胞株；保藏日期:2013年11月20日；保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0013]本發明還提供了一種制備所述的雜交瘤細胞株的方法，包括:用Lp(a)分子中的多態性片段Kringle IV-2為篩選抗原，采用間接ELISA法和雙抗夾心ELISA法進行Lp (a)特異性單克隆抗體篩選的工序， 篩選得到所述雜交瘤細胞株。
[0014]本發明中的雜交瘤細胞株與抗Lp (a)單克隆抗體可以通過下文所述的方法產生。進一步，本領域的技術人員可以使用這些根據下文描述及本領域中已知技術改造過的更適合的方法。
[0015](I)免疫原的制備
[0016]本發明采用天然提取純化的Lp (a)分子為免疫原。可以是Lp (a)校準品抗原經過分子篩，如GE公司S-200填料分離純化得到，也可以是商品化的高純度Lp (a)天然抗原，還可以從Lp (a)含量較高的血清中按文獻方法進行制備。
[0017](2)檢測抗原的制備
[0018]檢測抗原包括Lp (a)天然抗原、APOB抗原和Lp (a)Kringle IV-2原核表達抗原。Lp (a)天然抗原、APOB抗原可以通過購買或其他方式獲得。Lp(a)Kringle IV-2通過原核表達純化獲得，具體的為:從NCBI網站上獲得Kringle IV-2的氨基酸序列(SEQ ID N0.2),用Vector NTI軟件反譯成大腸桿菌偏愛的密碼子基因序列(SEQ ID N0.1)，送外包公司進行全基因合成，插入表達載體中，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，進行誘導表達與蛋白純化。
[0019](3)單克隆抗體的制備
[0020]Lp (a)分子量大，容易誘導產生抗體，本發明采用Lp(a)天然抗原免疫小鼠，進行3-5次免疫。在最后一次免疫接種2-5天(優選3天)后收集脾細胞，將這些組織中產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞融合后選擇與Lp (a)具有特異性結合的雜交瘤，從而制備產單克隆抗體的細胞。
[0021]融合可以按照公知的方法進行，例如可以舉出如下方法:將脾細胞與瘤細胞按5-10:1的比例混合，離心去上清后，向沉淀物中加入融合促進試劑，然后用DMEM培養基終止融合促進試劑的作用。離心棄上清后細胞用合適體積的HAT培養基重懸，制成融合細胞，融合細胞在培養雜交瘤的孔格中進行培養。對于骨髓瘤細胞可以使用公知的骨髓瘤細胞，例如可以舉出 SP2/0-Agl4(SP2/0)、P3/X63_Ag8 (X63)、P3/X63_Ag8.653 (X63_Ag8.653)、P3/NS1-l-Ag4-l (NS-1)等小鼠來源的細胞系，其中優選為SP2/0。融合促進試劑可以為聚乙二
Si1450 (PEG1450)、聚乙二醇側(peg4_)等，優選為 peg145。。
[0022]單克隆抗體的選擇可以根據已知的方法進行。一般地是在添加有HAT的用于動物細胞的細胞培養基中進行的。用于選擇與培養的培養基例如可以舉出:體積比為5%-20%胎牛血清的DMEM或RPM1-1640培養基。細胞一般在5-10%C02氣體的環境中于36.5 0C -37.5°C，培養 10-14 天。
[0023]從培養雜交瘤的孔格中收集培養物的上清液，分泌目的抗體的培養孔可通過間接ELISA方法來選擇。首先，Lp (a)天然抗原反應、APOB抗原和Kringle IV-2等3種抗原被固定在96孔酶標板中，并用吐溫-20磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌酶標板，然后將培養上清樣品加入到不同抗原包被孔中，37°C溫育30分鐘后，加入1:10000稀釋的作為酶標二抗的羊抗鼠-HRP，37°C溫育30分鐘后加入過氧化氫脲-四甲基聯苯胺底物(H2O2-TMB)作為底物進行顯色，用酸終止反應后，測量450nm下的吸光值。
[0024]選取與Lp (a)天然抗原反應，而與APOB抗原和Kringle IV-2無反應的培養孔，通過公知的有限稀釋法進行克隆。通過培養該雜交瘤細胞株可以大量的獲得抗Lp (a)單克隆抗體。該抗Lp(a)單克隆抗體的獲取方法，大地可以劃分為兩種。一種是使用培養基，在燒瓶等培養容器中進行培養，從該上清液中獲取抗體的方法。例如為體積比是10%-20%胎牛血清的DMEM培養液。另一種方法是將用培養容器培養的雜交瘤細胞株通過同系小鼠體內誘生法接種到同系的動物中，來獲得抗Lp(a)的單克隆抗體。
[0025]本發明的采用間接ELISA法進行Lp (a)特異性單克隆抗體的篩選的工序中，
[0026]包括將抗原抗原固定在96孔酶標板中，并用吐溫-20磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌酶標板的包被酶標板；將培養上清樣品加入到不同抗原包被孔中，37°C溫育30分鐘后，用PBST洗滌酶標板的添加培養上清樣品的工序；加入1:10000稀釋的作為酶標二抗的羊抗鼠-HRP，37°C溫育30分鐘后用PBST洗滌酶標板的添加酶標二抗的工序；以及進行顯色的工序。
[0027]本發明的另一個目的在于提供一種由該雜交瘤細胞株所產生的抗Lp (a)單克隆抗體。本發明的雜交瘤細胞株能夠穩定地生產抗Lp (a)單克隆抗體，而由該雜交瘤細胞株產生的抗Lp (a)單克隆抗體可以實現自身配對、特異性結合Lp (a),且與Kringle IV-2無結合。由于該抗Lp(a)單克隆抗體能夠很好地滿足Lp (a)檢測的要求，因此可以應用于Lp (a)檢測試劑盒中。
[0028]因此，本發明提供了一種Lp (a)膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑I (Rl)與試劑2 (R2)組成；其中，Rl試劑I的成分包括緩沖液，防腐劑等；試劑2的成分包括緩沖液、牛血清白蛋白(BSA)或小牛血清(NCS)、偶聯有抗Lp (a)單克隆抗體的膠乳微球等。
[0029]具體的，試劑I的成分可以是:1) 10-50mM, pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)，0.02%-0.1% 疊氮鈉(NaN3)；或 2) 50-200mM, ρΗ7.4Tris_HCl 緩沖液，0.02%_0.l%NaN3 ；或3) 50-200mM, ρΗ7.4M0PS 緩沖液，0.02%_0.l%NaN3。優選為:20mM, ρΗ7.4 磷酸鹽緩沖液，
0.l%NaN30
[0030]試劑2的成分可以是，l)10-50mM，pH7.4磷酸鹽緩沖液，(λ 1-0.5%BSA或5_15%NCS，0.125%-0.25%偶聯有抗體的膠乳微球(抗體偶聯比:0.5-2mg/10mg膠乳微球；膠乳微球粒徑:80-200nm)；或 2) 50-200mM, pH7.4Tris-HCl 緩沖液，0.1-0.5%BSA 或 5_15%NCS，0.125%-0.25%偶聯有抗體的膠乳微球(抗體偶聯比:0.5-2mg/10mg膠乳微球；膠乳微球粒徑:80-200nm);或 3)50-200mM, ρΗ7.4M0PS 緩沖液，0.1-0.5%BSA 或 5_15%NCS，0.125%_0.25%偶聯有抗體的膠乳微球(抗體偶聯比:0.5-2mg/10mg膠乳微球；膠乳微球粒徑:80_200nm)；優選為:20mM，pH7.4磷酸鹽緩沖液，0.1%BSA，0.2%偶聯有抗體的膠乳微球(抗體偶聯比:lmg/10mg膠乳微球；膠乳微球粒徑:124nm)。
[0031]本發明的雜交瘤細胞株能夠穩定地生產抗Lp (a)單克隆抗體，而由該雜交瘤細胞株產生的抗Lp (a)單克隆抗體可以實現自身配對、特異性結合Lp (a),且與Kringle IV-2無結合。LPa-3單抗所配Lp (a)試劑盒檢測病人血清樣本的試驗表明，由本發明的抗Lp (a)單抗配制的檢測試劑盒與德賽公司Lp (a)試劑盒測值符合度高，準確度可靠，可以應用于Lp (a)試劑盒中。
[0032]本發明所涉及的術語定義
[0033]本發明所說的“Lp (a) ”除非特別說明，是指人血清或血漿中脂蛋白(a)及其相關產物，如的脂蛋白(a)前體、成熟形式或片段。
[0034]本發明所說的“特異性結合”是指抗Lp (a)單抗僅與Lp (a)結合，而不與載脂蛋白B (APOB)結合。
[0035]本發明所說的“抗體”是指能夠與完整的全長度的Lp (a)分子或Lp (a)片段特異性結合的單抗，或者這些抗體的部分片段。
[0036]本發明所說的自身 配對是指一種單抗能以兩個或以上的形式結合到同一個抗原分子上的現象，產生這種現象的原因是抗原分子上存在兩個或以上相同或相似的抗原表位。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為由LPa-3雜交瘤細胞株所產生的單抗應用于試劑盒中的相關性分析圖。具體實施例
[0038]下面結合具體實施方案來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。
[0039]實施例1雜交瘤細胞株的構建
[0040]用Lp (a)抗原免疫4只6周齡雌性Balb/c小鼠，首次免疫采用弗氏完全佐劑將抗原進行乳化，每只小鼠注射40ug抗原，然后采用弗氏不完全佐劑乳化抗原，以21天為間隔進行第2-3次免疫。完成3次免疫后眼眶采血檢測血清抗體效價，選取效價較高的小鼠進行細胞融合。融合前3天用不加佐劑的Lp (a)抗原對選定的小鼠進行沖擊免疫，3天后將小鼠斷頸椎處死，無菌分離脾臟，制備脾細胞懸液，將脾細胞與體外培養的SP2/0細胞按10:1比例混勻，離心洗滌后用PEG1450進行細胞融合，融合細胞培養8天，采用間接ELISA法對融合細胞培養上清進行篩選，檢測抗原為Lp (a)、APOB和Kringle IV-2。用0.05MpH9.6Na2C03-NaHC03 緩沖液將 Lp (a)、APOB 和 Kringle IV-2 稀釋至 lug/ml，三種抗原按列交叉包被，每孔IOOul加到酶標板中，4°C放置過夜，用0.15M pH7.4含0.05%吐溫-20磷酸鹽緩沖液(PBST)洗滌酶標板I次,完成抗原包被；將培養上清加到酶標板中，每個培養孔取樣3次，分別加到Lp (a)、APOB和KringleIV-2包被孔中，每孔60ul，37°C溫育30min，用PBST洗板2次；將HRP-羊抗小鼠IgG稀釋至工作濃度，每孔IOOul加到酶標板中，37°C溫育30min，用PBST洗板3次；加入TMB-H202底物，37°C避光顯色IOmin ;每孔加入50ul2MH2S04終止顯色，在酶標儀上讀取450nm的吸光值。選取與Lp (a)呈強陽性反應，但與APOB和Kringle IV-2呈陰性反應的培養孔克隆化，并建立雜交瘤細胞株。
[0041 ] 實施例2抗Lp (a)單抗的配對篩選 [0042]將克隆建株的Lp (a)單抗雜交瘤細胞用腹水法制備出Lp (a)單抗腹水,用ProteinG柱純化出Lp(a)單抗，過碘酸鈉法對Lp (a)單抗進行HRP標記，然后用棋盤法對各株Lp (a)單抗的配對特性進行分析。將各株Lp (a)單抗用0.05M pH9.6Na2C03-NaHC03緩沖液稀釋至5ug/ml,每孔IOOul包被酶標板,每種單抗包被I列孔條；用PBST將Lp (a)抗原稀釋成
0.lug/ml，每孔IOOul，37°C溫育30min，用PBST洗板2次；用PBST將各株單抗的HRP標記物稀釋至工作濃度，每種單抗標記物加入I排板孔，每孔IOOul，37°C溫育30min，用PBST洗板3次；加入TMB-H202底物，37°C避光顯色lOmin，每孔加入50ul2M H2S04終止顯色，在酶標儀上讀取0D450值。陽性反應孔對應的包被單抗與HRP標記單抗即為配對的單抗。選取配對效果較好的單抗作夾心ELISA法的初步應用。單抗配對篩選的數據見表1
[0043]表1Lp (a)單抗棋盤法配對分析結果
[0044]
【權利要求】
1.一株穩定分泌抗Lp (a)單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于，其微生物保藏號是:CGMCC N0.8509。
2.—種構建權利要求1所述雜交瘤細胞株的方法，其特征在于，包括:用Lp (a)分子中的多態性片段Kringle IV-2為篩選抗原，采用間接ELISA法和雙抗夾心ELISA法進行Lp (a)特異性單克隆抗體篩選得到所述雜交瘤細胞株。
3.由權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌的抗Lp(a)單克隆抗體。
4.權利要求3所述的抗Lp(a)單克隆抗體在制備檢測脂蛋白(a)試劑中的用途。
5.一種檢測脂蛋白(a)的試劑盒，其特征在于:含有權利要求3所述的抗Lp (a)單克隆抗體。
6.一種Lp (a)膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒，由彼此獨立的試劑I與試劑2組成；其中，試劑I的成分包括緩沖液，防腐劑；試劑2的成分包括緩沖液、牛血清白蛋白或小牛血清、偶聯有抗Lp(a)單克隆抗體的膠乳微球；其特征在于:所述的抗Lp(a)單克隆抗體是權利要求I的雜交瘤細胞株所分泌。
7.按照權利要求6所述的Lp(a)膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒，其特征在于:試劑I的成分包括:20mM，pH7.4磷酸鹽緩沖液，0.l%NaN3。
8.按照權利要求6所述的Lp(a)膠乳增強免疫比濁檢測試劑盒，其特征在于:試劑2的成分為:20mM，pH7.4磷酸鹽緩沖液，0.1%BSA，0.2%偶聯有抗體的膠乳微球；其中抗體偶聯比:lmg/10mg膠乳微球；膠乳微球粒徑為124nm。
【文檔編號】G01N33/577GK103627677SQ201310611398
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月26日 優先權日:2013年11月26日
【發明者】不公告發明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司