專利名稱：區分螺旋藻品系生產性狀優劣度的方法
技術領域：
本發明屬于螺旋藻開發應用的技術，特別涉及一種區分螺旋藻品系生產性狀優劣度的方法。
背景技術：
螺旋藻(Spirulina)，是一種光合放氧、呈規則螺旋的原核絲狀微藻，系藍藻門(Cyanophyta)> 顫藻目(OsciIlatoriales)> 顫藻科(Oscillatoriaceae)的一個屬[武漢植物學研究，1997，15(4): 369-374]。因富含優質蛋白和多種生物活性物質而受到國內外的極大關注，并已在大量研究的基礎上形成了龐大的螺旋藻產業，成為目前全球研究開發規模最大、應用前景最廣泛的經濟微藻。值得指出的是，眾多的實驗研究與長期的生產實踐表明:螺旋藻不同品種(系)，對溫度、光質、光照強度以及培養液的鹽度、PH和營養成分等環境因子的要求與適應性存在顯著差異，由此產生的經濟效益也相差甚遠[水生生物學報，1999，23(1): 59-64]。所以，與其它農業與生物技術產業一樣,選育品性兼優的品種(系)是有效提升當前螺旋藻產業經濟效益、切實解決生產實際問題的最直接而重要的途徑之一 O目前國內外篩選適合大規模生產螺旋藻品種(系)的常規方法如下:1、對新分離到的品種(系)進行編號；2、在實驗室條件下做多種環境因子的交叉組合培養試驗，并根據所測定的生長曲線、光合放氧和生化組成等指標進行初步篩選；3、對實驗室初篩到有生產養殖潛力的候選品種(系)在不同季節、氣候及營養條件下進行養殖小試、中試與生產性試驗，再篩選出目標品種(系)。這一方法雖然實用、有效，但程序繁瑣、工作量大、周期長，且成本高。因此，迫切需要建立一種簡單、高效、低成本的評價與篩選方法，以滿足當前國內外螺旋藻產業不斷發展的實際需要。
發明內容
本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種簡單、高效、低成本的區分螺旋藻品系生產性狀優劣度的方法。為解決技術問題，本發明的解決方案是:提供一種區分螺旋藻品系生產性狀優劣度的方法，包括以下步驟:用Tris-HCl提取液提取得到螺旋藻細胞的水溶性蛋白，經十二烷基磺酸鈉_聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對蛋白樣品分離后,利用Quantity One分析軟件檢測蛋白質電泳圖譜102kD處蛋白帶的光密度值，并根據其值構建藻株間的聚類圖；若候選品系的蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀好，適用于大規模培植生產；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀差，不適用于大規模培植生產。本發明具體包括下述步驟:
1、選用9株螺旋藻品系作為樣本，包括4株生產性狀好的品系:Sp-4、Sp-5、Sp-15和Sp-17 ；5株生產性狀不好的品系:Sp-l、Sp-2、Sp_6、Sp-9和Sp-1O ；2、試劑和儀器蛋白質分子量標準購自GE Healthcare Biosciences (美國)；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)等購自Amresco (美國)。所用的垂直電泳系統和紫外-可見掃描分光光度計等為AmershamPharmcia Biotech (美國)產品；冷凍干燥儀為VirTis (美國)產品；掃描儀GS-800和Quantity One分析軟件等為Bio-Rad (美國)產品；3、水溶性蛋白的制備取0.75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，加入3ml Tris-HCl提取液(125mMTris-HCI,0.9% NaCl, pH 6.8)，在_20°C冷凍1.5h后再在4°C融化2h，如此反復凍融3次直至出現深藍紫色熒光。4°C下12000r/min離心20min得上清液即為螺旋藻水溶性蛋白；在上述所提的上清液中加入3倍體積預冷的丙酮溶液，混勻后_20°C靜置2h，4°C下12000r/min離心20min，棄上清液；沉淀經真空冷凍干燥后，加入適量SDS上樣緩沖液使其溶解，即制得用于十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的蛋白樣品。4、SDS-PAGE 和軟件分析蛋白質濃度測定參照Bradford [Anal Biochem, 1976, 72: 248一254]的考馬斯亮藍 G-250 法進行；蛋白質 SDS-PAGE 分析參照 Laemmli [Nature, 1970, 227: 680— 685]的方法進行，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%。先以80V電泳45min后，再以120V電泳使溴酚藍至膠底部。用考馬斯亮藍G-250染色，脫色后凝膠成像，利用Quantity One分析軟件對蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值進行檢測分析，并根據其值利用SPSS13.0統計分析軟件構建藻株間的聚類圖，構建藻株間的聚類圖，通過聚類情況來鑒別該品系生產性狀的優劣。本發明的有益效果是:本發明所建立的區分螺旋藻生產性狀優良品系的方法與常規方法相比，不僅簡單、高效、可靠、成本低，而且不用進行核酸測序與生物信息學比對等復雜試驗和分析，因而適合大規模、高通量篩選。
圖1為9株螺旋藻品系水溶性蛋白的SDS-PAGE凝膠圖；其中M:標準分子量；I 9:依次對應 Sp-1、Sp-2、Sp-6、Sp-10、Sp-9, Sp_4、Sp_5、Sp-17 和 Sp_15。圖2為9株用于構建生產性狀鑒別標準的螺旋藻品系的聚類圖。圖3為被鑒別藻株Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp_37的SDS-PAGE凝膠圖；其中M:標準分子量;1 4:依次對應 I:Sp-18 ；2:Sp-3 ；3:Sp-16 ；4:Sp_37。圖4為被鑒別藻株Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp_37在所建鑒別標準中的歸類圖。
具體實施例方式蛋白質的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)技術已被廣泛應用于煙草、水稻、木本植物和海藻等生物的分類和鑒定等領域，但有關螺旋藻蛋白質的SDS-PAGE指紋圖譜及相關分析方法在分類和鑒定等方面的應用，卻鮮有報道。本發明建立了一種以檢測蛋白指紋圖譜在102kD處條帶光密度值的大小，并通過聚類來鑒別螺旋藻生產性狀的優良及能否應用于大規模生產養殖的新方法。我們以9 株公知的螺旋藻 Sp-1、Sp-2、Sp_4、Sp_5、Sp-6, Sp_9、、Sp_10、Sp-15 和Sp-17為對照材料,經蛋白質的SDS-PAGE及利用Quantity One軟件檢測其蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶光密度值的大小，并根據其大小進行聚類分析，結果發現，9株品系可分為兩大類:Sp-4、Sp-5、Sp-15 和 Sp-17 為第 I 類；Sp_l、Sp-2、Sp-6, Sp-9 和 Sp-10 為第 II類。長期的科學研究與生產實踐表明，上述第I類中的4株品系在實際生產養殖中表現優良，而第II類中的5株品系因適應能力差而不宜用作工廠化生產養殖。由此可見，蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶光密度值的大小可用于鑒別螺旋藻生產性狀的優良。即若候選品系的蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀好，適用于大規模培植生產；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀差，不適用于大規模培植生產。本發明的詳細技術方案可以通過以下步驟實施:1、選用材料為公知的 9 株螺旋藻品系 Sp-1、Sp-2、Sp-4、Sp-5、Sp-6、Sp-9、Sp-10、Sp-15和Sp-17，在浙江大學原子核農業科學研究所生物資源與分子工程實驗室也有保存。其中，Sp-4、Sp-5、Sp-15和Sp-17因生產性狀好，被廣泛應用于大規模養殖生產；而Sp-1、Sp-2、Sp-6、Sp-9和Sp-10因生產性狀差而不適用于工廠化生產。2、試劑和儀器蛋白質分子量標準購自GE Healthcare Biosciences (美國)；丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris、甘氨酸、十二烷基磺酸鈉(SDS)、過硫酸銨(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)等購自Amresco (美國)。所用的垂直電泳系統和紫外-可見掃描分光光度計等為AmershamPharmcia Biotech (美國)產品；冷凍干燥儀為VirTis (美國)產品；掃描儀GS-800和Quantity One分析軟件等為Bio-Rad (美國)產品；3、水溶性蛋白的制備取0.75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，并加入Tris-HCl提取液(125mMTris-HCI,0.9% NaCl,pH 6.8) 3ml，在 _20°C冷凍 1.5h 后再在 4°C融化 2h，如此反復凍融 5次至出現深藍紫色熒光，并在顯微鏡下鏡檢無完整細胞。4°C下12000r/min離心20min得上清液即為螺旋藻水溶性蛋白；4、SDS-PAGE 和軟件分析蛋白質濃度測定參照Bradford [Anal Biochem, 1976, 72: 248一254]的考馬斯亮藍 G-250 法進行；蛋白質 SDS-PAGE 分析參照 Laemmli [Nature, 1970, 227: 680— 685]的方法進行，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5%。先以80V電泳45min后，再以120V電泳使溴酚藍至膠底部。用考馬斯亮藍G-250染色，脫色后凝膠成像，利用Quantity One分析軟件對蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值進行檢測分析，并根據其值利用SPSS13.0統計分析軟件構建藻株間的聚類圖，通過聚類情況來鑒別該品系生產性狀的優劣。5、結果與分析圖1為9株螺旋藻品系水溶性蛋白的SDS-PAGE凝膠圖；利用Quantity One軟件對蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶光密度值進行檢測，并根據其值進行聚類分析，如圖2所示，9株螺旋藻品系可分為兩大類:Sp-4、Sp-5、Sp-15和Sp-17為第I類；Sp_l、Sp-2、Sp-6、Sp-9 和 Sp-10 為第 II 類。長期的科學研究與生產實踐表明，上述第I類中的4株品系在實際生產養殖中表現優良，而第II類中的5株品系因適應能力差而不宜用作工廠化生產養殖。由此可見，蛋白電泳圖譜在102kD處蛋白帶光密度值的大小可用于鑒別螺旋藻生產性狀的優劣。即若候選品系的蛋白電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀好，適用于大規模培植生產；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀差，不適用于大規模培植生產。進一步利用NanoLC-MS/MS對生產性狀好與差兩組節旋藻品系SDS-PAGE上102kD處的蛋白帶進行質譜鑒定與生物信息學分析與比較發現，生產性狀好的品系具有一種特異性的蛋白——麥芽寡糖基海藻糖合成酶，而在生產性狀差的品系中沒有。麥芽寡糖基海藻糖合成酶能催化合成海藻糖。而海藻糖在高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等外界惡劣環境條件下能在生物體細胞表面形成獨特的保護膜，有效地保護蛋白質分子不變性失活，維持生命體正常的生命過程和生物特征，從而使生物體對外界環境有更好的適應能力(邵引剛等.海藻糖的應用及基因工程研究.安徽農業科學.2008，36(3): 857-859)。因此，生產性狀好的品系中由特有的麥芽寡糖基海藻糖合成酶合成的海藻糖，能有效地抵御節旋藻培植過程中高溫和滲透壓驟變等各種不良環境，使用權其表現出更好的生產性狀；而生產性狀差的品系，因缺乏該合成酶而不能合成海藻糖，致使其對環境等變化更敏感而表現出更差的生產性狀。可見，節旋藻SDS-PAGE上102kD處的蛋白帶與品系的生產性狀密切相關。作為實例，我們選取公知的Sp-3、Sp-16、Sp_18和Sp_37這4株品系來驗證本發明的實用性，其中，Sp-3和Sp-16品系的生產性狀好，被廣泛應用于大規模養殖生產，而Sp-18和Sp-37因生產性狀差而不適用于工廠化生產。Sp-3、Sp-16、Sp-18和Sp_37這4株品系的水溶性蛋白經SDS-PAGE獲得蛋白質電泳圖譜(圖3 )，利用Quantity One軟件檢測蛋白質是泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值，然后根據其值進行聚類分析。結果如圖4所示，Sp-3和Sp-16的蛋白指紋圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值都大于140，且都能與已知生產性狀好的品系聚到一起，說明該品系生產性狀好，適用于大規模培植生產；而Sp-18和Sp-37的蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值都小于40，且都能與已知生產性狀差的品系聚到一起，說明該品系生產性狀差，不適用于大規模培植生產。該例子進一步說明，通過檢測蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值來鑒別該品系生產性狀的優良，可作為一種簡單、高效、低成本的方法來鑒別螺旋藻生產性狀的優劣。
權利要求
1.一種區分螺旋藻品系生產性狀優劣度的方法，其特征在于，包括以下步驟: 用TriS-HCl提取液提取得到螺旋藻細胞的水溶性蛋白，經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白樣品分離后，利用Quantity One分析軟件檢測蛋白質電泳圖譜102kD處蛋白帶的光密度值，并根據其值構建藻株間的聚類圖；若候選品系的蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀好，適用于大規模培植生產；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀差，不適用于大規模培植生產。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，具體包括下述步驟: 取0.75g鈍頂螺旋藻藻泥于5ml離心管中，加入3ml Tris-HCl提取液利用凍融破壁的方法提得水溶性蛋白； 進行蛋白質SDS-PAGE分析，分離膠濃度為12.5%，濃縮膠濃度為5% ;先以80V電泳45min后，再以120V電泳使溴酚藍至膠底部。用考馬斯亮藍G-250染色，脫色后凝膠成像； 利用Quantity One分析軟件檢測蛋白質電泳圖譜在102kD處蛋白帶的光密度值,根據其值利用SPSS13.0統計分析軟件構建藻株間的聚類圖，并通過聚類情況鑒別該品系生產性狀的優劣。
全文摘要
本發明涉及螺旋藻開發應用技術，旨在提供一種區分螺旋藻品系生產性狀優劣度的方法。該方法是用Tris-HCl提取液提取得到螺旋藻細胞的水溶性蛋白，經十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對蛋白樣品分離后，檢測蛋白質電泳圖譜102kD處蛋白帶的光密度值，并根據其值構建藻株間的聚類圖；若候選品系在102kD處蛋白帶的光密度值大于140，且與已知生產性狀好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀好，適用于大規模培植生產；若在102kD處蛋白帶的光密度值小于40，且與已知生產性狀不好的品系聚到一起，則說明該品系生產性狀差，不適用于大規模培植生產。本發明簡單、高效、可靠、成本低，不用進行核酸測序與生物信息學比對等復雜試驗和分析，因而適合大規模、高通量篩選。
文檔編號G01N21/84GK103149211SQ20131006696
公開日2013年6月12日 申請日期2013年3月3日 優先權日2013年3月3日
發明者汪志平, 于金鑫, 劉新穎, 呂蓓芬, 馬麗芳, 陳子元 申請人:浙江大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
