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檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考三合一膠體金層析試紙條及其制備方法
【專利摘要】一種檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，屬于免疫學檢測【技術領域】。本發明包括單克隆抗體的制備和膠體金免疫層析試紙條的制備兩部分。該單克隆抗體可同時識別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考，并具有高的靈敏度；膠體金免疫層析試紙條包括聚氯乙烯背襯，聚氯乙烯背襯前端設置樣品墊，樣品墊與硝酸纖維素膜前端連接，硝酸纖維素膜后端與吸水墊連接；結合墊為膠體金標記的單克隆抗體；硝酸纖維素膜上依次包被有氯霉素琥珀酸鈉-BSA抗原檢測線T線和羊抗鼠IgG控制線C線。本發明檢測快速，僅需要3-5min；便攜，適合現場檢測；操作簡便，不需要專業技術人員。
【專利說明】檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考三合一膠體金層析試紙條及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，屬于免疫學檢測【技術領域】。

【背景技術】
[0002]氯霉素類抗生素是廣泛使用的獸藥之一。目前主要有氯霉素(CAP)、甲砜霉素(TAP)和氟苯尼考(FF)三種藥物，其中甲砜霉素是氟苯尼考的衍生物，它們的抗菌作用與氯霉素相似。氯霉素會導致人體再生障礙性貧血，這種毒性作用與劑量和療程無關，國際上相繼禁止或嚴格限制使用氯霉素。氟苯尼考和甲砜霉素是氯霉素的替代物，但大量使用導致其在畜產品以及奶制品中大量殘留，危害人體健康。因此，我國規定氯霉素禁止使用，甲砜霉素在各動物組織的最大殘留限量為50μ g/kg，氟苯尼考胺為氟苯尼考的標志殘留物，在肌肉中的最大殘留限量為1000 μ g/kg。
[0003]動物飼料和組織中氯霉素類藥物殘留是獸藥殘留研究領域的重點監控對象，因此，亟待建立一種快速、靈敏、準確的氯霉素類藥物殘留檢測方法，確保動物性食品的安全。
[0004]目前的檢測方法主要是儀器分析法和免疫分析法。儀器分析方法主要包括高效液相色譜法、液質聯用(HPLC-MS)、氣質聯用(GC-MS)等，這些方法精密度高但需要昂貴的儀器設備，操作需要專業技術人員，且不能適應高通量、現場的快速檢測。免疫分析法主要為酶聯免疫檢測法，其檢測成本高，并不適合企業低成本檢測的需要。因此實現具有快速、便于攜帶、低成本的多殘留檢測具有現實意義。


【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種能夠檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的膠體金免疫層析試紙條及其制備方法，該方法是基于能同時識別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考三種藥物，并具有高靈敏度的單克隆抗體。
[0006]本發明的技術方案，一種檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，包括聚氯乙烯PVC背襯，聚氯乙烯PVC背襯前端設置樣品墊，樣品墊通過結合墊與硝酸纖維素膜前端連接，硝酸纖維素膜后端與吸水墊連接；所述結合墊上含有膠體金標記的單克隆抗體；硝酸纖維素膜上包被有氯霉素琥珀酸鈉-BSA檢測線T線和羊抗鼠IgG控制線C線。
[0007]氯霉素琥珀酸鈉-BSA是用于檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的抗原，檢測線與質控線平行。
[0008]膠體金標記能同時識別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的制備與純化:
以甲砜霉素的類似物即1- (4-氨基苯基)-2- 二氯乙胺-1，3-丙二醇TAP-NH2作為半抗原，采用重氮化法將其與牛血清蛋白BSA偶聯得到免疫原，混合弗氏佐劑免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞sp/20融合，經過三次亞克隆和間接競爭ELISA的篩選得到能穩定分泌可同時識別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的細胞株，將其進行擴大培養后，注射到小鼠體內誘發產生腹水；采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水即得到單克隆抗體。
[0009]所述檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條的制備方法，步驟為:
(1)可同時識別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的制備與純化:
(2)檢測抗原氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯物的制備:將氯霉素琥珀酸鈉與水溶性碳二亞胺EDC以摩爾比1: 3溶于0.lmol/L、pH 6.5的2-(N-嗎啡啉)MES緩沖溶液中，室溫活化6h，之后將活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.01mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液PBS中，牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸鈉的摩爾比為1: 40，室溫反應12h，4°C透析3天，形成氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯物；
(3)膠體金溶液的制備:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20-40nm膠體金顆粒；
(4)該單抗標記的膠體金溶液的制備:取步驟(3)制備的4mL膠體金調至pH9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的單克隆抗體0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min后，10000r/min離心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩沖液4mL重懸兩次，最后用該硼酸鹽緩沖液0.4mL重懸，得到穩定的單克隆抗體-膠體金標記物；
(5)小鼠血清-膠體金標記物的制備:將步驟(4)中的受體替換為陰性小鼠的純化血清，重復步驟(4)，得到小鼠血清-膠體金標記物；
(6)硝酸纖維素膜的處理:將氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應墊的硝酸纖維素膜的檢測線T線和控制線C線，在37°C烘箱干燥；即得到包被后的硝酸纖維素膜；
(7)三合一試紙條的組裝:將樣品墊(2)、結合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)、吸水墊(5)由一端依次黏附在PVC背襯(I)上，即得到用于檢測的免疫層析試紙條。
[0010]所述的檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，其對甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素的最低檢測限分別是lng/mL,2.5ng/mL, Ing/mL。
[0011]本發明的有益效果:本發明提供一種便攜、快速、適合進行現場檢測的免疫層析色譜檢測法(gold immunochromatography assay ;GICA),能實現甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的同時檢測。本發明檢測快速，僅需要3-5分鐘；便攜，適合現場檢測；操作簡便，不需要專業技術人員。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1組裝完成的免疫層析試紙條俯視圖。
[0013]圖2該試紙條對甲砜霉素的檢測結果。
[0014]圖3該試紙條對氟苯尼考的檢測結果。
[0015]圖4該試紙條對氯霉素的檢測結果。

【具體實施方式】
[0016]實施例1
如圖1所示，一種檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，包括聚氯乙烯PVC背襯1，聚氯乙烯PVC背襯I前端設置樣品墊2，樣品墊2通過結合墊3與硝酸纖維素膜4前端連接，硝酸纖維素膜4后端與吸水墊5連接；所述結合墊3上含有膠體金標記的單克隆抗體；硝酸纖維素膜4上包被有氯霉素琥珀酸鈉-BSA檢測線T線6和羊抗鼠IgG控制線C線7。
[0017]實施例2
所述檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條的制備方法，步驟為:
(1)可同時識別甲砜霉素、氯霉素和氟苯尼考的單克隆抗體的制備與純化:以甲砜霉素的類似物，即1-(4-氨基苯基)-2- 二氯乙胺-1，3-丙二醇(TAP-NH2)作為半抗原,米用重氮化法將其與牛血清蛋白(BSA)偶聯得到免疫原，混合弗氏佐劑免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞sp2/0融合，經過三次亞克隆和間接競爭ELISA的篩選得到能穩定分泌可同時識別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的細胞株，將其進行擴大培養后，注射到小鼠體內誘發產生腹水；采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水即得到單克隆抗體；
(2)檢測抗原氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯物的制備:將氯霉素琥珀酸鈉與水溶性碳二亞胺EDC以摩爾比1: 3溶于0.lmol/L、pH 6.5的2-(N-嗎啡啉)MES緩沖溶液中，室溫活化6h，之后將活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.01mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液PBS中，牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸鈉的摩爾比為1: 40，室溫反應12h，4°C透析3天，形成氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯物；
(3)膠體金溶液的制備:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20-40nm膠體金顆粒；
(4)該單抗標記的膠體金溶液的制備:取步驟(3)制備的4mL膠體金調至pH9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的單克隆抗體0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min后，10000r/min離心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩沖液4mL重懸兩次，最后用該硼酸鹽緩沖液0.4mL重懸，得到穩定的單克隆抗體-膠體金標記物；
(5)小鼠血清-膠體金標記物的制備:將步驟(4)中的受體替換為陰性小鼠的純化血清，重復步驟(4)，得到小鼠血清-膠體金標記物；
(6)硝酸纖維素膜的處理:將氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應墊的硝酸纖維素膜的檢測線T線和控制線C線，在37°C烘箱干燥；即得到包被后的硝酸纖維素膜；
(7)三合一試紙條的組裝:將樣品墊2、結合墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5由一端依次黏附在PVC背襯I上，即得到用于檢測的免疫層析試紙條。
[0018]應用實施例1
驗證本發明的可靠性試驗:(如圖2-圖4所示)
(I)用甲醇分別溶解甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考，分別得到濃度為lmg/mL的標準品母液，然后用0.01M、pH為7.4的磷酸鹽緩沖液分別進行梯度稀釋，作為樣品稀釋液。圖2中 l、0ppbTAP，2、0.5ppbTAP，3、lppbTAP，4、2.5ppbTAP ;圖 3 中為 l、0ppbFF，2、IppbFF，3、2.5ppbFF，4、5ppbFF ;圖 4 中為 l、OppbCAP，2、0.125ppbCAP，3、0.25ppbCAP，4、0.5ppbCAP，5、IppbCAP。
[0019](2)吸取待測樣品溶液中100 μ L滴加到試紙條的樣品墊上，滴加樣品后開始計時；
(3)在滴加樣品后3-5min讀取結果，讀取時，將試紙條以樣品墊一端向下的方式垂直于觀察者正面；
(4)結果判斷:如果在硝酸纖維素膜上僅有C線一條紅線顯現，表示檢測結果為陽性；如果在硝酸纖維素膜上C線和T線兩條紅線都顯現，表示檢測結果為陰性；如果在硝酸纖維素膜上C線紅線不顯現，則表明試紙條已失效。
[0020]應用實施例2
(I)將純牛奶與0.0lM PBS按1:9混合得到牛奶混合液。
[0021](2)檢測時取100 μ L上述稀釋液，滴加到試紙條的樣品墊上，加樣后開始計時。
[0022](3)在滴加樣品后3_5min讀取結果，讀取時，將試紙條以樣品墊一端向下的方式垂直于觀察者正面；
(4)結果判斷:如果在硝酸纖維素膜上僅有C線一條紅線顯現，表示檢測結果為陽性；如果在硝酸纖維素膜上C線和T線兩條紅線都顯現，表示檢測結果為陰性；如果在硝酸纖維素膜上C線紅線不顯現，則表明試紙條已失效。
[0023]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，其特征在于:包括聚氯乙烯PVC背襯(1)，聚氯乙烯PVC背襯(I)前端設置樣品墊(2)，樣品墊(2)通過結合墊(3)與硝酸纖維素膜(4)前端連接，硝酸纖維素膜(4)后端與吸水墊(5)連接； 所述結合墊(3)上含有膠體金標記的單克隆抗體；硝酸纖維素膜(4)上包被有氯霉素琥珀酸鈉-BSA檢測線T線(6)和羊抗鼠IgG控制線C線(7)； 氯霉素琥珀酸鈉-BSA是用于檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的抗原，檢測線與質控線平行。
2.權利要求1中所述的試紙條所用的膠體金標記能同時識別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的制備，其特征在于: 以甲砜霉素的類似物即1- (4-氨基苯基)-2- 二氯乙胺-1，3-丙二醇TAP-NH2作為半抗原，采用重氮化法將其與牛血清蛋白BSA偶聯得到免疫原，混合弗氏佐劑免疫BALB/c小鼠；取合格的免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞sp/20融合，經過三次亞克隆和間接競爭ELISA的篩選得到能穩定分泌可同時識別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的細胞株，將其進行擴大培養后，注射到小鼠體內誘發產生腹水；采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水即得到單克隆抗體。
3.權利要求1所述檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條的制備方法，其特征在于步驟為: (O同時識別甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的單克隆抗體的制備與純化:如權利要求2所述； (2)檢測抗原氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯物的制備:將氯霉素琥珀酸鈉與水溶性碳二亞胺EDC以摩爾比1: 3溶于0.lmol/L、pH 6.5的2-(N-嗎啡啉)MES緩沖溶液中，室溫活化6h，之后將活化物逐滴加入溶解了牛血清蛋白BSA的0.0lmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液PBS中，牛血清蛋白BSA和氯霉素琥珀酸鈉的摩爾比為1: 40，室溫反應12h，4°C透析3天，形成氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯物； (3)膠體金溶液的制備:用朽1檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20-40nm膠體金顆粒； (4)該單抗標記的膠體金溶液的制備:取步驟(3)制備的4mL膠體金調至pH9.0，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.lmg/mL的單克隆抗體0.4mL,放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min后，10000r/min離心50min,并用0.002mol/L、pH 9.0的硼酸鹽緩沖液4mL重懸兩次，最后用該硼酸鹽緩沖液0.4mL重懸，得到穩定的單克隆抗體-膠體金標記物； (5)小鼠血清-膠體金標記物的制備:將步驟(4)中的受體替換為陰性小鼠的純化血清，重復步驟(4)，得到小鼠血清-膠體金標記物； (6)硝酸纖維素膜的處理:將氯霉素琥珀酸鈉-BSA偶聯物和羊抗鼠IgG分別包被在作為反應墊的硝酸纖維素膜的檢測線T線和控制線C線，在37°C烘箱干燥；即得到包被后的硝酸纖維素膜； (7)三合一試紙條的組裝:將樣品墊(2)、結合墊(3)、硝酸纖維素膜(4)、吸水墊(5)由一端依次黏附在PVC背襯(I)上，即得到用于檢測的免疫層析試紙條。
4.根據權利要求1所述的檢測甲砜霉素、氯霉素及氟苯尼考的三合一膠體金免疫層析試紙條，其特征在于其對甲砜霉素、氟苯尼考及氯霉素的最低檢測限分別是lng/mL，2.5ng/



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【文檔編號】G01N33/577GK104237521SQ201410548219
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】匡華, 郭玲玲, 胥傳來, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強, 宋珊珊, 吳曉玲 申請人:江南大學