熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法，屬于熒光標記生物檢測【技術領域】。解決了現有熒光標記生物量化檢測需要另設參考信號源且標準樣易變，導致量化精度低，易受環境影響且檢測成本高的技術問題。本發明的熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法是在多微孔板中摻雜稀土銩離子，并以稀土銩離子在685nm處的熒光發射光譜的熒光信號強度作為待測物的熒光信號強度的標準參考信號強度。本發明將多微孔板與儀器系統結合，無需另外設計標準信號參考源和相應的光路，簡化儀器結構，降低成本，使用摻雜的稀土銩離子的熒光信號強度為標準參考信號強度，提高了熒光生物標記多微孔板量化分析檢測的穩定性、精確度和準確性。
【專利說明】熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法，屬于熒光標記生物檢測【技術領域】。
【背景技術】
[0002]應用多微孔板(包括96孔板等)進行熒光標記生物分子的檢測是當前普遍應用的技術和方法之一，許多基于不同材質和不同規格的多微孔板已商品化多年，并被普遍應用。但是，基于各種熒光生物探針的生物分子的量化檢測和檢驗都需要采用已知量的標準樣品作為量化參考標準進行分析檢測，通過繪制標準曲線進行量化分析。但是，這些量化檢測用的標準樣品易受時間和環境影響，從而影響量化檢測和檢驗的穩定性、精度和準確性。除此之外，所有基于多微孔板的熒光生物標記量化檢測和檢驗的儀器設備均需要外設量化檢測標準信號參考源，這將增加生化分析儀器設計和結構的復雜性和成本。現有技術中，還沒有一種穩定性好、精度高、準確性好且成本低的熒光生物標記多微孔板量化檢測方法。
【發明內容】
[0003]本發明的目的在于解決現有熒光標記生物分子的量化檢測需要另設參考信號源且標準樣易變，導致量化精度低，易受環境影響且檢測成本高的技術問題，提供一種熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法。
[0004]本發明的熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法是在多微孔板中摻雜稀土銩離子，并以稀土銩離子在685nm處的熒光發射光譜的熒光信號強度作為待測物的熒光信號強度的標準參考信號強度。
[0005]進一步的，還包括，以稀土銩離子在685nm處的熒光信號強度與待測物的熒光信號強度之比/差為量化光學分析檢測值，通過繪制標準曲線，進而完成待測物的量化檢測。
[0006]進一步的，所述在多微孔板中摻雜稀土銩離子的方法是:在多微孔板的前驅材料中摻雜稀土銩離子后再制備多微孔板。
[0007]進一步的，所述多微孔板的前驅材料為高分子或玻璃。
[0008]進一步的，所述待測物為生化細菌戰劑分子、DNA分子或蛋白質分子。
[0009]本發明的有益效果:
[0010](I)本發明采用多微孔板中稀土銩離子的熒光信號強度作為待測物熒光信號強度的標準參考信號強度，將自參考多微孔板與儀器系統結合，無需另外設計標準信號參考源和相應的光路，簡化儀器結構，降低檢測成本，提高了熒光標記生物分子量化分析檢測的穩定性、精確度和準確性；
[0011](2)本發明的檢測方法適用于各種直徑和形狀的多微孔板，能夠應用在整個光譜范圍內，適合化學發光生物探針、酶標記生物探針、生物熒光標記生物探針、染料熒光標記生物探針和納米標記生物探針等方法的生物檢測與檢驗?！緦＠綀D】
【附圖說明】
[0012]圖1中，(a)為實施例1標記二抗體ant1-CA-153的QD65tl量子點的熒光發射光譜與多微孔板中稀土銩離子的熒光發射光譜，(b)為對比例I中標記二抗體ant1-CA-153的QD650量子點的熒光發射光譜；
[0013]圖2中，(a)為實施例1中(I685-1xVI685與待測物濃度的標準曲線；(b)為對比例I中的標準曲線。
【具體實施方式】
[0014]為了進一步了解本發明，下面結合【具體實施方式】對本發明的優選實施方案進行描述，但是應當理解，這些描述只是為進一步說明本發明的特征和優點而不是對本發明權利要求的限制。
[0015]本發明的熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法是在多微孔板中摻雜稀土銩離子，并以稀土銩離子在685nm處的熒光發射光譜的熒光信號強度作為待測物的熒光信號強度的標準參考信號強度，所述待測物的熒光信號強度通常采用熒光生物探針標記待測物的方式顯示，所以待測物的熒光信號強度也可以說是待測物熒光生物探針標記的熒光信號強度，該檢測方法通常包括以下步驟:
[0016](I)在多微孔板的前驅材料中摻雜稀土銩離子后，制備多微孔板，多微孔板的前驅材料為高分子或玻璃，多微孔板的制備與現有技術相同；
[0017](2)將待測物(如抗原)的配對分子(如抗體分子)植被于步驟(I)制備的多微孔板的表面；
[0018](3)再將含有待測物的緩沖液加入步驟(2)的多微孔板中，清洗；
[0019](4)將用熒光生物探針標記的能與待測物發生反應的另一生物分子(如二抗體分子)的緩沖液加入步驟(3)已結合待測物的多微孔板中，經反應后，清洗；
[0020](5)利用熒光分析系統進行熒光分析，獲得熒光發射光譜，熒光發射光譜顯示多微孔板中稀土銩離子在685nm處熒光信號強度和待測物熒光生物探針標記的熒光信號強度；
[0021](6)對稀土錢離子在685nm處的突光信號與待測物突光生物探針標記的突光信號的相對強度進行分析，進而完成待測物濃度的檢測；分析通常采用將稀土銩離子在685nm處的熒光信號強度與待測物熒光生物探針標記的熒光信號強度的比值或者差值作為量化光學分析檢測值，如以稀土錢離子在685nm處突光信號強度I685與突光生物標記的突光信號強度Ix的差值與I685的比值，即(I685-1xVI685，作為量化光學分析檢測值，并以此檢測值與待測物濃度X的函數關系繪制標準曲線，(I685-1x)/I685=a+bx，其中，a、b為常數，檢測時，再將檢測得到的(I685-1x)A685代入標準曲線，進而得到待測物濃度X。
[0022]本實施方式所指待測物適用于現有技術中所有以熒光標記多微孔板分析檢測的生物分子，常見的有生化細菌戰劑分子、DNA分子、蛋白質分子，分析時通常采用待測物的buffer緩沖液。
[0023]下面結合實施例及附圖進一步說明本發明。
[0024]實施例1
[0025]結合圖1和圖2說明實施例1
[0026](I)在玻璃中摻雜稀土銩離子后，制備6X6的多微孔板，將2組銩離子摻雜制備的多微孔板表面氨基功能化后，將體積為500 μ L，濃度為lmg/mL的抗原CA-153分子的buffer緩沖液中的抗原CA-153分子固定于第一組多微孔板表面，將體積為500 μ L，濃度為lmg/mL的抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液中的抗體ant1-CA-153分子固定于第二組多微孔板表面，備用；
[0027](2)向第I組多微孔板的2個孔中分別加入體積為500 μ L，濃度分別為20，IOOng/mL的已用QD65tl量子點(熒光發射峰在650nm處)標記的二抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液,經過I小時的免疫結合反應后，形成了抗原CA-153/ 二抗體ant1-CA-153分子+QD65tl量子熒光探針結構，對這兩個孔進行水沖清洗后，利用熒光分析系統進行熒光分析，檢測獲得兩個孔中稀土銩離子在685nm處的熒光信號強度I685和標記濃度分別為20，100ng/mL的標記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的熒光信號強度
1650/20 和 1650/100，
以稀土銩離子在685nm處的熒光信號強度I685與標記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的熒光信號強度工650/20 和 ^650/100 的差值分別與I685的比值，即(I685-165Q/2Q)/I685和(!685-^50/100)/^85為量化光學分析檢測值，并將這兩個值代入公式y=a+bx,確定y=a+bx公式中的a和b值，并得到標準線性公式y=0.01+0.5x,即(I685-1x)/I685=0.01+0.5x，其中Ix為標記待測物的熒光信號強度，X為待測物濃度；應用濃度分別為20和lOOng/mL的QD65tl量子點標記二抗體ant1-CA-153分子的檢測值代入公式并繪制標準曲線，得到如圖2(a)所示的標準曲線；
[0028](3)向第2組多微孔板的四個孔中分別加入體積為500 μ L，濃度分別為20、40、60、80ng/mL的抗原CA-153分子的buffer緩沖液，經I小時免疫結合反應后，進行水沖清洗，再向這四個孔中分別加入體積為500 μ L，濃度為300ng/mL的已用QD65tl量子點標記的二抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖·液,經過I小時免疫反應后,形成了抗體ant1-CA-153分子/抗原CA-153分子/ 二抗體ant1-CA-153分子+QD65tl量子熒光探針的三明治結構，水沖清洗第2組多微孔板，在與步驟(2)同樣條件下，利用熒光分析系統進行熒光分析，檢測四個孔中稀土銩離子在685nm處的熒光信號強度I685和標記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量
子點的突光信號強度650/40Λ 1650/60 ^ Ιθ50/80?
得到稀土銩離子在685nm處的熒光信號強度I685與標記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的熒光信號強度Ix的差值與I685的比值，分力|J 為(1685—1650/20)/工685、^685_Ιθ5θ/4θ) /?θ85Λ ^685_Ιθ5θ/6θ) /^685 矛口 (l685_l650/80)/工685， 將這四個值分別代入步驟(2)的標準線性公式，得到相應的濃度值，經計算，四個孔中抗原CA-153分子(即待測物)的濃度值分別接近20、40、60、80ng/mL，說明本發明能夠用于熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測；再將得到的(I685-1x)/I685與相應濃度20、40、60、80ng/mL分別作為縱橫坐標，在圖2(a)中標示出對應的點,如a、b、c、d所示,從圖2(a)可以看出，實施例1的標準曲線與檢測值的擬合值R=0.996，說明本發明的方法具有較高的準確度和精確度。
[0029]圖1中，(a)為實施例1標記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的突光發射光譜與多微孔板中稀土銩離子位于685nm處的熒光發射光譜，圖2中，(a)為實施例1中(I685-1x)/I685與待測物濃度的標準曲線。
[0030]對比例I
[0031 ] 結合圖1和圖2說明對比例I
[0032]應用醫學臨床常用免疫檢測方法:
[0033](I)將2組市售96孔多微孔板表面氨基功能化后，將體積為500 μ L，濃度為Img/mL的抗原CA-153分子的buffer緩沖液中的抗原CA-153分子固定于第一組市售96孔多微孔板表面，將體積為500 μ L,濃度為lmg/mL的抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液中的抗體ant1-CA-153分子固定于第二組市售96孔多微孔板表面,備用；
[0034](2)將體積為500 μ L，濃度分別為20，100ng/mL的QD65tl量子點標記的二抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液分別加入第一組96孔多微孔板的2個孔中，經過I小時的免疫結合反應后，采用熒光免疫分析儀對QD65tl量子點進行熒光檢測，分別檢測2個孔中濃度分別為20，100ng/mL的標記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的熒光信號強度值IeKi/2。和I6Ki/i(ici，并以這2個值代入標準線性公式y=a+bx,即可得到a=0.01和b=0.5,進而得到標準線性公式:y=0.01+0.5x，即Ix=0.01+0.5x，Ix為標記待測物的熒光信號強度，x為待測物濃度，并以濃度為20，100ng/mL的兩個檢測值分別代入公式繪制出以QD65tl量子點的熒光強度和標記二抗體ant1-CA-153分子濃度的函數曲線，作為標準曲線，如圖2(b)；
[0035](3)分別將體積為 500 μ L，濃度分別為 O、20、40、60、80、100ng/mL 的抗原 CA-153分子的buffer緩沖液分別加入第二組市售96孔多微孔板中的6個孔中進行免疫結合反應I小時，反應后，用水沖清洗；將體積為500 μ L,濃度為lmg/mL的QD65tl量子點標記的二抗體ant1-CA-153分子的buffer緩沖液分別加入上述6個孔中進行免疫結合反應后,反應后再次水沖清洗，在與步驟⑵同樣條件下，對獲得6個孔內的標記二抗體ant1-CA-153分子的QD650量子點進行突光分析，分別得到標記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的突光強度值，將這6個值分別代入步驟(2)獲得的標準線性公式，經計算得到相應的濃度值，結果與實際濃度值差異較大，并將這6個值結合相應濃度填充在標準曲線中，在圖2(b)上繪制其對應的點，％、，從圖2(b)可以看出，對比例I的標準曲線與檢測值的擬合值R=0.948，說明本發明的方法較現有技術的檢測方法準確度和精確度更高。
[0036]圖1中，(b)為對比例I中標記二抗體ant1-CA-153分子的QD65tl量子點的突光發射光譜，圖2中，(b)為對比例I中的標準曲線。
[0037]顯然，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于所述【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。
【權利要求】
1.熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，該檢測方法是在多微孔板中摻雜稀土銩離子，并以稀土銩離子在685nm處的熒光發射光譜的熒光信號強度作為待測物的熒光信號強度的標準參考信號強度。
2.根據權利要求1所述的熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，還包括，以稀土銩離子在685nm處的熒光信號強度與待測物的熒光信號強度之比/差作為量化光學分析檢測值，通過繪制標準曲線，進而完成待測物的量化檢測。
3.根據權利要求1或2所述的熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，所述在多微孔板中摻雜稀土銩離子的方法是:在多微孔板的前驅材料中摻雜稀土銩離子后再制備多微孔板。
4.根據權利要求3所述的熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，所述多微孔板的前驅材料為高分子或玻璃。
5.根據權利要求1或2所述的熒光生物標記多微孔板自參考量化檢測方法，其特征在于，所述待測物為生化細菌戰劑分子、DNA分子或蛋白質分子。
【文檔編號】G01N33/533GK103868897SQ201410036560
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年1月26日 優先權日:2014年1月26日
【發明者】孔祥貴, 張友林, 涂浪平, 劉曉敏, 常鈺磊, 趙慧穎 申請人:中國科學院長春光學精密機械與物理研究所
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
