專利名稱：一種能與核酸信標發生特異性作用的物質的檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種能與核酸信標發生特異性作用的物質的檢測方法，屬于分子信標檢測技術領域。
背景技術：
傳統的分子信標是在發夾結構信標分子兩端同時標記小分子，如德克薩斯紅(Texas Red)、突光素(Fluoresein)等作突光基團,4_(4’ - 二甲基氨基偶氮苯基)苯甲酸(DABCYL)等作猝滅基團。自由狀態時，這兩類分子靠近(約為疒10 nm)，發生熒光共振能量轉移，熒光基團發出的熒光被猝滅分子吸收。當檢測體系中加入與信標分子堿基相互作用的待測樣品(互補的單鏈DNA/RNA，與信標環適配體區域特異性作用的分子等)后，形成雜交體，信標莖桿互補區被拉開，熒光基團與猝滅基團的距離增大，熒光得到回升。通過檢測熒光信號的響應則可對待測樣品的含量進行測定。這類分子信標從操作難以程度上來說，可以克服生物分子檢測中異相分析手段(如酶聯免疫法、化學發光免疫、放射性免疫等)需要洗滌分離的缺點，但是在信標莖兩端分別標記兩種基團，一般費時費力，價格昂貴。就已有報道的單標記分子信標體系而言，具有石墨結構的碳材料，如石墨烯/氧化石墨烯、碳納米管、C60、C70等，由于其所富含的π電子，使之能與分子信標單鏈DNA上的堿基中芳環結構所賦予的η電子進行η — η堆積，以非共價鍵結合在一起，因此只需對信標一端進行熒光基團的單標記。但是上述碳材料都較難以制備，多需要購買特殊的制備原料或使用較為復雜的實驗條件，制備周期長，成本也不夠低；且制備過程或分散過程均要使用有機溶劑，這樣會大大降低材料的生物相容性。
發明內容
本發明所要解決的技術問題為克服現有技術的不足，提供一種能與核酸信標發生特異性作用的物質的檢測方法。本發明為解決上述技術問題提供的技術方案為:一種能與核酸信標發生特異性作用的物質的檢測方法，以碳納米顆粒為熒光受體，包括以下步驟:
一種能與核酸信標發生特異性作用的物質的檢測方法，以碳納米顆粒為熒光受體，其特征在于:包括以下步驟:
I)配制兩組體積相同濃度相同的一端標記過熒光基團的核酸信標的系列標準緩沖溶
液；
2)向第一組一端標記過熒光基團的核酸信標的系列標準緩沖溶液中加入體積不同濃度相同的碳納米顆粒溶液，得到體積不同的系列混合標準溶液；向每個混合標準溶液中補加緩沖溶液，使每個混合標準溶液的體積相同，孵育3(T60 min ;然后對每個混合標準溶液進行熒光檢測，得到熒光猝滅效率最大時所需的碳納米顆粒溶液的體積；
3)以第二組一端標記過熒光基團的核酸信標的系列標準緩沖溶液中的一個標準溶液作為空白溶液不加入待測樣品，其余的標準溶液分別加入相同濃度不同體積的待測樣品，得到體積不同的系列混合待測樣品標準溶液；然后向每個混合待測樣品標準溶液中補加緩沖溶液，使每個混合待測樣品標準溶液的體積相同，孵育2(T120 min ;向每個混合待測樣品標準溶液中加入與步驟2 )中熒光猝滅效率最大時相同體積的碳納米顆粒溶液，得到系列樣品標準溶液，孵育3(T60 min，測定每個樣品標準溶液的熒光強度，空白溶液的熒光強度為F0，對每個樣品標準溶液的熒光強度與空白溶液的熒光強度H)的比值和待測樣品的濃度進行標準曲線的繪制；
4)向未知濃度的待測樣品中加入與步驟3)中體積相同濃度相同的一端標記過熒光基團的核酸信標的系列標準緩沖溶液并補加緩沖溶液，得到混合待測樣品溶液，使該混合待測樣品溶液與步驟3)中每個混合待測樣品標準溶液的體積相同，孵育2(Tl20min ;加入與步驟3)中相同體積的碳納米顆粒溶液，孵育3(T60min后，測定溶液的熒光強度，計算其與步驟3)中空白溶液熒光強度H)的比值，通過標準曲線得到該待測樣品的濃度。所述碳納米顆粒包括十二燒基苯磺酸鈉穩定的碳納米顆粒或水溶性氧化碳納米顆粒；所述熒光基團包括有機染料或熒光納米顆粒。所述能夠與一端標記過熒光基團的核酸信標發生特異性相互作用的物質包括單鏈核酸或三磷酸腺苷。
本發明涉及到碳納米顆粒的制備方法，具體步驟如下:
(I)十二烷基苯磺酸鈉穩定的碳納米顆粒的制備:點燃日用照明蠟燭(普通蠟燭)，用潔凈玻璃片在蠟燭火焰外焰上來回移動， 收集黑色蠟燭灰8 mg，置于50 mL圓底燒瓶中，加入10 mL無水乙醇，10 mL超純水。將混合溶液放置在超聲儀中，功率360W，超聲2.5 h。所得的黑色溶液以3000 rpm離心2 min,上清液以6000 rpm離心6 min,得黑色沉淀。真空干燥后，稱取3 mg溶于30 mL 0.02% (wt)的十二燒基苯磺酸鈉水溶液中超聲分散備用。(2)水溶性氧化碳納米顆粒的制備:將按(I)中方法得到的8 mg新鮮蠟燭灰置于50 mL圓底燒瓶中，加入15 mL，6 mol/L的硝酸溶液，于115°C冷凝回流10 h。溶液冷卻至室溫后用碳酸鈉固體調節溶液pH至中性，于12000 rpm離心20 min，得到黑色沉淀用超純水洗滌三次。于真空干燥箱中干燥。使用前用超純水配成一定濃度的溶液，超聲分散備用。本發明方法構建了一個“熒光基團-信標鏈-碳納米顆粒”的生物分子檢測平臺，即將信標鏈一端標記上熒光供體材料(有機染料、熒光納米材料等)后，向體系中直接加入碳納米顆粒(十二燒基苯磺酸鈉穩定的碳納米顆粒、水溶性氧化碳納米顆粒等)，則在激發光的照射下，熒光團發出的熒光被碳納米顆粒吸收，熒光被猝滅。向體系中加入不同濃度的待測樣品，信標環與之發生堿基互補配對作用拉開熒光供體材料與碳納米顆粒的距離，熒光得以恢復；通過繪制標準曲線，得到待測樣品的濃度。
與現有技術相比，本發明所述的基于碳納米顆粒的納米信標檢測平臺有如下優點:
1.與傳統分子信標相比，此單標記體系的構建操作簡便，只需對信標鏈一端標記上熒光基團。2.與使用其他碳材料作熒光受體的體系相比，碳納米顆粒的制備簡化了受體材料的制備難度，無需購買昂貴的原料，材料的生物相容性得以提高，可高效、靈敏、迅速、低成本地對生物分子進行檢測。
圖1為實施例1中的熒光檢測情況，其中，圖1A為本實施例的信標鏈TAMRA-SSDNA和體系的熒光檢測情況；圖1B為本實施例的目標DNA和體系的熒光檢測情況。圖2為實施例2中熒光檢測情況，其中，圖2A為本實施例的信標鏈ssDNA和體系的熒光檢測情況；圖2B為本實施例的目標DNA和體系的熒光檢測情況。圖3為實施例3中的熒光檢測情況，其中，圖3A為本實施例的信標鏈ssDNA和體系的熒光檢測情況；圖3B為本實施例加入三磷酸腺苷的熒光檢測情況。圖4為實施例1和2中所使用的碳納米顆粒的表征數據圖，其中，4A為透射電鏡圖；4B為X射線粉末衍射圖；4C為Raman譜圖；4D為UV-Vis圖；4E為FT-1R圖。圖5為實施例3中所使用的氧化碳納米顆粒的表征數據圖，其中，5A為透射電鏡圖；5B為X射線粉末衍射圖；5C為Raman譜圖；為UV-Vis圖；5E為FT-1R圖。
具體實施例方式為了使本領域的技術人員更好地理解本發明的技術方案，下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳細說明。實施例1
取 3 μ M 四甲基羅丹明-單鏈 DNA (TAMRA-ssDNA) Tris-HCl (10 mM，pH 為 7.4，含0.15 M的NaCl,下同)溶液6 μ L,分別加入不同體積的0.1 mg/mL十二燒基苯磺酸鈉穩定的碳納米顆粒溶液(SDBS-CNPs))，補加Tris-HCl定容到600 μ L，使SDBS-CNPs濃度為0、0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055 mg/mL，37°C孵育 I h 后檢測下轉換熒光。配制一系列含不同濃度目標DNA的Tris-HCl溶液(0，0.5，I, 5，10，30，50 和 100 nM)，42°C孵育 2 h 后，加入 SDBS-CNPs 溶液使之濃度為 0.055 mg/mL。37°C孵育40 min,檢測下轉換突光，對目標DNA的濃度和樣品突光強度與不含目標DNA樣品的突光強度的比值作圖。對于未知濃度的樣品，向其中加入6 UL, 3 μ M TAMRA-ssDNA溶液，補加Tris-HCl定容至Ij 600 μ L，42°C孵育2 h后，加入SDBS-CNPs溶液，補加Tris-HCl定容至Ij600 μ L，使SDBS-CNPs濃度為0.055 mg/mL，37°C孵育40 min，測定溶液的熒光強度，計算其與不含目標DNA的樣品熒光強度H)的比值，在標準曲線上得到未知樣品中目標DNA的濃度。圖1A表明所選用的熒光受體碳納米顆粒可以有效猝滅有機染料TAMRA的熒光；圖1B表明基于本發明方法所構建的納米信標，能夠對一定濃度范圍內的單鏈目標DNA有所響應。IB中被指出的點為未知目標DNA濃度的樣品，從F/R)的值可得到目標DNA濃度為22nMo如圖1所示。實施例2
Cl)上轉換熒光納米顆粒(UCPs)的制備:取2 ml 0.25 mo I/L的稀土硝酸鹽溶液(其中稀土離子摩爾比為釔離子:鐿離子:鉺離子=80:18:2，向其中加入18 ml無水乙醇，再加入含900 mg聚丙烯酸的水溶液8 ml,攪拌10 min ;向上述混合溶液中加入含0.210 g氟化鈉的水溶液8 ml，繼續攪拌20 min后，置于高壓反應釜中，在攪拌條件下于200°C水熱反應10 h ;停止加熱并保持攪拌冷卻至室溫，離心分離出固體產物，用無水乙醇和超純水各洗3次，室溫下真空干燥12 h，得到表面帶有羧基的上轉換熒光納米顆粒。
(2) UCPs的表面標記:5 mg上步制得的上轉換納米顆粒溶于2 mL 10 mM，pH為
5.5的MES緩沖液，置于30°C，轉速為150 rpm恒溫振蕩器中依次滴加2 mM (含0.76 mg)EDC.HCl,5 mM (含 2.2 mg) SuIfo-NHS，孵育 2 h。反應后的溶液于 9000 rpm 離心 6 min,用高純水洗滌二次，加入溶含2.5 M信標DNA的2 mL 10 mM, pH為7.2的HEPES溶液，以同樣條件孵育4 h后,9000 rpm離心6 min,高純水洗漆三次,溶于Tris-HCl (10 mM,含0.15MNaCl，pH為7.4)緩沖中，，4°C保存備用。(3)將0.03 mg/mL標記后的信標DNA-上轉換熒光納米顆粒(信標DNA-UCPs)復合物與含不同濃度的 SDBS-CNPs (O, 0.01, 0.02, 0.03, 0.035, 0.04 和 0.05 mg/mL)Tris-HCl溶液600 yL，25°C孵育40 min，使用980 nm激發光檢測上轉換熒光。向含0.03mg/mL信標DNA-UCPs，0.045 mg/mL SDBS-CNPs的Tris-HCl溶液中加入不同濃度的目標DNA (O, 0.1, 0.5, I, 5，10, 30,和 50 nM)，42°C孵育 20 min，使用 980 nm激發光檢測上轉換熒光，計算加入了目標DNA的樣品熒光強度F與不含目標DNA的樣品熒光強度H)的比值，以目標DNA濃度對F/R)的比值作圖得到標準曲線。對于未知濃度的樣品，加入信標DNA-UCPs, SDBS-CNPs 的 Tris-HCl 溶液，補加 Tris-HCl 溶液至 600 μ L,使信標 DNA-UCPs、SDBS-CNPs濃度分別為0.03 mg/mL,0.045 mg/mL，42°C孵育20 min后，測定溶液的熒光強度，計算其與不含目標DNA的樣品熒光強度H)的比值，在標準曲線上得到未知樣品中目標DNA的濃度。圖2A表明所選用的熒光受體碳納米顆粒可以有效猝滅上轉換納米材料的熒光；圖2B表明基于本發明方法所構建的納米信標，能夠對一定濃度范圍內的單鏈目標DNA有所響應；2B中被圈出的點為未知濃度的目標DNA樣品，從F/R)的值可得到目標DNA濃度為17nMo如圖2所示。從實施例1和實施例2中的碳納米顆粒的表征數據可以看出:圖4A經測量統計，所使用的碳納米顆粒平均粒徑為42 nm ;圖4B、圖4C說明碳納米顆粒具有石墨碳的結構特征；圖4D表明碳納米顆粒具有很寬的吸收譜帶，可用于與許多熒光供體發生熒光共振能量轉移效應。如圖4所示。實施例3
取30 μ L 0.6 mg/mL標記過信標DNA的UCPs Tris-HCl溶液(UCPs的合成及標記方法與實施例2中的相同)，加入不同量的氧化碳納米顆粒(CNPs oxide)水溶液，定容到600 UL0 30°C孵育90 min后，使用980 nm激發光檢測上轉換熒光。向含0.03 mg/mL的信標DNA-UCPs、0.04 mg/mL CNPs oxide的Tris-HCl溶液中加入不同量的三磷酸腺苷(ΑΤΡ)，30°C孵育90 min后用980 nm激發光測量上轉換熒光，計算加入了 ATP的樣品熒光強度F與不含ATP的樣品熒光強度H)的比值，以ATP濃度對F/R)的比值作圖得到標準曲線。對于未知濃度的樣品，向其中加入信標DNA-UCPs溶液、CNPs oxide水溶液補加Tris-HCl定容到 600 μ L，使信標 DNA-UCPs、CNPs oxide 的濃度分別為 0.03 mg/mL,0.04 mg/mL, 30°C孵育90 min后用980 nm激發光測量上轉換熒光強度，計算其與不含ATP的樣品熒光強度FO的比值，在標準曲線上得到未知樣品中ATP的濃度。圖3A表明所選用的熒光受體氧化碳納米顆粒可以在一定程度上猝滅上轉換納米材料的熒光；圖3B表明基于本發明方法所構建的納米信標，能夠對一定濃度范圍內的ATP產生線性響應；3B中被圈出的點為未知濃度的ATP樣品，從F/R)的值可得到ATP濃度為140μ Mo如圖3所示。從實施例3中的碳納米顆粒的表征數據可以看出:圖5Α經測量統計，所使用的氧化碳納米顆粒平均粒徑為36 nm ;圖5B說明氧化碳納米顆粒具有很寬的吸收譜帶，可用于與許多熒光供體發生熒光共振能量轉移效應；圖5C、圖表明氧化碳納米顆粒也具有石墨碳的結構特征，并且較圖4B而言XRD譜圖的衍射峰向小角度的位移、較圖4C而言Raman譜圖上的ID/Ie值的減小都進一步說明了碳納米顆粒被部分氧化；圖5E中FT-1R譜圖與圖4E相比，1394 cm-1的吸收證明了經硝酸氧化后碳納米顆粒表面羧基的存在。
權利要求
1.一種能與核酸信標發生特異性作用的物質的檢測方法，以碳納米顆粒為熒光受體，其特征在于:包括以下步驟: I)配制兩組體積相同濃度相同的一端標記過熒光基團的核酸信標的系列標準緩沖溶液； 2)向第一組一端標記過熒光基團的核酸信標的系列標準緩沖溶液中加入體積不同濃度相同的碳納米顆粒溶液，得到體積不同的系列混合標準溶液；向每個混合標準溶液中補加緩沖溶液，使每個混合標準溶液的體積相同，孵育3(T60 min ;然后對每個混合標準溶液進行熒光檢測，得到熒光猝滅效率最大時所需的碳納米顆粒溶液的體積； 3)以第二組一端標記過熒光基團的核酸信標的系列標準緩沖溶液中的一個標準溶液作為空白溶液不加入待測樣品，其余的標準溶液分別加入相同濃度不同體積的待測樣品，得到體積不同的系列混合待測樣品標準溶液；然后向每個混合待測樣品標準溶液中補加緩沖溶液，使每個混合待測樣品標準溶液的體積相同，孵育2(T120 min ;向每個混合待測樣品標準溶液中加入與步驟2 )中熒光猝滅效率最大時相同體積的碳納米顆粒溶液，得到系列樣品標準溶液，孵育3(T60 min,測定每個樣品標準溶液的熒光強度，空白溶液的熒光強度為F0，對每個樣品標準溶液的熒光強度與空白溶液的熒光強度H)的比值和待測樣品的濃度進行標準曲線的繪制； 4)向未知濃度的待測樣品中加入與步驟3)中體積相同濃度相同的一端標記過熒光基團的核酸信標的系列標準緩沖溶液并補加緩沖溶液，得到混合待測樣品溶液，使該混合待測樣品溶液與步驟3)中每個混合待測樣品標準溶液的體積相同，孵育2(Tl20min ;加入與步驟3)中相同體積的碳納米顆粒溶液，孵育3(T60min后，測定溶液的熒光強度，計算其與步驟3)中空白溶液熒光強度H)的比值，通過標準曲線得到該待測樣品的濃度。
2.根據權利要求1中所述的一種能與核酸信標發生特異性作用的物質的檢測方法，其特征在于:所述碳納米顆粒包括十二烷基苯磺酸鈉穩定的碳納米顆粒或水溶性氧化碳納米顆粒；所述熒光基團包括有機染料或熒光納米顆粒。
3.根據權利要求1所述的一種能與核酸信標發生特異性作用的物質的檢測方法，其特征在于:所述能夠與一端標記過熒光基團的核酸信標發生特異性相互作用的物質包括單鏈核酸或三磷酸腺苷。
全文摘要
本發明公開了一種能與核酸信標發生特異性作用的物質的檢測方法，包括以下步驟向一定濃度的一端標記熒光基團的核酸信標溶液中加入不同濃度的碳納米顆粒溶液，孵育后，室溫下測定熒光強度，得到猝滅曲線;若干組含一定濃度一端標記過熒光基團的核酸信標溶液中，加入不同濃度的目標物，孵育后，加入一定體積的碳納米顆粒溶液，孵育后，室溫下測定熒光強度，作標準曲線，計算目標物的濃度。本方法操作簡便，原料易得，生物相容性好，可高效、靈敏、迅速、低成本地對生物分子進行檢測。
文檔編號G01N21/64GK103175819SQ201310129229
公開日2013年6月26日 申請日期2013年4月15日 優先權日2013年4月15日
發明者劉志洪, 曾令瑜, 袁云霞, 沈佩 申請人:武漢大學
專業數控銑床產品供應商
20年生產經驗，實力工廠，精工品質，質量有保障
