專利名稱：西馬特羅膠體金試紙條及其制備方法與用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于食品安全領域中涉及β2_受體激動劑殘留檢測領域。具體而言，本發明涉及西馬特羅膠體金試紙條及其制備方法。
背景技術：
β 2受體激動劑(β 2-agonist)是一類化學結構和生理功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙胺類藥物，西馬特羅(CimateiOl)作為β 2_受體激動劑的代表藥物之一，它能調節交感神經興奮、松弛氣管平滑肌，但是長期用高劑量的西馬特羅給動物飼喂時，西馬特羅會對動物體內的營養進行再分配，促進蛋白質沉積而抑制脂肪形成，從而顯著提高動物的瘦肉率。因此，近年來西馬特羅成為了鹽酸克倫特羅的一個主要的替代品應用于動物飼料中。西馬特羅在體內代謝緩慢、作用時間久、性質穩定、藥物殘留率高，當人類食用殘留該藥物的動物性食品后勢必會對健康產生相當的危害，所以研發出一種能夠方便、快速、準確的定量檢測動物性食品中西馬特羅的方法具有相當的必要性。目前，國內外檢測西馬特羅的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜質譜聯用技術(GC-MS)、液相色譜質譜聯用技術(LC-MS)、酶聯免疫吸附法(ELISA)。在食品安全檢測中，往往先用ELISA進行初篩后，再對陽性樣本用HPLC或GC-MS、LC-MS進行確證。但是上述方法所用的儀器設備昂貴復雜、成本高，同時需要對操作人員進行特殊培訓，且實驗結果不能立即顯示，因此不適用于商檢、防疫、畜牧生產者對懷疑對象的快速在線檢測和監控。膠體金試紙條是以膠體金作為免疫層析的指示物，其原理是以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細作用使樣品溶液在層析條上泳動，并同時使樣品中的待測物與層析材料上針對待測物的受體(如抗體或抗原)發生高特異高親和性的免疫反應，層析過程中免疫復合物被富集或截留在層析材料的一定區域(檢測帶)，通過直接運用可目測的膠體金標記物而得到直觀的實驗結果。雖然該方法快速方便，但是膠體金試紙條仍有以下缺點:(I)只有當金顆粒集聚到一定量(IO7個/mm2)時，才出現肉眼可見的紫紅條帶，且該顏色條帶與背景對比度不大，從而限制了檢測靈敏度。(2)樣品基質效應明顯，背景干擾大。(3)無法實現定量檢測。因此，目前對于西馬特羅的定量檢測手段仍有待改進。
發明內容
本發明旨在至少在一定程度上解決上述技術問題之一為此，本發明的一個目的在于提出一種能有效檢測西馬特羅的試紙條和其制備方法及其用途。在本發明的第一方面，參考圖1，本發明提出了一種西馬特羅膠體金試紙條，包括:底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述結合物墊上是含有膠體金標記的抗西馬特羅單克隆抗體，所述硝酸纖維素膜上進一步形成有檢測線和質控線，所述檢測線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原線狀點樣組成，所述質控線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。由此，可以有效地獲得西馬特羅膠體金試紙條，從而對樣品中西馬特羅進行定量檢測。在本發明的又一方面，本發明提出了一種制備前面所述的西馬特羅膠體金試紙條的方法，其包括下列步驟:制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上形成有檢測線和質控線；制備結合物墊；以及組裝試紙條，其中，用能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原在所述硝酸纖維素膜上進行線狀點樣作為檢測線；用能與抗西馬特羅單克隆抗體結合驢抗小白鼠抗體在所述硝酸纖維素膜上進行線狀點樣作為質控線。由此，由本發明提供的方法能有效制備前面所述的西馬特羅膠體金試紙條，從而對樣品中西馬特羅進行定量檢測。根據本發明的實施例，用于制備檢測線的西馬特羅檢測抗原是通過下列方法獲得的:稱取50mg西馬特羅，用IOmL pHl.0的蒸餾水將其溶解作為A液，稱取60mg亞硝酸鈉用2mL蒸餾水將其溶解作為B液，稱取232mg BSA,用pH8.00.0lM的PBS溶解作為C液；冰浴條件下把B液緩慢滴入A液中，4攝氏度磁力攪拌反應4小時后，在冰浴條件下將其緩慢地加入C液中，加完后調pH至8.0，室溫磁力攪拌反應過夜；以及最終產物用0.0lM pH7.4的PBS透析除去雜質得到用于制備檢測線的西馬特羅偶聯物。由此，通過本發明實施例的方法，可以有效地制備具有西馬特羅檢測抗原的檢測線，從而獲得具有檢測線的西馬特羅膠體金試紙條，進而有效地對西馬特羅進行定量檢測。根據本發明的實施例，用于制備質控線的抗體是通過下列步驟獲得的:通過在驢體內注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗體的血清經純化后制得的，以便獲得用于制備質控線的抗體。由此，通過本發明實施例的方法，可以有效地制備具有能夠與西馬特羅檢測抗原結合的抗體的質控線，從而獲得具有質控線的西馬特羅膠體金試紙條，進而有效地對西馬特羅進行定量檢測。根據本發明的實施例，所述檢測線和質控線是通過下列步驟獲得的:將硝酸纖維素膜按20mm 30mm寬的尺寸剪裁；將經純化濃度調整為0.2mg/mL 1.0mg/mL的西馬特羅檢測抗原，在膜上線狀點樣作為檢測線，其中，檢測線點樣位置離膜底邊15mm 18mm ;將經純化濃度調整為0.5mg/mL 1.5mg/mL的驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線，質控線點樣位置離膜底邊Ilmm 13_ ;將所述硝酸纖維素膜室溫干燥30分鐘，置于1%牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37攝氏度下孵育30分鐘。由此，通過本發明實施例的方法，可以有效地制備大小均一、位置固定并且分別具有特定濃度抗原、抗體的檢測線和質控線，從而獲得具有檢測線和質控線的西馬特羅膠體金試紙條，進而有效地對西馬特羅進行定量檢測。根據本發明的實施例，結合物墊是通過下列步驟獲得的:選用能與西馬特羅結合的抗西馬特羅單克隆抗體標記膠體金；以及把經過標記的膠體金，分散在玻璃纖維紙上。由此，通過本發明實施例的方法，可以有效地制備具有能與西馬特羅結合的抗西馬特羅單克隆抗體標記的膠體金的結合物墊，從而獲得具有結合物墊的西馬特羅膠體金試紙條，進而有效地對西馬特羅進行定量檢測。在本發明的另一方面，本發明提供了一種前面所述的西馬特羅膠體金試紙條檢測西馬特羅的方法，包括以下步驟:配制已知系列濃度的西馬特羅標準品并加入膠體金讀取儀樣本孔中，IOmin后檢測對應的光密度數值并建立標準曲線，將含有檢測樣品的試紙條放入所述膠體金讀取儀中，讀取檢測數值，以及通過所述標準曲線計算所述檢測樣品中的西馬特羅含量。由此，通過本發明所提供的方法，可以有效地制備采用該膠體金讀取儀的校準曲線，從而配合本發明提供的西馬特羅膠體金試紙條有效地對西馬特羅進行定量檢測。有益效果1、靈敏度高:本發明采用西馬特羅膠體金試紙條配膠體金讀取儀的方法，能通過儀器替代肉眼觀察實驗結果，克服了肉眼判斷帶來的誤差，從而提高了檢測靈敏度，檢測限低至Ippb。2、定量:本發明采用西馬特羅膠體金試紙條配膠體金讀取儀的方法，可以根據膠體金讀取儀顯示器上的顯示數值和標準曲線即可得出被檢樣品中的西馬特羅的含量。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中:圖1是根據本發明實施例的檢測西馬特羅的膠體金試紙的結構圖；圖2是根據本發明實施例的一種膠體金讀取儀的示意圖；圖3是根據本發明實施例的定量檢測西馬特羅流程圖。
具體實施例方式本實施例給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1免疫抗原的合成
權利要求
1.一種西馬特羅膠體金試紙條，其特征在于，包括: 底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊， 其中，所述結合物墊上是含有膠體金標記的抗西馬特羅單克隆抗體， 所述硝酸纖維素膜上進一步形成有檢測線和質控線，所述檢測線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原線狀點樣組成，所述質控線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。
2.一種制備權利要求1所述的西馬特羅膠體金試紙條的方法，其特征在于，包括下列步驟: 制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上形成有檢測線和質控線； 制備結合物墊；以及 組裝試紙條， 其中， 用能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原在所述硝酸纖維素膜上進行線狀點樣作為檢測線； 用能與抗西馬特羅單克隆抗體結合驢抗小白鼠抗體在所述硝酸纖維素膜上進行線狀點樣作為質控線。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，用于制備檢測線的西馬特羅檢測抗原是通過下列方法獲得的: 稱取50mg西馬特羅，用IOmL pHl.0的蒸餾水將其溶解作為A液，稱取60mg亞硝酸鈉用2mL蒸餾水將其溶解作為B液，稱取232mg BSA,用pH8.00.0lM的PBS溶解作為C液；冰浴條件下把B液緩慢滴入A液中，4攝氏度磁力攪拌反應4小時后，在冰浴條件下將其緩慢地加入C液中，加完后調pH至8.0，室溫磁力攪拌反應過夜；以及 最終產物用0.0lM pH7.4的PBS透析除去雜質得到用于制備檢測線的西馬特羅偶聯物。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，用于制備質控線的抗體是通過下列步驟獲得的: 通過在驢體內注射小白鼠免疫球蛋白，并提取含抗體的血清經純化后制得的，以便獲得用于制備質控線的抗體。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述檢測線和質控線是通過下列步驟獲得的: 將硝酸纖維素膜按20mm 30mm寬的尺寸剪裁；將經純化濃度調整為0.2mg/mL 1.0mg/mL的西馬特羅檢測抗原，在膜上線狀點樣作為檢測線，其中，檢測線點樣位置離膜底邊 15mm 18mm ； 將經純化濃度調整為0.5mg/mL 1.5mg/mL的驢抗小白鼠免疫球蛋白抗體，在膜上線狀點樣作為質控線，質控線點樣位置離膜底邊Ilmm 13mm; 將所述硝酸纖維素膜室溫干燥30分鐘，置于1%牛血清白蛋白的生理鹽水中浸泡30分鐘，取出吸干水分，于37攝氏度下孵育30分鐘。
6.根據權利要求2所述的方法， 其特征在于，結合物墊是通過下列步驟獲得的:選用能與西馬特羅結合的抗西馬特羅單克隆抗體標記膠體金；以及 把經過標記的膠體金，分散在玻璃纖維紙上。
7.一種采用如權利要求1所述的西馬特羅膠體金試紙條配膠體金讀取儀定量檢測西馬特羅的方法，其特征在于，包括下列步驟: 配制已知系列濃度的西馬特羅標準品并加入所述膠體金讀取儀的樣本孔中， 10分鐘后檢測對應的光密度數值并建立標準曲線， 將含有檢測樣品的試紙條放入所述膠體金讀取儀中， 讀取檢測數值，以及 通過所述標準曲線 計算所述檢測樣品中的西馬特羅含量。
全文摘要
本發明提出了一種西馬特羅膠體金試紙條及其制備方法，其中西馬特羅膠體金試紙條包括底板，所述底板具有第一端和第二端，并且沿所述第一端向第二端的方向，所述底板上依次形成有濾紙、樣品墊、結合物墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中，所述結合物墊上含有膠體金標記的抗西馬特羅單克隆的抗體，所述硝酸纖維素膜上進一步形成有檢測線和質控線，所述檢測線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的西馬特羅檢測抗原線狀點樣組成，所述質控線由能與抗西馬特羅單克隆抗體結合的驢抗小白鼠抗體線狀點樣組成。利用該試紙條能有效檢測西馬特羅。
文檔編號G01N33/558GK103207270SQ201310121618
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月9日 優先權日2013年4月9日
發明者賴衛華, 彭濤, 楊萬春, 陳媛, 劉文娟 申請人:江西中德生物工程有限公司
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