一種松蘿鳳梨細胞核懸液制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種松蘿鳳梨細胞核懸液制備方法。步驟如下：1）取松蘿鳳梨嫩葉50mg，置于塑料培養皿中加入1ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成：21g/L一水檸檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及體積濃度0.5%吐溫20）使用刀片在提取液中切碎松蘿鳳梨嫩葉，然后收集提取液經350目尼龍網過濾，獲得松蘿鳳梨細胞核懸液。本發明的有益效果：1）最大限度地減少了有害試劑的使用，如巰基乙醇，減輕了提取液對人體的危害；2）提取液成分簡單，只有三種，均為常規實驗室試劑，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；3）步驟簡單，無需離心，節省了時間提高了效率，可以在短時間內獲得高質量的細胞核懸液用于流式細胞儀檢測。
【專利說明】一種松蘿鳳梨細胞核懸液制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種適用于流式細胞儀分析的松蘿鳳梨細胞核懸液制備方法。
【背景技術】
[0002]松蘿鳳梨(TYJJaflWa usuneoides L.),是一種生長在空氣中、不需要土壤、生長所需的水分和營養可以全部來自空氣的特殊植物。松蘿鳳梨抗逆性強又可吸收有毒有害物質，已應用于環境指示、室內觀賞、裝飾，市場前景廣闊，發展潛力巨大。但由于松蘿鳳梨特殊的生長方式，相關分子生物學、細胞學及遺傳育種研究極少，新品種培育也因此受到限制。隨著研究深入，使用流式細胞儀進行植株倍性鑒定、基因組大小測定以及細胞周期等應用和基礎研究對拓寬松蘿鳳梨育種基礎具有重要意義。而其中獲得適用于流式細胞儀分析的松蘿鳳梨細胞核懸液成為其中關鍵技術。
[0003]松蘿鳳梨葉片含有較多次生代謝物質，采用已報道的方法難以獲得適用于流式細胞儀分析的松蘿鳳梨細胞核懸液，或相關方法繁瑣、含有對人體有害的試劑，這些都阻礙了相關研究的進行。為了對松蘿鳳梨更深入的研究，必須找到一種高效、快捷而又經濟的松蘿鳳梨細胞核懸液制備方法，這樣才能更有利于松蘿鳳梨相關研究的開展。
【發明內容】
[0004]本發明目的是提供一種適用于流式細胞儀分析的松蘿鳳梨細胞核懸液，該方法高效、快捷、經濟。
[0005]本發明采用的技術方案是:
一種松蘿鳳梨細胞核懸液制備方法，步驟如下:
1)取松蘿鳳梨嫩葉50mg，置于塑料培養皿中加入I ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成:21g/L —水檸檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及體積濃度0.5%吐溫20 ；
2)使用刀片在提取液中切碎松蘿鳳梨嫩葉，然后收集提取液經350目尼龍網過濾，獲得松蘿鳳梨細胞核懸液。
[0006]在步驟2)所述的松蘿鳳梨細胞核懸液中加入DNA突光染料碘化丙錠(propidiumiodide ,終濃度為50 μ g/ ml)，及Rnase (終濃度為50 μ g/ ml)，染色后的提取液用于流式細胞儀的檢測。
[0007]與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在于:
1)最大限度地減少了有害試劑的使用，如巰基乙醇，減輕了提取液對人體的危害；
2)提取液成分簡單，只有三種，均為常規實驗室試劑，成本低廉，配置容易，可大大降低成本；
3)步驟簡單，無需離心，節省了時間提高了效率，可以在短時間內獲得細胞核懸液用于流式細胞儀檢測；
4)可獲得較高質量細胞核懸液用于流式細胞儀檢測。【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1采用本發明制備的松蘿鳳梨細胞核懸液流式細胞儀分析直方圖；
圖2采用LBOl法制備的松蘿鳳梨細胞核懸液流式細胞儀分析直方圖。
【具體實施方式】
[0009]下面結合具體實施例對本發明進一步描述，但本發明的保護范圍不僅限于此: 實施例1
一、試劑的配置
O細胞核提取液配置:稱取2.1g—水檸檬酸、Ig聚乙烯吡咯烷酮K-30于一干凈的250ml燒杯中，加入體積0.5 ml吐溫20 ;加超純水定容到100ml。用0.22微米濾膜過濾后
4度保存備用。
[0010]2)突光染料配置:稱取25mg碘化丙錠、25mg核糖核酸酶于一干凈的250ml燒杯中加超純水定容到50ml。用0.22微米濾膜過濾后4度保存備用。
[0011]二、松蘿鳳梨細胞核懸液提取方法
(I)取松蘿鳳梨嫩葉(約50 mg)，置于塑料培養皿中加入I ml提取液。(2)使用鋒利剃須刀片在提取液中切碎葉片；(3)收集提取液經350目尼龍網過濾，獲得松蘿鳳梨細胞核懸液；(4)過濾后的提取液中加入DNA熒光染料碘化丙錠(終濃度為50 μ g/ ml)及Rnase(終濃度為SOyg/ ml)。染色后的提取液上流式細胞儀檢測。
[0012]松蘿鳳梨細胞核懸液的流式細胞儀檢測
采用Quanta SC流式細胞儀(美國貝克曼庫爾特公司),在488 nm激光的激發下發出桔紅色熒光，由FL2通道檢測出熒光強度。從隨機軟件CellLab Quanta SC獲取數據，并通過ModFit LT軟件顯示直方圖(橫坐標以DNA相對含量反映突光曲線的面積縱坐標為細胞核次數)，結果見圖1。本發明制備的松蘿鳳梨細胞核懸液不僅適用Quanta SC流式細胞儀，也適用于FACSCalibur (美國Becton-Dickinson公司)等目前市場是所有具有488nm激光器的流式細胞儀。
[0013]對比例1:采用已報道的 LBOl 法(Dolezel J, Binarova P, Lucretti S.Analysis of nuclear DNA content in plant cells by flow cytometry.BiologiaPlantarum 1989，31: 113 - 120)提取松蘿鳳梨細胞核懸液經流式細胞儀檢測的直方圖，結果見圖2。無明顯熒光峰，碎片較多，無法用于相關研究。
【權利要求】
1.一種松蘿鳳梨細胞核懸液制備方法，其特征在于，步驟如下: 1)取松蘿鳳梨嫩葉50mg，置于塑料培養皿中加入I ml提取液，所述提取液主要由終濃度如下的組分組成:21g/L —水檸檬酸，10g/L聚乙烯吡咯烷酮K-30，以及體積濃度0.5%吐溫20 ； 2)使用刀片在提取液中切碎松蘿鳳梨嫩葉，然后收集提取液經350目尼龍網過濾，獲得松蘿鳳梨細胞核懸液。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟2)所述的松蘿鳳梨細胞核懸液中加入DNA突光染料碘化丙錠(propidium iodide ,終濃度為50 μ g/ ml),及Rnase(終濃度為50 μ g/ ml),染色后的提取液用于流式細胞儀的檢測。
【文檔編號】G01N1/30GK103940656SQ201410115860
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】金亮, 郁永明, 李小白, 沈福泉, 俞信英, 沈曉嵐, 丁華僑, 王煒勇 申請人:浙江省農業科學院花卉研究開發中心
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
