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用于在自動分析儀上光度測定流體樣品中的分析物的多應用方法
【專利摘要】本發明涉及用于通過光度測定法測定可以顯示干擾的樣品的特定分析物的量的方法，其中所述特定分析物從所述分析物與分析物特異性測定試劑相互作用后反應混合物的光信號變化來定量。對于待測定的樣品的特定分析物，對于多個波長生成多條校準曲線，將測量結果儲存在儀器平臺的數據管理系統中。同時進行干擾測試以測定特定分析物，用于定量待測定樣品中存在的干擾物質的量。將各干擾物質的量與預定截止值進行比較。在完整反應時間在多個波長測量反應混合物中待測定的樣品的特定分析物的光信號，且根據干擾物質選擇校準曲線。最終，通過與所選波長的所選校準曲線比較來定量待測定的樣品的特定分析物的量。
【專利說明】用于在自動分析儀上光度測定流體樣品中的分析物的多應 用方法 發明領域
[0001] 本發明涉及用于通過光度測定法測定可以顯示干擾的樣品的特定分析物的量的 方法，其中所述特定分析物從所述分析物與分析物特異性測定試劑相互作用后反應混合物 的光信號變化來定量。對于待測定樣品的特定分析物，對于多個波長生成多條校準曲線，將 測量結果儲存在儀器平臺的數據管理系統中。同時進行干擾測試以測定特定分析物，用于 定量待測定樣品中存在的干擾物質的量。將各干擾物質的量與預定截止值進行比較。在完 整反應時間在多個波長測量反應混合物中待測定樣品的特定分析物的光信號，且根據干擾 物質選擇校準曲線。最終，通過與所選波長的所選校準曲線比較來定量待測定樣品的特定 分析物的量。
[0002] 用于光度測定流體中的分析物的診斷測定法，包括池度（turbidimetric)、比池 (nephelometric)和比色（colorimetric)測定法，是常見且眾所周知的。由于其容易的一 步程序和其短周轉時間，此類測定法是用于在自動分析儀中應用的理想候選。如今，高度自 動化的分光光度分析儀用于臨床診斷中以便以時間和成本有效的方式進行光度測定法。分 析儀上的工作流程的特征在于簡單的程序，而沒有任何分離或洗滌步驟，通常涉及以下方 案：a)將含有未知量分析物的樣品（血清或血漿）和分析物特異性測定試劑分配至反應杯 中，b)在杯中，使樣品和試劑在規定溫度孵育特定時間段，c)光度計測量與所述樣品中分 析物的量相關的所述杯中測定溶液的光信號。
[0003] 對于臨床化學分析儀例如Roche Diagnostics cobas? c提供基于池度、比池或比 色測定法的廣泛測試菜單。在cobas? c儀器上檢測這些測定法基于具有鹵鎢燈作為照射 源、用于生成單色光的光柵和光電二極管陣列（產生340和800 nm之間的12個波長的12 個二極管）作為檢測器的光度計。
[0004] 經常將關鍵樣品提交用于在臨床實驗室進行常規生化測試，其顯示對應用的測定 法的干擾，因此導致改變和錯誤的結果。當用使用光學方法如比色和濁度方法的實驗室測 試進行工作時，樣品基質中顯色或散射光的物質通常引起干擾。此類干擾物質的實例是血 紅蛋白（溶血）、膽紅素（黃疸）和脂質（脂血），其在通常用于分光光度測試的波長吸收 或散射光。
[0005] 溶血是一個重要的干擾因素，這通常歸因于不同因素對紅細胞的體外破壞，諸如 分離血清或血漿前血液的長期儲存、通過迅速迫使血液經過小針頭的剪切力、混合時的過 度攪拌或血清的離心和分離的物理作用。體內溶血發生頻率較低，但它對實驗室測試具有 相同的效果。溶血干擾檢測程序的機制是由釋放的血紅蛋白的顏色干擾，盡管還有從受損 的紅細胞泄漏分析物和紅細胞組分與分析物之間的化學相互作用也是可能的原因。作為結 果，由于血紅蛋白干擾，在臨床試驗中可以獲得錯誤地更高或錯誤地更低的分析物濃度。其 他血細胞如白細胞和血小板的組分也可以污染樣品。例如，細胞衰變可以導致白血病患者 的血液變化；血小板在凝血過程中的衰變導致血清中較高濃度的細胞內血小板成分。
[0006] 溶血可以進一步由生物化學、免疫學、物理和化學機制引起。輸血過程中，補體依 賴性溶血可以由與主要血型抗原反應的抗體引起。物理溶血由低滲對紅細胞的破壞，例如 用低滲溶液稀釋血液，以及降低（真空）或增加的壓力引起。機械溶血可以發生在血液在體 內流過醫療設備例如導管、心臟瓣膜過程中和由在體外離心不足以及升高的溫度而發生。 污染物質也可以引起體外溶血。最后，洗滌劑和其他污染物質可以引起溶血。分離血細胞 后，溶血通過血清或血漿的紅色來檢測。在超過300 mg/L (18.8 mmol/L)的細胞外血紅蛋 白濃度，溶血可通過血清或血漿的紅色檢測。具有治療性血紅蛋白衍生物的樣品總是強烈 顯紅色的。一些分析系統通過比較樣品在兩種波長的吸收測量溶血的程度。用作血液替代 品的血紅蛋白衍生氧載體的吸收光譜與天然血紅蛋白沒有顯著不同。
[0007] 膽紅素是由血紅蛋白的酶促降解產生的黃色的色素。關于膽紅素干擾的研究大多 數基于其中將游離膽紅素或水溶性二牛磺酸膽紅素（di-taurobilirubin)添加至血清的 實驗。在特定條件下，膽紅素分子在其干擾影響中在定性和定量上不同。當以增加的濃度 存在于血液中時，綴合膽紅素出現在尿中。在具有蛋白尿的患者中，結合至白蛋白的膽紅素 也可以出現在尿中。腦內出血后，未綴合（游離）膽紅素引起腦脊液的黃變。在血腦屏障 的通透性增加時，結合至白蛋白的膽紅素可以出現在CSF中。膽紅素在340 nm至500 nm 之間的波長具有高吸光度。因此，使用這些波長的分光光度測試因為由膽紅素引起的持續 高的背景吸光度而顯示出限制。膽紅素干擾導致的結果的明顯增加或減少是測定和分析物 濃度依賴的。
[0008] 脂血樣品是由于增加的脂質含量而具有混濁或乳狀外觀的血液、血清或血漿的樣 品。無法避免脂血樣品，因為脂質濃度增加經常繼發于其他疾病狀態諸如：糖尿病、乙醇使 用、慢性腎衰竭和胰腺炎。脂血的存在可以通過不同的機制干擾許多臨床化學測試，最常見 的機制是脂質（主要是乳糜微粒和極低密度脂蛋白VLDL)對光的散射。作為結果，根據應 用的波長和脂質含量，可以改變測定的分析物濃度。
[0009] 總之，樣品中血紅蛋白、膽紅素和脂質以及其他干擾物質的存在可以引起目的在 于定量特定分析物的光度測定法的測量結果的正或負的干擾。根據干擾的幅度，結果可以 導致錯誤的解釋和不適當的干預。
[0010] 為了克服溶血、黃疸和脂血引起的干擾的缺點，幾種方法是文獻中已知的。脂血、 黃疸和溶血干擾可以通過預分析過程中預處理樣品以去除干擾物質而降低，例如在脂血樣 品的情況下通過高速離心。然而，此類措施增加了工作量，且降低了成本和時間效率；此類 措施也易于在樣品操作中產生誤差。
[0011] 另一種策略是使用其他對干擾不敏感的臨床測試。這可能是挑戰性的，因為替代 測試可能需要實驗室中沒有的另一個儀器平臺；也可能市場上沒有任何替代測試。
[0012] 通過使用設置空白程序校正脂血、溶血和黃疸引起的干擾是克服限制的替代方 案。這涉及添加測定試劑之前，一旦合適地稀釋，測量樣品吸光度。從最終吸光度減去測量 的吸光度。一種實現這種設置空白程序的策略是利用2種不同的試劑（空白和測定試劑） 和2個杯。這種方法改進了結果，但它具有一個缺點，使測試通量減少一半。另一種方法涉 及將試劑依次添加至杯中：在設定時間后獲取第一讀數；此后添加測定試劑并孵育；最后 獲取第二讀數。然而，用該程序通常僅實現很小改進。此外，建立的測定方案可能不與第一 讀數所需的樣品的新初始稀釋步驟相容。
[0013] 雙色分析也允許校正分析結果，且經常應用于自動化實驗室測試中。第二U則） 波長用于測量干擾物質。待測定的分析物在該第二波長不吸收。然后從分析物的測量值減 去該測量值。這假設干擾物質的吸光度在兩種波長是相同的，這種情況是很少的。因此，雙 色原則在降低干擾中只產生輕微的改進。此外，可能通過化學消除干擾物質來處理干擾，例 如用膽紅素氧化酶消除膽紅素，或用抗壞血酸氧化酶消除維生素C。
[0014] 此外，多通道分析儀是全自動化的計算機控制系統，其經設計用于分析常規化學 測定法、免疫測定法和治療藥物，例如，Roche Cobas 6000使用分光光度法來進行動力學、 終點和非線性反應。到一定程度，系統，類似于大多數現代分析儀，通過應用雙試劑程序和 雙色分光光度法降低了光譜干擾影響。樣品的質量可以通過不同的方法來確定。一種常見 方法是在實驗室分析儀上運行血清指標測試，所述分析儀定量樣品中存在的膽紅素、血紅 蛋白和脂質的量。HIL指標的實施改進了測試結果的精確度和質量。
[0015] 然而，仍然存在許多患者樣品顯示溶血、膽紅素和脂質的干擾，導致錯誤的結果， 甚至通過使用HLI指標或校正方法。實驗室測定中溶血、膽紅素和脂質的分析干擾是實驗 室醫學中最常見的問題。這些改變和錯誤的結果可以導致不正確的解釋、錯誤的診斷和可 能不適當干預以及對于患者的不利結果。作為結果，在血紅蛋白、膽紅素和脂質的濃度超過 特定截止水平的情況下，許多樣品必須在預分析步驟中進行預處理，以去除干擾物質，然后 重新測量。預處理和重新測量引起額外費用和時間的損失，這兩個因素對于進行那些測定 的實驗室都是關鍵的。
[0016] 待解決的問題 因此，本發明解決的問題是提供用于測定顯示干擾的關鍵樣品中的特定分析物的改進 的測定方法，其通過在相應的儀器平臺上使用可商購的分光光度實驗室測試而實現，而無 需應用預分析樣品處理或改變測定方法。
[0017] 本發明人已經令人驚訝地發現，顯示干擾的樣品的改進精確度通過本發明的方法 得到實現。預期本發明（至少部分地）克服了顯示干擾的樣品的預分析樣品處理和重新測 量的問題，以在光度測定法中測定樣品中特定分析物的正確量。
[0018] 發明概述 這些目標中的至少一個通過提供權利要求和下文中定義的主題來實現。
[0019] 在第一個方面，本發明涉及用于通過光度測定法測定可以顯示干擾的樣品中特定 分析物的量的方法，其中所述特定分析物從所述分析物與分析物特異性測定試劑相互作用 后反應混合物的光信號變化來定量。對于待測定樣品的特定分析物，對于多個波長生成多 條校準曲線，將測量結果儲存在儀器平臺的數據管理系統中。同時進行干擾測試以測定特 定分析物，用于定量待測定樣品中存在的干擾物質的量。將各干擾物質的量與預定截止值 進行比較。在完整反應時間在多個波長測量反應混合物中待測定樣品的特定分析物的光信 號，且根據干擾物質選擇校準曲線。最終，通過與所選波長的所選校準曲線比較來定量待測 定樣品的特定分析物的量。
[0020] 在第二個方面，本發明涉及用于降低顯示溶血和/或黃疸和/或脂血和/或其他 干擾的樣品的基于分光光度的實驗室測試的干擾的方法，其中將包含測量波長、反應時間、 校準點、校準模式的特定測量條件額外應用于測量方案，而無需應用預分析樣品處理和/ 或改變測定方法。
[0021] 在進一步方面，本發明涉及額外應用于測量方案的特定測量條件用于降低測定顯 示干擾的樣品中特定分析物的量的基于分光光度的實驗室測試的干擾的用途，所述特定測 量條件包含測量波長、反應時間、校準點、校準模式。
[0022] 發明詳述 本發明涉及用于通過光度測定法測定可以顯示干擾的樣品的特定分析物的量的方法， 其中在實驗室分析儀上，所述特定分析物從所述分析物與分析物特異性測定試劑相互作用 后反應混合物的光信號變化來定量。對于待測定樣品的特定分析物，對于多個波長生成多 條校準曲線，將測量結果儲存在儀器平臺的數據管理系統中。
[0023] 任選地，進行干擾測試用于定量待測定樣品中存在的膽紅素和/或血紅蛋白和/ 或脂質和/或其他干擾物質的量，并且將每種干擾物質的量與預定截止值進行比較。同時， 在完整反應時間在多個波長測量反應混合物中待測定樣品的特定分析物的光信號。根據樣 品中存在的干擾物質的量和類型選擇校準曲線。最終，通過與所選波長的所選校準曲線比 較來定量待測定樣品的特定分析物的量。
[0024] 本發明的方法進一步提供了額外應用于測量方案的包含反應時間、校準點、校準 模式和測定類型的特定測量條件。
[0025] 樣品的質量可以通過不同的方法來確定。一種常見方法是在實驗室分析儀上運行 血清指標測試，所述分析儀定量樣品中存在的膽紅素、血紅蛋白和脂質的量。由此，血清指 標和特定分析物的光信號的測量可以在分析儀上同時進行。有時，在高濃度的干擾物質的 情況下，甚至可能通過其顏色對血清樣品目視分類。
[0026] 通過在特征在于測量波長、反應時間、校準模式、校準點數量（其針對特定分析物 應用進行預先確定）的多個條件下生成多條校準曲線，現在可能與標準技術相比更精確地 測量這些樣品的特定分析物。選擇一條或多條校準曲線，所述校準曲線經優化用于減少干 擾，導致干擾物質的耐受量的擴大。
[0027] 通過使用本發明的方法，顯示干擾的關鍵樣品，例如溶血、黃疸和/或脂血樣品， 現在可以使用相應的儀器平臺上可商購的分光光度實驗室測試進行測量。本發明人已經令 人驚訝地發現，顯示干擾的樣品的改進精確度通過本發明的方法得到實現，從而避免了需 要應用預分析樣品處理或改變測定方法或在最壞情況下拋棄樣品。
[0028] 定義： 如本文中所使用，術語"測定"意指從基于濁度、比濁或比色測量的光度測定法的反應 混合物的光信號的變化，評估、診斷、決定、鑒定、評價、定量或分類樣品中的特定分析物。
[0029] 如本文中所使用，術語"量"涵蓋分析物的絕對量或所述分析物的相對量和/或濃 度和/或可以與之關聯和/或可以因此推導的任何值和/或參數。
[0030] 如本文中所使用，術語"凝集"主要是其中大分子之間的表面相互作用導致交聯且 形成大復合物的化學現象。這種大復合物的形成導致光散射特性的增加，取決于復合物的 尺寸，這可以用肉眼觀察或使用濁度和比濁檢測光度監測。
[0031] 術語"分光光度測定法"，也稱為"光度測定法"，是本領域眾所周知的。光度測定法 涵蓋濁度和比濁免疫測定法以及比色測定法。在濁度和比濁免疫測定法中，特定分析物從 基于所述特定分析物和分析物特異性結合伴侶的凝集的反應混合物的濁度的變化來定量， 而在比色測定法中，特定分析物在顯色劑的幫助下來定量。
[0032] 根據本發明的術語"比色測定法"通常用于在高度自動化的臨床化學分析儀上 的臨床診斷。由于其容易的一步程序和其短周轉時間，均相比色測定法是用于在自動分 析儀中應用的理想候選。實際上提供用于臨床化學分析儀的廣泛測試菜單，例如Roche Diagnostics cobas? c。比色測定法的特征在于在待定量的分析物存在的情況下顏色的 形成或改變或耗盡，其中顏色的形成或改變或耗盡通常通過分光光度計測量。由于該檢測 的顏色或光通常在可見區域中，所以你實際上可以看到測定的顏色變化，因此被稱為比色 測定法。在實驗室分析儀上運行的典型比色試驗是臨床化學試驗和酶免疫試驗（CEDIA， EMIT)。MTT測定法(使用四唑染料作為底物的氧化還原測定法）是除了酶促NAD (P)H測定 法之外的比色測定法的其他實例。經常使用UV光，因為共同輔酶NADH和NADPH以其還原 形式，但不以其氧化形式，吸收UV光。因此，使用NADH作為底物的氧化還原酶可以通過遵 循當其消耗輔酶時340 nm波長的UV吸光度的降低來測定。甚至當酶反應不導致光的吸光 度的變化時，其仍可以可能通過使用偶聯測定法使用酶的分光光度測定法。在這里，使用一 種反應的產物作為另一種可易于檢測的反應的底物。用于偶聯測定的一個實例是酶己糖激 酶，其可以通過使用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶將葡萄糖-6-磷酸的產生偶聯至NADPH產生來 測定。此類測定在光度計中通過分光光度法檢測。在cobas? c儀器上檢測這些測定基于 具有鹵鎢燈作為照射源和光電二極管陣列（產生340和800 nm之間的12種波長的12個 二極管）作為檢測器的光度計。O.D.(光密度，吸光度）與有色化合物的濃度成正比。如果 顏色的發展與溶液中物質的濃度相關，則該濃度可以通過測定適當波長的光吸收程度來測 量。本發明的一個實施方案是本發明的方法，其中在比色測定法中，特定分析物在顯色劑的 幫助下來定量。
[0033] 術語"顯色劑"涵蓋導致測定的顏色變化、顏色形成或顏色耗盡的任何測定試劑或 測定試劑的混合物，所述顏色變化、顏色形成或顏色耗盡可以在光度計上用范圍為340至 800nm的典型波長來測量。許多比色測定法涉及在一個或多個步驟反應中導致有色產物的 酶和對應底物；顏色變化可以通過對應的酶輔因子如NAD/ NADH、而不是底物本身來誘導。 還存在基于在一個或多個步驟反應中導致產生有色產物的分析物與化學試劑的特異性反 應的比色測定法。在比色免疫測定法如EMIT (酶多聯免疫測定技術）或CEDIA(克隆酶供 體免疫測定）中，顏色通常由導致產生具有特征性和可檢測的吸收特性的產物的報道酶如 3-半乳糖苷酶或脫氫酶與其對應底物的反應形成。
[0034] 報道酶與底物的反應通常在分析物和抗體的免疫反應（其然后觸發或抑制酶反 應）之后發生。在其他比色測試中，如用于實驗室分析儀的典型臨床化學測試中，顏色由分 析物與酶或任何其他特定化學試劑或其組合的反應形成、改變或耗盡。在一些情況下，分析 物本身充當酶。甚至當酶反應不導致光的吸光度的變化時，其仍可以可能通過使用偶聯測 定法使用酶的分光光度測定法。在這里，使用一種反應的產物作為另一種可易于檢測的反 應的底物。用于偶聯測定的一個實例是酶己糖激酶，其可以通過使用葡萄糖-6-磷酸脫氫 酶將葡萄糖-6-磷酸的產生偶聯至NADPH產生來測定。
[0035] 術語"池度法（turbidimetry)和比池法（nephelometry) "是本領域已知用于基于 測量濁度對光的透射和散射的效果測定溶液中混濁的量或該濁度的方法。液體中的濁度是 由細分的懸浮顆粒的存在引起的。如果使光束通過混濁樣品，則其強度由散射而降低，并且 散射光的量取決于顆粒的濃度、尺寸和尺寸分布。分光光度計測量增加的濁度（即，強度透 射光中光的減少），這是由于由免疫凝集反應導致的漸增的粒徑引起的。這種增加的濁度是 由分析物引起的免疫凝集的直接量度，或由分析物引起的免疫凝集抑制的間接量度。在比 濁法中，測量散射光的強度，而在濁度法中，測量透射通過樣品的光的強度。
[0036] 濁度測定法涉及測量當入射光束通過樣品時入射光束的強度。光束可以通過懸浮 液或被顆粒吸收、反射或散射。作為結果，當光透射通過懸浮液時，光的強度降低。對于非 吸收性顆粒，由于散射引起的光強度的降低表示為濁度。
[0037] 比濁測定法是指當入射光束通過樣品時，測量從入射光束以定義角度9散射的 光。在比濁法中，測量一段時間后的散射光的強度的變化，因為散射物質迅速增加尺寸。當 在固定的抗體-膠乳復合物存在的情況下測量時，散射光與初始抗原濃度成比例。進一步 的解釋描述于 J.A. Molina-Bolivar 等人，Journal of Macromolecular Science, Part C-Polymer Review, 45:59-98， 2005。
[0038] 本發明的免疫測定方法在有和沒有微粒增強的情況下用所有已知凝集試驗都起 作用。本發明中優選使用"微粒增強光散射凝集試驗"，這也被稱為"顆粒增強濁度免疫測 定法"（PETIA)。顆粒增強免疫測定法常規用于在臨床化學分析儀上定量血清蛋白、治療性 藥物和濫用藥物的臨床診斷中，因為它們具有作為不需要任何分離或洗滌步驟的準均相測 定的益處。為了增強反應混合物中特定分析物和分析物特異性結合伴侶之間的光檢測，將 分析物或分析物特異性結合伴侶連接至合適的顆粒。由此，分析物與用分析物特異性結合 伴侶包被的顆粒反應并凝集。隨著分析物量逐漸增加，復合物的凝集和尺寸逐漸增加，進一 步導致光散射的變化。凝集的顆粒通過濁度和比濁測量法來測定。
[0039] 分析物包括攜帶對分析物具有高反應性的至少一種結合伴侶的強光散射特性的 顆粒和攜帶對分析物具有低反應性的至少一種結合伴侶的弱光散射特性的顆粒的混合物， 如EP 0898169中所述。強光散射特性的顆粒具有比弱光散射特性的顆粒更大的尺寸和/ 或更高的折射率。用于測定分析物的量的微粒增強光散射免疫測定法的微粒試劑，其包括 直徑為30至600 nm的微粒的混合物，包括攜帶對分析物具有高反應性伴侶的至少一種結 合伴侶的強光散射特性的顆粒和攜帶對分析物具有低反應性的至少一種結合伴侶的弱光 散射特性的顆粒。
[0040] 微粒的材料可以是適合用于微粒增強光散射測定法的任何無機、有機或聚合物材 料。微粒的材料可以是適合用于微粒增強光散射測定法的任何無機、有機或聚合物材料。 此類材料包括例如硒、碳、金；碳、硅或鍺的氮化物，例如Si3N4 ;鐵、鈦或硅的氧化物，例如 Ti02或Si02 ;和聚合材料，諸如例如聚苯乙烯、聚（氯乙烯）、環氧樹脂、聚（偏二氯乙烯）、 聚（甲基丙烯酸a萘酯）、聚（乙烯基萘）或其共聚物，特別是苯乙烯和可共聚的烯鍵式不 飽和化合物的共聚物，例如，苯乙烯_(甲基）丙烯酸酯共聚物。由聚合材料制成的微粒，以 及由從苯乙烯聚合的內核和從苯乙烯與可共聚的烯鍵式不飽和化合物的共聚形成的外殼 組成的核-殼顆粒是特別合適的。大部分基于顆粒的測定法采用膠乳顆粒，其中主要類型 是聚苯乙烯。
[0041] 存在顆粒增強濁度免疫測定法（PETIA)的不同的測試形式，競爭性形式和直接形 式。直接形式優選適用于具有大尺寸的分析物。這些分析物都是具有多個表位的多價抗原， 例如，蛋白和微生物。對于直接形式，顆粒用與分析物凝集的抗體包被。
[0042] 濁度和比濁測定法也可以以競爭性抑制形式進行。這種形式最常用于測量小分 子，諸如半抗原，并且通常適用于診斷濫用藥物測試和治療藥物監測。在這種形式中，測定 試劑不僅含有分析物特異性結合伴侶，而且含有通過將其連接至微球表面或另一載體分子 諸如蛋白（例如牛血清白蛋白）或可溶性聚合物或寡聚物而獲得的化學修飾的分析物。與 未修飾的分析物相比，該試劑能夠在分析物特異性結合伴侶存在的情況下由于分子中存在 的多個拷貝的分析物而凝集。樣品中的分析物從基于在修飾分析物存在的情況下特定分析 物和分析物特異性結合伴侶的聚集的反應混合物的濁度的變化來定量。
[0043] 將抗原連接至交聯劑例如聚半抗原，其與樣品的抗原競爭如EP 545350中顯示的 抗體的結合位點。在這里，可溶性聚合物、蛋白或微粒充當多個拷貝抗原的載體分子。測試 樣品中未標記抗原的量是通過其與免疫測定中標記的抗原競爭的能力來測量。未標記抗原 阻斷標記的抗原結合的能力，因為抗體上的結合位點已經被占用。因此，在競爭性免疫測定 中，測定法中測量的較少標記意指存在更多未標記的（測試樣品）抗原。
[0044] 根據本發明的術語"分析物"涵蓋任何"體外診斷化合物"，諸如例如血清蛋白、治 療性藥物和濫用藥物。代表分析物包括但不限于抗原、半抗原、抗體、蛋白、肽、氨基酸、激 素、類固醇、癌細胞標記、組織細胞、病毒、維生素、核酸、殺蟲劑、酶、酶底物和酶輔因子。如 本文中所使用，"分析物"或"特定分析物"是指樣品中其存在和/或濃度待測定的物質。術 語"分析物"包括針對其存在特異性反應伴侶，例如，特異性結合分析物的結合分子或物質， 如抗體，或與分析物特異性反應的分子，如酶）或可以針對其制備特異性結合伴侶的任何 物質。
[0045] 在本發明的上下文中，術語"特定分析物"意指對于待測量的樣品中的每種分析 物，可以測定特定校準曲線和特定波長和反應時間，將其針對每種特定分析物優化以定量 濃度，且其可以從分析物至分析物有差異。
[0046] 如本文中所使用，術語"分析物特異性反應伴侶"能夠與特定分析物反應，從而形 成反應復合物，如抗原-抗體免疫復合物，或形成新的產物，如由酶-底物反應導致產生的 產物。典型的分析物特異性反應伴侶包括，但不限于，在分析物存在的情況下導致顏色變 化的結合蛋白、抗原、抗原片段、抗體、抗體片段、核酸、受體和顆粒增強結合伴侶、酶、底物 (在分析物是酶的情況下）、輔因子、特定化學試劑。對于給定分析物特異性的此類反應伴 侶可以從商業來源獲得，或者可以根據本領域技術人員已知的標準程序制備。分析物特異 性反應伴侶對的實例包括，但不限于，半抗原：抗體，細胞：抗體，生物素：抗生物素蛋白，激 素：受體，多肽：抗體，寡核苷酸：互補DNA或RNA，酶-底物，酶-輔因子-底物，酶-介質-底 物。對于導致形成與分析物的結合復合物的分析物特異性反應伴侶，因為這是抗體的情況， 所以術語"分析物特異性結合伴侶"可以同樣用來代替"分析物特異性反應伴侶"。
[0047] 如本文中所使用，術語"抗體"是指響應于外來物質的檢測產生的免疫球蛋白，并 且包括完整分子以及其功能片段，諸如Fab、F(ab' )2、和Fv。可以用作本發明的測定法中 的免疫結合伴侶的抗體包括任何物種的多克隆抗體，任何物種的單克隆抗體（包括嵌合抗 體和/或重組抗體）。因為它們被無限量相同產生的能力，所以單克隆抗體或其片段通常是 優選的。
[0048] 如本文中所使用，術語"抗原"特征在于其在抗體的抗原結合位點處被結合的能 力。被抗體識別且抗體結合的抗原的區域被稱為"表位"。抗原是當引入動物或人體時能夠 誘導免疫應答，即抗體產生，的物質。半抗原是只有當連接至大載體諸如蛋白時才可以引發 免疫應答的小分子。載體可以是自身也不會引發免疫應答的載體。一旦機體已經生成針對 半抗原-載體加成物的抗體，小分子半抗原也可以能夠結合抗體。
[0049] 如本文中所使用，術語"樣品"是指選自血液即全血、血漿或血清，或尿液，CSF，痰 的體液的樣品，或是指分離的細胞的樣品，或是指來自各個個體的組織或器官的樣品。體液 樣品可以通過眾所周知的技術來分離。組織或器官樣品可以從任何組織或器官通過，例如， 組織活檢來分離。分離的細胞可以從體液或組織或器官通過分離技術諸如離心或細胞分選 來分離。優選地，來自細胞、組織或器官樣品的裂解物從表達或產生本文所述的肽的那些細 胞、組織或器官中分離。
[0050] 如本發明中所使用的術語"干擾"被定義為樣品中存在的物質改變結果的正確值 的影響。如本文中所使用的顯示干擾的樣品是指具有一種或多種干擾物質諸如血紅蛋白、 膽紅素和脂質或在通常用于分光光度測試的波長吸收或散射光的其他干擾物質的樣品。其 他干擾物質是由治療、濫用或免疫球蛋白引起的藥物和藥劑。有時，在高濃度的干擾物質的 情況下，甚至可能通過其顏色對血清樣品目視分類。
[0051] 術語"溶血"被定義為紅細胞和其他血細胞的細胞內組分釋放到細胞外液，并且可 以通過不同的機制引起。體內或體外溶血可以引起結果的明顯降低或增加。細胞內濃度比 細胞外濃度高10倍的細胞組分在溶血過程中在血漿/血清中增加（例如鉀、乳酸脫氫酶、 天冬氨酸轉氨酶）。血漿和血清之間的分析物濃度的差異也是由于血細胞的裂解（基本上 通過血小板）：因此，神經元特異性烯醇化酶、鉀和酸性磷酸酶在血清中較高。
[0052] 血細胞成分可以直接或間接干擾分析物的測量。從紅細胞釋放的腺苷酸激酶可 以導致肌酸激酶和CK-MB活性的增加，特別是當測定混合物中腺苷酸激酶的抑制劑是不足 時。相反，CK-MB的免疫化學定量不受腺苷酸激酶影響。游離血紅蛋白的假過氧化物酶活 性負責通過抑制重氮顏色形成而干擾Jendrassik和Groof的膽紅素程序。從血細胞釋放 的蛋白酶可以降低凝血因子的活性，同時可以增加纖維蛋白裂解產物形成。
[0053] 如本發明中所使用的術語"膽紅素"在血漿中作為游離分子存在和共價結合至白 蛋白。在使用濁度原理的凝血分析儀中，超過25 Mffl〇l/L的膽紅素濃度導致抗凝血酶III的 測量值的臨床相關的變化。在較高膽紅素濃度，干擾在某些凝血測試中將是顯著的。膽紅 素由于在堿性條件下的氧化導致的吸收降低是在未去蛋白的情況下膽紅素干擾Jaff6方 法的修改方案的主要原因。
[0054] 在強酸性環境中，綴合膽紅素的吸收轉移到UV波長，因此引起用鑰磷酸鹽方法通 過其還原作用測定磷酸鹽的干擾。
[0055] 膽紅素干擾基于氧化酶/過氧化物酶的測試系統。與其濃度成比例，膽紅素可以 與測試系統中形成的H202反應，這引起用于測量葡萄糖、膽固醇、甘油三酯、尿酸和肌酸酐 的酶促程序的系統性降低的結果。膽紅素競爭性干擾染料與白蛋白的結合。
[0056] 如本發明中使用的術語"脂血"被定義為肉眼可見的血清或血漿樣品中的渾濁。這 通常在高于300 mg/dl (3.4 mmol/L)的甘油三酯濃度觀察到。渾濁的最常見原因是甘油三 酯的濃度增加。脂質干擾幾乎所有通過光散射和吸收的光度測量。表觀結果可以基于設置 空白程序增加或降低。在較高濁度，可能由于該方法線性的限制而無法測量。脂蛋白通過 降低樣品體積的可用水降低分析物的表觀濃度，這是由于分析物濃度的計算中包括血漿或 血清中的脂蛋白采取的體積。當血漿或血清通過火焰光度法和通過與直接電勢測定法相反 的使用離子敏感電極的間接測量來測量時，這是脂血血清中較低的鈉和鉀濃度的原因。當 脂蛋白沒有均勻分布在血清/血漿樣品中時，離心后進行相同的觀察：水相中溶解的分析 物的濃度在樣品上層中小于樣品下部相中。對于脂質和脂溶性成分（包括脂蛋白結合的某 些藥物）的濃度，反過來也是如此。通過脂蛋白提取的成分對于用于檢測的試劑諸如抗體 可能無法接近。以類似方式，電泳和層析程序可能受到基質中存在的脂蛋白影響。
[0057] 干擾物質的存在和量或其不存在可以通過干擾測試來檢測。干擾測試的一個實例 是"血清指標"測試，其在實驗室分析儀上處理樣品的同時進行：通過進行所謂的血清指標， 可以計算吸光度測量值，以提供未知樣品中存在的黃疸、溶血或脂血水平的半定量表示。可 以針對血紅蛋白、膽紅素和脂質的主要干擾物質生成定量指標值，表示為H-指標（溶血）、 I-指標（黃疸）和L-指標（脂血）。對于脂血（L)的測量，使用波長700/660 nm，因為該 范圍不受溶血和黃疸影響。溶血（H)在600/570 nm測量，且針對由于脂血導致的吸收進行 校正。黃疸（I )在505/480 nm測量，且針對由于脂血和溶血導致的吸收進行校正。可以 在處理樣品的同時評價樣品的質量。基于在Roche/Hitachi系統/Cobas Integra系統/ cobas分析儀上測定的特定分析物的血清和血漿的血清指標的干擾的詳細列表顯示在手冊 "Cobas, serum indices:reduction of clinical errors in laboratory medicine，'中。
[0058] 如本文所使用的術語"截止值"用于干擾物質的定義量。在血清指標測試的情況 下，干擾物質的定義量的單位為血清指標值，表示為H(用于血紅蛋白）、L(用于脂質）和 1(用于膽紅素）值。
[0059] 如本文所使用的術語"多個波長"是指用本領域中已知的多波長光度計生成的波 長。常見光度計是分光光度計或用于濁度免疫測定法的濁度計和用于比濁免疫測定法的比 濁計。優選用于比色測定法和濁度和比濁免疫測定法的是分光光度計。在cobas? c儀器 上檢測這些測定法基于具有鹵鎢燈作為照射源、用于生成單色光的光柵和光電二極管陣列 (產生340和800 nm之間的12個波長的12個二極管）作為檢測器的光度計。光度計，例 如Roche的分析儀cobas c? 311具有同時測量300 nm至800 ± 2 nm之間的12個波長 的能力。優選使用的是波長 340、376、415、450、480、505、546、570、600、660、700、800 ±2 nm。如果用于具有同時測量多個波長的能力的自動分析儀，諸如cobas c 311，則本發明的 方法是特別有利的。根據選擇的分光光度計的結構和可用波長（其從設備至設備可不同）， 從多個波長選擇一個或多個特定波長。該測量優選在定義溫度，優選20和40攝氏度之間， 最優選在37 °C進行。
[0060] 如本文中所使用，術語"光信號"描述通過進行反應混合物的吸光度測量而獲得的 信號。光信號可以是在濁度和比色測定法的情況下的吸光度值，或比濁測定法的散射光信 號。樣品中特定分析物的光信號可以在多個波長在反應混合物中，優選在完整反應時間在 一次運行中，同時測量。根據樣品中存在的干擾物質，例如膽紅素和/或血紅蛋白和/或脂 質和/或其他干擾物質，通過與所選校準曲線比較來定量待測定樣品的特定分析物的量。 用于定量特定分析物的校準曲線的選擇可以額外根據對于樣品中特定分析物獲得的光信 號的幅度，因此考慮，樣品中特定分析物的濃度是否是低或中或高。
[0061] 通常的做法是通過使用"校準曲線"（通常也稱為標準曲線或工作曲線）來確定 分析物的濃度，所述校準曲線已經通過繪制標準樣品中分析物的已知濃度和標準樣品的分 析測量值（光信號）諸如光密度之間的相互關系來預先繪制。當校準曲線在定量分析區域 中的較寬范圍內具有足夠線性度時，校準曲線可以用相對較小數量的標準樣品來制備，所 述標準樣品靠近定量分析的測定范圍中的上限、下限和在中間點。然而，在實踐中，存在許 多通常不是線性的校準曲線。從特定波長的吸光度制備的濁度、比濁或比色測定法的校準 曲線可以是非線性的S形校準曲線，其中靈敏度在接近零的濃度處變差，并且在較高濃度 側是飽和的。S形校準的確定需要多點校準，其中必須使用多個濃度的標準樣品。
[0062] 當生成用于基于反應混合物的濁度測量的凝集測定法的校準曲線時，波長的選 擇，除了反應時間之外，對于曲線的斜率（分析靈敏度）和可實現的上部測量范圍發揮至關 重要的作用。對于直接測定形式，小波長可以導致產生具有高斜率和高信號的校準曲線，而 對于高濃度區域，曲線可以變得初期平坦，導致對于高濃度的相當的信號值，且結果也導致 低檢測上限。另一方面，較大波長可以導致具有小斜率的曲線，但對于在高濃度區域導致可 區分的信號值。因此，選擇一個波長和對應的反應時間用于目標在于生成校準曲線的信號 計算可以是分析靈敏度和上部測量范圍之間的折衷。在比色測定法中遇到類似情況。選擇 形成的有色產物的吸收最大值附近的波長確保了高信號和高靈敏度，另一方面，對于高分 析物濃度的信號可以在檢測器的指定光范圍之外。
[0063] 本發明的校準曲線針對特定分析物預先確定，且通過用于其計算的參數進行表 征：波長、反應時間、校準點數量、校準模式和測定類型。為了測定樣品的特定分析物，對于 多個波長生成多條校準曲線，每種校準曲線針對以下情況進行優化： _無干擾樣品， -溶血樣品 _黃痕樣品 -脂血樣品 -溶血和黃疸樣品 -溶血和脂血樣品 -黃疸和脂血樣品 -溶血、黃疸和脂血樣品 _以及還例如額外考慮樣品中存在的特定分析物的量的樣品情形，高、低或中。
[0064] 作為具有低濃度特定分析物的黃疸樣品的實例，將校準曲線優化用于降低黃疸干 擾，且同時實現高分析靈敏度。
[0065] 將測量結果存儲在儀器平臺的數據管理系統中。通過將樣品與分析物特異性測定 試劑混合制備測量樣品之后，允許反應混合物反應給定的完整反應時間。在完整反應時間 在上述用于記錄校準曲線的多個波長同時測量反應混合物中待測定樣品中特定分析物的 光信號。
[0066] 在樣品測量的同時，進行干擾測試，如血清指標評估，用于定量待測定樣品中存在 的膽紅素和/或血紅蛋白和/或脂質和/或其他干擾物質的量，并且將每種干擾物質的量 與預定截止值進行比較。
[0067] 最后，根據干擾測試中發現的干擾選擇校準曲線；并且除了干擾以外，也可以考慮 樣品中分析物的量用于選擇校準曲線，其通過樣品的光信號的幅度來指示。
[0068] 平行于樣品中待測定的特定分析物的測量，在實驗室分析儀上進行定量血清指標 評價，用于定量主要干擾物質，諸如血紅蛋白、膽紅素和脂質血清指標。如果針對待測定樣 品檢測干擾物質，則選擇波長用于其定量，所述波長在干擾物質的吸收范圍之外，但鄰近于 待測定的特定分析物的測定混合物的吸收最大值，以確保高信號和最佳靈敏度。
[0069] 對于本發明的每種干擾類型及其組合，建立特定校準曲線。優化校準曲線，以降低 對于一定濃度范圍的顯示干擾的樣品的干擾。校準曲線可以在包含測量波長、反應時間、校 準模式、校準點數量的多個條件下生成，并且針對每種待測定的特定分析物進行預先確定。 將所有測量結果存儲在儀器平臺的數據管理系統中并自動評價。
[0070] 通過使用這些替代波長和反應時間，其意指在干擾物質不吸收或在較小程度上吸 收的波長測量，實現了干擾的降低。
[0071] 如本文所使用的術語"測定類型"是指分析儀上的兩種基本類型的光度測定法：終 點測定法和速率測定法。測量由光度計在特定時間點進行。如果測量在反應完成后進行， 則顯色（或濁度）產品的強度是樣品組分濃度的指標。這些被稱為終點測定法。對于速率 測定法，反應速率與分析的樣品組分的濃度或活性成比例。測量在反應進行時進行。在該 儀器中可能還存在這兩種技術的改良，以及兩者的組合。
[0072] 如本文中所使用的術語"反應時間"是在終點測定的情況下用于計算其信號值的 光信號的第一（或初始）和第二（或最終）測量之間的時間段。第一（或初始）測量在將 最終試劑添加至反應混合物之前或之后不久進行。在動力學測量的情況下，反應時間可以 是用于計算表示每單位時間的吸光度變化的值的時間段。"反應時間"可以與"完整反應時 間"相同或比其更短。完整反應時間是允許由樣品和分析物特異性檢測試劑構成的反應混 合物在它們混合后反應的時間。
[0073] 如本文所使用的術語"校準模式"是指測量的信號[吸光度或（對于速率測定）吸 光度變化的速率]和目標分析物的濃度之間的有效關系的確定。此類信號/濃度關系的圖 形表示是也稱為工作曲線的校準曲線。分析儀使用不同類型的數學模型來描述這種關系。 這些數學模型被稱為校準類型或校準模式。存在兩種基本校準模式，線性和非線性校準模 式。當針對校準物濃度繪制的吸光度讀數位于一條直線上時，線性校準用于測試。如果線 性校準基于兩個校準物測量，則它被稱為線性兩點校準。如果它基于多于兩種校準物，則其 被稱為線性多點校準。
[0074] 非線性校準用于其在不同濃度的吸光度形成非線性、但可重復的圖的測試。對于 校準需要至少三種和最多六種校準物。典型的非線性校準類型是rodbard函數。此外，存 在校準類型，其校準曲線是分段定義的內插函數，如樣條（Spline)。
[0075] 如本文所使用的術語校準點的數量是用于生成校準曲線的也稱為樣品標準品的 校準物的數量。每個經優化以降低某種干擾物質的干擾的校準曲線的實例描述如下： 本發明的一個實施方案是用于未顯示干擾的樣品的校準曲線1。
[0076] 本發明的一個進一步實施方案是經優化用于顯示溶血干擾的樣品的校準曲線2。
[0077] 本發明的一個進一步實施方案是經優化用于顯示黃疸干擾的樣品的校準曲線3。
[0078] 本發明的一個進一步實施方案是經優化用于顯示脂血干擾的樣品的校準曲線4。
[0079] 本發明的一個進一步實施方案是經優化用于顯示溶血和黃疸或脂血干擾的樣品 的校準曲線5。
[0080] 本發明的一個進一步實施方案是經優化用于在低分析物濃度顯示溶血和/或脂 血和/或黃疸干擾的樣品的校準曲線6。如本文中所使用的術語"校準曲線6"從在經優化 以實現令人滿意的檢測下限的波長和在經優化以降低干擾的相同時間的反應混合物的光 信號生成。在經優化用于低濃度的特定分析物（從而優化檢測下限）的波長和在經優化以 降低干擾的相同時間記錄校準曲線6。
[0081] 本發明的一個進一步實施方案是經優化用于在高分析物濃度顯示溶血和/或脂 血和/或黃疸干擾的樣品的校準曲線7。如本文中所使用的術語"校準曲線7"從在經優化 以實現令人滿意的檢測上限的波長和在經優化以降低干擾的相同時間的反應混合物的光 信號生成。在經優化用于高濃度的特定分析物（從而優化檢測上限）的波長和在經優化以 降低干擾的相同時間記錄校準曲線7。
[0082] 本發明的一個進一步實施方案是使用多于2條校準曲線，其可以在測量范圍定 義，各自經優化以降低某一濃度范圍的樣品的干擾。
[0083] 根據光信號值和干擾物質，理想地，選擇如上所述的一種合適的校準曲線，用于定 量特定分析物，且特定分析物的量通過與選擇的校準曲線比較來定量。
[0084] 如本發明中進行的用多條校準曲線、而不是一條校準曲線工作還可以顯示進一步 的益處，諸如減輕與所需校準物的數量和濃度相關的問題以及用于校準曲線的曲線擬合程 序。
[0085] 通過在特征在于測量波長、反應時間、校準模式、校準點數量（其針對特定分析物 應用進行預先確定）的多個條件下生成多條校準曲線，現在可能與標準技術相比更精確地 測量這些樣品的特定分析物。
[0086] 通過以下標準選擇在所選波長和所選反應時間記錄的校準曲線，用于定量特定分 析物以計算分析物濃度： 1.為了選擇校準曲線，理想地在分析儀上自動作出決定，樣品是否顯示干擾，如果是， 則何種類型的干擾，溶血、黃疸和/或脂血。通過將表示為H-指標（溶血）、I-指標（黃 疸）和L-指標（脂血）的對于每種干擾物質獲得的濃度與預定的截止值比較用從干擾測 試或血清指標測試獲得的數據進行這種決定。作為結果，獲得樣品中存在的干擾的類型：樣 品可以是無干擾的，或者是溶血的，或者是黃疸的，或者是脂血的，或者是溶血的和/或黃 疸的和/或脂血的組合。根據存在于樣品中的干擾物質，選擇校準曲線用于其定量：用于以 下的校準曲線 -無干擾樣品，在最佳波長L(無干擾）和最佳反應時間t(無干擾）記錄，或 -溶血樣品，在最佳波長L(H)和最佳反應時間t(H)記錄，或 -黃疸樣品，在最佳波長L(I)和最佳反應時間t(I)記錄，或 -脂血樣品，在最佳波長L(L)和最佳反應時間t(L)記錄，或 -溶血和黃疸樣品，在最佳波長L(HI)和最佳反應時間t(HI)記錄，或 -溶血和脂血樣品，在最佳波長L(HL)和最佳反應時間t(HL)記錄，或 -黃疸和脂血樣品，在最佳波長L(IL)和最佳反應時間t(IL)記錄，或 -溶血和黃疸以及脂血樣品，在最佳波長L(HIL)和最佳反應時間t(HIL)記錄。
[0087] 2.除了干擾以外，還可以通過考慮樣品中存在的分析物量選擇校準曲線：此處， 進行樣品的特定分析物的測量的光信號的幅度與預定閾值的比較，以決定樣品是否具有高 或低的分析物濃度。在此類情況下，將生成兩條校準曲線來覆蓋用于定量分析物的測量范 圍， -對于低濃度樣品，在最佳第一波長和最佳第一反應時間記錄的第一校準曲線，和 -對于高濃度樣品，在最佳第二波長和最佳第二反應時間記錄的第二校準曲線。
[0088] 根據測量的樣品是否產生超過或低于閾值的其計算的光信號或濃度值，將使用兩 條校準曲線之一用于定量分析物。如果必要，可以考慮更多濃度水平，如高、中和低濃度水 平之間的差異；在這種情況下，定義2個預定閾值以選擇校準曲線。
[0089] 如本文中所使用，術語"第一波長"和第一反應時間針對特定分析物的低濃度進行 優化，從而盡可能提高檢測下限。這意指第一波長組合第一反應時間生成，例如，在直接測 定形式的情況下的高信號，導致具有高分析靈敏度的校準曲線。
[0090] 靈敏度、分析靈敏度、檢測下限（LDL)、空白限值（L0B)、檢測限值（L0D)和定量限 值（L0Q)是用來描述可以通過分析方法可靠測量的量度的最小濃度的術語。所有這些術語 都相關，但具有不同的定義（siehe Lit. clin biochem rev 2008，29，49)。例如，術語 "分析靈敏度"被定義為校準曲線的斜率。如本文中所使用，術語"檢測下限"（LDL)也被稱 為較低測量范圍。估計LDL的一種典型方法由測量零校準物或空白樣品的重復（諸如n= 21)，確定平均值x和標準偏差（SD)組成。LDL計算為x+2SD或x+3SD。這種用于LDL測 定的方法根據 Kaiser (H. Kaiser, Fresenius Zeitschrift fiir analytische Chemie, 1965，209，Nr. 1，第1-18頁）描述的方法。如果（在完整反應時間至少在第一和第二波 長同時測量的樣品的光信號中）樣品的至少一種光信號或其計算的至少一個信號值低于 對應的預定閾值，則分析物的濃度通過與對于具有漸增校準曲線的測定的第一波長和第一 反應時間的校準曲線的比較來確定。
[0091] 如本文中所使用，術語"第二波長"和第二反應時間針對特定分析物的高濃度進行 優化，從而盡可能提高檢測上限。這意指第二波長和第二反應時間生成，例如，在直接測定 形式的情況下上部測量范圍中不同分析物濃度的可區分信號，導致具有高上部測量范圍的 校準曲線。
[0092] 第一和第二波長是不同的，理想地相差至少5nm，或是相同的，并且，第一和第二反 應時間可以是不同或相同的。
[0093] 如本文中所使用，術語"檢測上限"（UDL)也被稱為上部測量范圍。UDL是可以可 靠地測定的樣品中分析物的最高量。在本發明中，UDL通過評價該方法的線性度、然后選擇 線性范圍內的最高濃度值作為UDL來測定。當從一系列樣品溶液的分析物回收率（測量 值）與樣品溶液中分析物的實際濃度（真實值）成比例時，該方法被稱為是線性的（Arch Pathol Lab Med 2004，128，第44-48頁）。校準曲線的形式（其可以是拋物線或S形的） 不應當與描述測量值和真實值之間關系的方法的線性度混淆。校準曲線描述信號和濃度之 間的關系。
[0094] 在本發明上下文中的術語"動態范圍"描述測定法的測量范圍的量級，且在此被定 義為檢測上限（UDL)與檢測下限（LDL)的比率。如果沒有另外說明，我們使用術語測量范 圍作為在LDL開始且在UDL結束的濃度值。主要地，除了 LDL以外，可以使用其他靈敏度術 語，如L0D或L0Q，并且除了 UDL以外，描述上部測量范圍的還有其他術語也可以用于計算動 態范圍。
[0095] 根據用于測量分析物的現有技術，本發明的波長是所謂的"主要波長"。
[0096] 本發明的一個實施方案是，任選地，進一步波長被測定為用于校正干擾和補償光 度噪聲的空白值，也稱為雙色測量（clin. Chem. 1979，25，1482 - 1484)。對于兩個主要 波長中每一個，如果記錄進一步的波長用于通過從主要波長的信號減去校正波長的信號的 校正目的，這是任選的。
[0097] 對于選擇用于定量顯示干擾的樣品中的特定分析物的各波長和反應時間，用同時 測量的標準樣品構建一條或多條校準曲線。
[0098] 如本文中所使用的術語"閾值"用于本方法的分析物的定義吸光度值或定義量，例 如表示為濃度值；優選使用濃度值。當對于分析物的定量使用一條或多條校準曲線覆蓋測 量范圍時，將閾值應用于本發明的方法。通常，使用2條校準曲線，經優化用于定量具有低 分析物濃度的樣品的第一校準曲線，和經優化用于定量具有高分析物濃度的樣品的第二校 準曲線。理想地，閾值取自兩條校準曲線從第一校準曲線改變至第二校準曲線的點。如實 施例2和圖3中所示，對于苯巴比妥測定，兩條校準曲線用于定量脂血樣品，第一校準曲線 覆蓋0至45 Mg/mL的濃度，第二校準曲線覆蓋45至60 Mg/mL的濃度。在這種情況下的閾 值為45呢/ml。在與臨床決定值不一致的濃度選擇閾值對于IVD測定是重要的。
[0099] 對于閾值的選擇，通常存在廣泛的靈活性。重要的是，在選擇的閾值，兩條校準曲 線都滿足與該方法的線性度和與精確度以及與靈敏度相關的要求。例如，第二校準曲線理 想地應當具有至少覆蓋在所選閾值的濃度的LDL ;且第一校準曲線理想地應當顯示至少直 至所述選擇的閾值的該方法的線性度。
[0100] 一種可能用于選擇用于本發明的校準曲線的最佳測量條件的程序包括以下步 驟： 1.首先，在多個波長生成一系列日期。對于我們的實施例1和2,在完整反應時間在例 如cobas c 311分析儀上可用的12個波長同時進行以下樣品的吸光度值的測量： -用于校準的一式兩份的至少2至6種標準品， -用于測定LDL的21份重復的空白樣品（分析物濃度=0)， -用于測定精確度（變異系數）的21份重復的至少2種樣品（2種不同的分析物濃 度）， -用于測定該方法的M)L和線性度的覆蓋例如比已知UDL高2-4倍的分析物濃度的稀 釋系列 _用于模擬含有漸增量干擾物質的關鍵樣品的含有分析物和漸增量的干擾物質（血 紅蛋白、膽紅素和/或脂質）的樣品。
[0101] 2.根據現有技術的方法完成用于定量無干擾樣品的校準曲線的最佳波長和反應 時間的選擇。
[0102] 3.用于定量具有干擾物質的樣品的校準曲線的最佳波長和反應時間的選擇通過 選擇以下波長來完成，所述波長在干擾物質的吸收范圍之外或幾乎之外，但其仍然最接近 于對于待測定的分析物特異性的測定混合物吸收最大值，以確保高信號，和因足夠的靈敏 度。然后使用點1中生成的數據通過試驗和誤差方法選擇最佳反應時間： 對于具有固定分析物濃度且用漸增量的干擾物質摻入的樣品系列，在試驗和誤差程序 中對于不同條件（如上定義的最佳波長，反應時間）確定理論分析物濃度（無干擾的樣品 的濃度）的回收率。當理論分析物濃度的回收率在+/-10%之內時，在給定濃度的干擾物質 被定義為耐受的（或者顯示無干擾）。選擇相比于高濃度的干擾物質產生最佳耐受的波長 和反應時間。
[0103] 對于這些選擇的波長和反應時間，計算UDL和LDL，且選擇產生最佳測量范圍的條 件（波長和反應時間）用于校準曲線。理想地，應當覆蓋測量范圍，其與用來自點2的無干 擾樣品實現的測量范圍相當。在實施例1中，應用該程序。
[0104] 4.選擇用于定量具有干擾物質的樣品的校準曲線的最佳波長和反應時間且同時 額外考慮分析物量由降低干擾且同時獲得具有最佳測量范圍的校準的目標所驅動。為了該 目的，定義至少兩條校準曲線：用于低分析物濃度且因此覆蓋測量范圍的低端的在第一波 長和第一反應時間記錄的第一校準曲線，和用于高分析物濃度且因此覆蓋測量范圍的高端 的在第二波長和第二反應時間記錄的第二校準曲線。用于選擇最佳條件的可能方法包括： -對于如點3中所述的給定干擾選擇最佳波長， _然后，對于至少一種具有低分析物濃度的樣品系列和一種具有高分析物濃度的樣品 系列，每種樣品系列摻入漸增量的干擾物質，在試驗和誤差程序中對于不同條件（如點3中 定義的最佳波長，反應時間）確定理論分析物濃度（無干擾的樣品的濃度）的回收率。當 理論分析物濃度的回收率在+/-10%之內時，在給定濃度的干擾物質被定義為耐受的（或者 顯示無干擾）。選擇相比于高濃度的干擾物質產生最佳耐受的波長和反應時間。
[0105] 對于這些選擇的波長和反應時間，計算UDL(對于高分析物樣品）和LDL(對于低 分析物樣品），且選擇產生最佳測量范圍的條件（波長和反應時間）用于第一校準曲線（低 分析物樣品）和第二校準曲線（高分析物樣品）。理想地，應當覆蓋測量范圍，其與用來自 點2的無干擾樣品實現的測量范圍相當。在實施例2中，應用該程序。
[0106] 本發明的一個實施方案是提供用于校正校準曲線的情況。
[0107] 如本文中所使用，術語"完整反應時間"是在多個波長測量特定分析物的時間段。 為了選擇最佳的兩個波長（目的在于生成兩條校準曲線），在cobas c?儀器上可用的12 個不同波長同時測量標準品。僅考慮處于檢測器的光學范圍內的吸光度值（〇.〇〇〇〇 -3. 0000吸光度）。
[0108] 本免疫測定時間的典型完整反應時間在1到20分鐘之間變化。優選地，多波長分 光光度計光度計的完整反應時間優選為10分鐘左右。本發明的一個實施方案是在完整反 應時間過程中測量特定分析物的光信號。最優選地，至少在第一和第二主要波長同時測量 特定分析物的光信號。如本文中所使用，術語"時間延遲"是用于檢測特定分析物的第一和 第二主要波長之間的時間段。
[0109] 如本發明中所使用，術語"同時"可意指小于60X秒的時間延遲，例如小于10x秒、 優選小于lx秒、最優選小于1 ms或者甚至小于0. lx ms的時間延遲。最優選地，術語"同 時"意指沒有時間延遲。
[0110] 本發明的一個進一步方面是用于降低顯示溶血和/或黃疸和/或脂血干擾的樣品 的基于分光光度的實驗室測試的干擾的方法，其中將包含測量波長、測定點、校準點和校準 模式的特定測量條件額外應用于測量方案，而無需應用預分析樣品處理和/或改變測定方 法。
[0111] 一個實施方案進一步是根據本發明的方法，其中根據樣品是否是溶血的和/或脂 血的和/或黃疸的選擇多條校準曲線中的一條或多條，且通過與選擇的校準曲線的比較定 量特定分析物的量。
[0112] 本發明的一個進一步方面是額外應用于測量方案的特定測量條件用于降低測定 可以顯示溶血和/或黃疸和/或脂血干擾的樣品中特定分析物的量的基于分光光度的實驗 室測試的干擾的用途，所述特定測量條件包含測量波長、反應時間、校準點、和校準模式。
[0113] 本發明的一個進一步方面是使用用于測量樣品中特定分析物的量的可商購的分 光光度實驗室測試的儀器平臺，所述樣品可以顯示溶血和/或黃疸和/或脂血干擾，其中所 述儀器平臺的數據管理系統能夠處理反應時間、校準點、校準模式、波長、血清指標的數據， 用于選擇最佳擬合校準曲線。
[0114] 附圖簡述 m顯示干擾物質膽紅素、血紅蛋白和脂質的吸收光譜。
[0115] Ml顯示如實施例1中所述根據本發明的方法用于降低CRP測定中的溶血干擾的 可能工作流程。
[0116] Ml顯示如實施例2中所述根據本發明的方法用于降低苯巴比妥測定中的脂血干 擾的可能工作流程。 實施例
[0117] 實施例1 :CRP測定中溶血干擾的降低 本發明用于降低溶血樣品的干擾的方法的益處使用Roche的商業CRP L3測定法、膠乳 增強池度免疫測定法和Roche的cobas c311分析儀進行評價。
[0118] 儀器 cobas c311: 具有多波長分光光度計作為檢測單兀的Roche的（Roche Diagnostics GmbH) cobas c311分析儀用于本實驗。該儀器自動移取樣品和檢測試劑至反應室（reaction cells)。可 以將多達3種不同試劑R1、R2和R3添加至樣品。該儀器使用鹵鎢燈作為照射源（12 V / 50 W)，并用由12個光電二極管組成的光電二極管陣列在12種不同波長（在340、376、415、 450、480、505、546、570、600、660、700 和 800 ± 2 nm)同時測量吸光度。光路長度為 5. 6 mm，且檢測器的光范圍為0.0000 - 3. 0000吸光度。對于每個反應室（reaction cell)，測 量水空白，然后在10分鐘（在這里也稱為完整反應時間）內57次采集吸光度讀數，因此對 于每個波長的吸光度得到總共57個測量點，也稱為光度點或測定點。濃度可以通過使用這 些測量點中的至少一個來計算。在該儀器上存在兩種基本類型的光度測定法：終點測定法 和速率測定法。測量在37攝氏度進行。
[0119] CRP L3 測定法： Roche的CRP L3測試（CRPL3，目錄號04956842)的測定原理：具有用單克隆抗CRP 抗體包被的膠乳顆粒的人CRP凝集物；濁度測定該聚集物。
[0120] cobas c包裝中提供用于所有Roche測試的試劑。這些盒（cassettes)包含一至 三個特別設計的試劑瓶，且具有詳細的相關試劑和測試的條形碼標記。對于CRP L3測試， 盒中使用兩種試劑：R1 (具有牛血清白蛋白和防腐劑的TRIS緩沖液）和R2 (用甘氨酸緩 沖液中的抗CRP(小鼠）、免疫球蛋白（小鼠）和防腐劑包被的膠乳顆粒）。來自CRP L3測 試的包裝插頁中描述的程序用作標準方法。
[0121] 移取方案：隨后將2 ii L樣品和150 ii L試劑R1添加至反應室，隨后添加48耵試 劑R2,用24 yl稀釋液（水）稀釋，并混合反應混合物。
[0122] 測量條件：對于測量，使用570nm作為主要波長，且使用800nm作為校正波長。測 定類型是兩點終點測定法。兩點終點測定法是執行樣品空白的終點測定法。在這里考慮在 兩個不同測量點的兩個吸光度讀數：通常在添加最終試劑之前或之后不久采集第一讀數； 在添加最終試劑之后任何時間點采集第二讀數。用于校準曲線和因此用于濃度計算的吸光 度值通過從第二讀數減去第一讀數而獲得。對于CRP L3,第一讀數是在測量點8,且意指添 加最終試劑之后不久，第二讀數在測量點18,其對應于2. 0分鐘的反應時間。為了生成校準 曲線，一式兩份測量來自Roche (目錄號11355279)的6份標準品，使用樣條（spline)作 為校準模式，其擬合通過三階多項式近似的測量校準物的數據點之間的范圍，從而使得獲 得平滑校準曲線。
[0123] 用于評價干擾的稈序: CRP L3測定用無干擾和溶血樣品運行，其使用包裝插頁文獻中描述的標準方法（參 見下文，a)，和與標準方法相比使用其他波長用于吸光度測量的新方法（參見下文，b)。在 cobas c311上一式三份測量樣品。最后，評價用兩種方法獲得的溶血干擾的幅度：對于所 有含有血紅蛋白的樣品計算測量的CRP濃度的回收率（中值），并與用無干擾樣品獲得的 CRP值進行比較。當初始CRP濃度值的回收率在+/- 10%內時，樣品是無干擾的；落在該回 收率區域內的結果是可報道（準確）的結果。
[0124] 溶血血清樣品：通過將不同的血紅蛋白量添加至?154和?1397 mg/dL之間的濃度 且用人CRP摻入至5 mg/L而生成。
[0125] 無干擾血清樣品：通過用人CRP摻入至5 mg/L而生成。
[0126] a)標準方法： ?主要波長：570 nm ?次要波長（用于校正目的）：800 nm ?完整反應時間/反應時間：10 min / 2. 0 min ? 6點校準 籲校準模式：樣條（spline) 籲測定類型：終點（2點終點） b)新方法： ?主要波長：600 nm ?次要波長（用于校正目的）：800 nm ?測定時間/反應時間：10 min / 2. 0 min ? 6點校準 籲校準模式：樣條（spline) 籲測定類型：終點（2點終點）。
[0127] 結果: 如表1中所不，當使用標準方法時，在最1?達612的H指標（612 mg/dl的血紅蛋白濃 度）沒有發現溶血的干擾。對于較高的H指標，回收率在+/- 10%窗口之外。
[0128] 如表2中所示，當使用新方法時，在最高達至少1397的H指標C1397 mg/dl的血 紅蛋白濃度）沒有發現溶血的干擾。
[0129] 該結果顯示當使用新方法時關于測定耐受的溶血程度改進約2. 3倍。換言之，通 過應用新方法，溶血干擾降低2. 3倍。對于新方法的實施，不需要試劑配制的任何變化；只 有分析儀的軟件必須適用于方法的完全自動化處理。
[0130] CRPL3測定的新方法的應用由于波長和反應時間的變化導致測定表現的一些變 化：盡管檢測上限（UDL)保持類似于標準方法，但檢測下限（LDL )稍微受損（0. 06 mg/L至 0. 09 mg/L)。
[0131] 對于該測定，根據本發明的分析儀上的可能工作流程將是（也參見圖2): -對于CRP生成校準曲線 -在標準條件下記錄的校準曲線（標準方法a) -在新條件下記錄的校準曲線（新方法b) _在以下測定中同時測量樣品 -血清指標測定和 -至少在以下波長的CRPL3測定：570nm、600nm、800nm -基于血清指標測定中獲得的H指標值和其與截止值的比較（H= 612，H= 1397)，由 分析儀選擇相應的校準曲線用于定量樣品中的CRP : -612:在標準條件下記錄的校準曲線（標準方法a) -H> 612，1397:在新條件下記錄的校準曲線（新方法b) -H> 1397:拋棄樣品 -通過光信號與所選校準曲線的比較測定樣品中的CRP量。 衣I:標複.//法的數慰
【權利要求】
1. 用于通過光度測定法測定可以顯示干擾的樣品的特定分析物的量的方法，其中所述 特定分析物從所述分析物與分析物特異性測定試劑相互作用后反應混合物的光信號中的 變化來定量，所述方法包括以下步驟： a) 對于待測定樣品的特定分析物，對于多個波長生成多條校準曲線，且將測量結果儲 存在儀器平臺的數據管理系統中， b) 同時進行干擾測試以測定特定分析物，用于定量待測定樣品中存在的干擾物質的 量，且將每種干擾物質的量與預定截止值進行比較， c) 在多個波長測量所述反應混合物中待測定樣品的特定分析物的光信號， d) 根據所述干擾物質選擇步驟a的相應校準曲線，和 e) 通過與所選波長的所選校準曲線的比較來定量待測定樣品的特定分析物的量。
2. 根據前述權利要求的方法，其中將包含反應時間、校準點、校準模式和測定類型的特 定測量條件額外應用于測量方案。
3. 根據前述權利要求的方法，其中顯示干擾的樣品可以在相應的儀器平臺上使用可 商購的分光光度實驗室測試來定量，而無需應用預分析樣品處理和/或改變測定制劑和程 序。
4. 根據前述權利要求之一的方法，其中在波長1記錄的校準曲線1用于未顯示干擾的 樣品。
5. 根據前述權利要求之一的方法，其中使用在波長2記錄的校準曲線2,其經優化用于 顯示溶血干擾的樣品。
6. 根據前述權利要求之一的方法，其中使用在波長3記錄的校準曲線3,其經優化用于 顯示黃疸干擾的樣品。
7. 根據前述權利要求之一的方法，其中使用在波長4記錄的校準曲線4,其經優化用于 顯示脂血干擾的樣品。
8. 根據前述權利要求之一的方法，其中使用在波長5記錄的校準曲線5,其經優化用于 顯示溶血和黃疸或脂血干擾的樣品。
9. 根據前述權利要求之一的方法，其中使用在波長6記錄的校準曲線6,其經優化用于 在低分析物濃度顯示溶血干擾的樣品。
10. 根據前述權利要求之一的方法，其中使用在波長7記錄的校準曲線7,其經優化用 于在高分析物濃度顯示溶血干擾的樣品。
11. 根據前述權利要求之一的方法，其中可以在測量范圍定義多于2條校準曲線，各自 經優化以降低某一濃度范圍的樣品的干擾。
12. 用于降低顯示溶血和/或黃疸和/或脂血和/或其他干擾的樣品的基于分光光度 的實驗室測試的干擾的方法，其中將包含測量波長、反應時間、校準點、校準模式的特定測 量條件額外應用于測量方案，而無需應用預分析樣品處理和/或改變測定方法。
13. 額外應用于測量方案的特定測量條件用于降低測定可以顯示溶血和/或黃疸和/ 或脂血干擾的樣品中特定分析物的量的基于分光光度的實驗室測試的干擾的用途，所述特 定測量條件包含測量波長、反應時間、校準點、和校準模式。
14. 儀器平臺，其使用用于測定可以顯示溶血和/或黃疸和/或脂血干擾的樣品中特定 分析物的量的可商購的分光光度實驗室測試，其中所述儀器平臺的數據管理系統能夠處理 反應時間、校準點、校準模式、波長、血清指標的數據，用于選擇最佳擬合校準曲線。
15.根據前述權利要求的方法，其中進行包含測量波長、反應時間、校準模式、校準點數 量的測量結果的額外校正，且針對彼此進行抵消。
【文檔編號】G01N21/27GK104395729SQ201380033722
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2013年4月25日 優先權日:2012年4月26日
【發明者】G.庫爾茨, E.洛佩斯-卡勒 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司